KR101315638B1 - 벼줄기세포 추출물을 함유하는 항노화용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 벼줄기세포 추출물(Rice stem cell extract)을 유효성분으로 함유하는 항노화용 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 벼줄기세포 추출물은 피부의 표피 및 진피 세포를 증식시키며, 콜라겐 합성 촉진으로 인해, 피부 탄력 및 주름 개선 효과가 우수하므로 피부노화방지를 위한 화장료 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

벼줄기세포 추출물을 함유하는 항노화용 화장료 조성물{A cosmetic composition comprising rice stem cell extract for an anti-aging activity}

본 발명은 항노화 활성을 갖는 벼줄기세포 추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 인체의 일차 방어막으로서 체내의 기관들을 온도·습도 변화, 자외선, 공해물질 등 외부환경의 자극으로부터 보호해 주며, 체온조절 등의 생체 항상성 유지에 중요한 역할을 한다. 피부는 최상부의 표피와 표피 아래층에 존재하는 진피로 구성되어 있으며, 표피는 각질형성세포가 대부분을 차지하는 중층 편평 상피로서 내측으로부터 기저층(basal layer), 유극층(spinous layer), 과립층(granular layer), 각질층(horny layer)순의 4개 층으로 구분된다. 즉, 각질형성세포가 기저층에서 분열한 후 피부의 표면으로 이동하면서 여러 단계로 분화함에 따라 형태가 변하게 된다.

이렇게 중요한 피부 역시 인체의 다른 장기와 마찬가지로 나이가 들어감에 따라 점차 노화가 진행되게 되고, 그 결과 여러 가지 변화가 일어난다. 기저막은 표피와 진피를 경계하는 구조물로써 나이가 들어감에 따라 두께가 얇아진다는 사실이 알려져 있으며(Vazquez F. et al. Changes of the basement membrane and type IV collagen in human skin during aging. Maturitas . 1996, 25(3):209-215), 그 결과로 외상에 취약해 진다.

또한 피부는 계속 분열하는 조직으로 약 3-4주를 한 주기로 반복 재생되는 것으로 알려져 있으며 나이가 들어감에 따라 피부재생능력이 감소한다는 사실은 매우 잘 알려져 있다. 따라서 끊임없는 세포분열을 통해 증식과 여러 가지 세포 활성화물질을 분비하여 주위 세포들을 활성화시킬 수 있는 줄기세포에 대한 관심이 증가하였다.

줄기세포(stem cells)란 특정한 세포로 분화가 진행되지 않은 채 유지되다가, 필요한 경우 조직 또는 기관을 구성하는 모든 종류의 세포로 분화할 능력을 가진 세포를 말한다. 이러한 줄기세포 고유의 특성을 자가재생력(self-renewal)과 다능성(pluripotency)이라 하며, 줄기능(stemness)이란 이러한 특성을 총칭하는 것이다.

최근에는 식물의 전형성능(totipotency)을 이용한 식물세포배양기술이 발전되면서 식물줄기세포로부터 유래되는 기능성 2차 대사산물(secondary metabolite)에 대한 관심이 증폭되고 있다. 이 2차 대사산물은 다양한 생리활성을 갖는 것으로 알려지고 있어 고기능성 화장품의 신원료로 식물 줄기세포 유래 추출물질들이 주목을 받고 있다. 이 기술을 이용하면 천연에 존재하나, 화학적 합성방법으로는 얻기 어려웠던 고기능성 활성물질을 경제적으로 생산할 수 있다는 점에서 지금까지 사용하지 못했던 새로운 성분들을 개발하고 응용할 수 있게 될 것으로 기대되고 있다.

특히 기능성 화장품에 대한 소비자들의 요구가 증대하는 것만큼 신 기능성 소재나 관련 기술의 발전이 충분하지 못했다는 점에서 무수히 많은 신 기능성 성분들을 만들어 낼 수 있는 식물줄기세포를 이용한 화장품은 다양한 피부 효능, 특히 항노화 효능 부분에서 큰 인기를 끌 것으로 예상된다.

피부에 있는 성체 줄기세포 중 대표적인 것인 표피 줄기세포는, 피부의 표피와 진피 경계 부위에 위치하고 있으며, 두 개로 분열하여 하나는 표피 줄기세포로 남아 있고, 다른 하나는 계속 분열하면서 밖으로 올라가 표피 세포로 분화된다.

내인성 노화와 광노화에 의해 표피와 진피의 경계부가 편평해지면서 그 면적이 줄어들면, 그에 따라 표피 줄기세포의 일정 부분의 소실이 관찰된다.

상기 소실된 부분을 중심으로 주름이 발생하는데, 이는 미용학적 측면에서는 문제가 될 수 있다. 상기 표피세포는 그 아래에 위치한 진피세포인 섬유아세포에도 영향을 주어 콜라겐 생성에 영향을 미치는데, 소실된 표피 줄기세포로 인하여 진피층의 교원섬유와 탄력섬유의 생산이 저해되는 것으로 알려져 있다.

콜라겐은 피부의 섬유아세포에서 생성되는 주요 기질 단백질로서 세포외 간질에 존재하고 생체 단백질 총중량의 30%를 차지하며 나선형 구조를 하고 있다.

주된 기능으로는 피부의 기계적 견고성, 결합조직의 저항력과 조직의 결합력, 세포접착의 지탱 등의 기능을 통해 피부에 탄력을 부여하는 주요 성분으로 알려져 있다. 그러나 이러한 콜라겐은 고령화 및 자외선 조사에 의한 광노화에 의하여 섬유아세포의 기능이 저하되어 그 생성량이 감소된다. 일반적으로 80세에서는 20세에 비하여 65% 정도가 감소하여 피부의 두께가 얇아지고, 이러한 현상은 피부의 주름형성에 밀접한 연관이 있다고 알려져 있다.

따라서 이러한 피부 노화 현상을 방지하고 보다 건강하고 탄력 있는 피부를 유지하기 위하여 주름 개선 효과가 있는 생리활성물질을 개발하고자 하는 노력이 꾸준히 있어 왔다. 대표적으로 1995년 광노화된 피부의 개선을 위한 치료제로 트레티노인(tretinoin, trans-retinoic acid)이 미국 FDA 허가를 받았으며, 이보다 부작용이 적은 레티놀이 1990년대 중·후반부터 화장품 원료에 사용되기 시작하면서 본격적으로 주름 개선 화장품이 출시되기 시작하였다. 그 이후로 여성 호르몬 유사 물질, 각종 식물에서 추출한 항산화제 등이 주름 개선 원료로서 화장품에 도입되었다. 그러나 이러한 화장품 원료들은 대부분 효능이 미진하거나 자극, 트러블 등 피부 부작용을 유발하는 등 여러 가지 문제점을 가지고 있다.

벼(Oryza sativa L.)는 일년생 초본으로, 벼의 종류는 많으나 쌀알의 점성에 따라 벼, 밭벼, 찰벼 등의 종류로 구별된다. 염색체 수는 n=12, 2n=24이고 AA게놈에 속한다. 식물분류학상 벼는 종자식물 중 배주(자방 속에 생긴 뒤에 씨가 되는 기관)가 자방에 둘러 싸여 있는 피자식물(被子植物)에 속한다. 또한 종자 내에 자엽이 하나인 단자엽식물(單子葉植物)에 속한다. 벼 뿌리는 종자근(種子根), 중배축근(中胚軸根) 및 관근(冠根)으로 구성되어 있으며 뿌리털을 통해 물과 양분을 흡수한다.

벼는 원줄기와 1차 분얼가지(식물의 땅 속에 있는 마디에서 가지가 나오는 일)에서 곁눈이 발달하여 분열을 한다. 그 줄기(稈)는 마디와 마디사이로 이루어진다. 잎은 잎몸과 잎집으로 나누어지고, 그 사이에 잎혀와 잎귀가 있다. 꽃에는 6개의 수술과 1개의 암술이 들어 있으며 제꽃가루받이를 한다.

벼에는 약 75%의 전분, 8% 전후의 회백질, 0.5~1%의 지방이 함유되어 있다. 이외에 소량의 비타민 B류를 함유하는데 비타민의 함량은 벼의 종류와 재배지에 따라서 다르다. 지방부분에는 에스테르 형 콜레스테롤과 유리 콜레스테롤, 브라시카스테롤(brassicasterol), 스티그마스테롤(stigmasterol), 시토스테롤(sitosterol), 모노글리세라이드(monoglyceride), 디글리세라이드(diglyceride), 트리글리세라이드(triglyceride), 인지질, 유리지방산이 함유되어 있다.

대한민국 특허공개공보 제2006-0065770호‘벼 추출물을 포함하는 약학 조성물’에는 벼 추출물이 엘라스타제(elastase)의 활성을 억제함으로서, 혈관의 탄력성을 유지, 혈액의 손실 방지, 혈류량 조절 및 혈관 압력을 조절하여 혈관 보호 및 혈액 순환 장애로 인한 질환을 위해 사용 할 수 있는 의약품에 대해 공고하고 있으나, 항노화 효과를 갖는 벼줄기세포 추출물을 함유한 화장료 조성물에 대한 내용은 그 어디에도 게재되거나 공지된 바 없다.

이에 본 발명자들은 피부주름 개선 효과 및 피부탄력 개선 효과에 도움이 되는 물질을 탐색하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 벼줄기세포 추출물이 피부자극을 유발하지 않으면서 피부주름개선 및 탄력개선에 효과를 발휘하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는, 주름 완화/개선효과 및 피부 탄력 개선 효과로 피부의 노화 방지효과가 뛰어난 식물줄기세포 추출물을 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 벼줄기세포 추출물(Rice stem cell extract)을 유효성분으로 포함하는 항노화용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 벼줄기세포는, 벼( Oryza sativa L.)의 식물조직, 바람직하게는 종자, 잎, 줄기 및 뿌리를 포함하여 이루어지는 군으로부터 선택된 조직으로부터, 보다 바람직하게는 종자로부터 유래한 미분화된 세포를 의미하고, 본 발명에서는 껍질 제거 후 표면 살균 및 세척된 종자를 발아시킨 배반(scutellum) 유래 캘러스를 획득하고, 상기 캘러스를 현탁배양배지 내에 접종/계대배양하여 유도된 미세 현탁세포로서 준비할 수 있다. 그러나, 본 발명은 이에만 한정되는 것은 아니고 당업자에게 공지된 식물조직배양방법을 응용하여 수득할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 벼줄기세포는 한국특허등록 제 0542605호 및 제 0897159호에 기재된 세포주 제조방법을 이하와 같이 변형하여 제조하였다:

1) 캘러스 확립

여기서, 상기 캘러스는 하기의 제조예와 같이 수득될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

벼(Oryza sativa L.) 종자의 껍질을 제거하고 함수에탄올과 NaOCl 용액을 이용하여 표면살균처리를 실시하고, 멸균증류수로 세척하여 캘러스 유도용 고체배지, 바람직하게는 Chu(N6) 한천배지에 치상한다. 20 내지 30℃, 바람직하게는 25℃에서 10 내지 20시간의 명조건 및 4시간 내지 14시간의 암조건; 바람직하게는 16시간의 명조건 및 8시간의 암조건에서 5 내지 20일간, 바람직하게는 7내지 14일간 배양한 후, 발아한 종자로부터 배반 유래 캘러스를 취하여 새로운 Chu(N6) 한천배지로 옮기고 직경 0.5 내지 2㎝, 바람직하게는 1㎝ 정도로 자랄 때까지 배양하여 벼 유래 캘러스를 획득할 수 있다. 본 발명에서 상기와 같이 준비한 벼 유래 캘러스는 한국생명공학연구원 미생물자원센터(Korean Colleciton for Type Culture, KCTC)에 2010년 9월 7일 기탁되어 기탁번호 KCTC 11760BP를 부여받았다.

2) 미세 현탁 배양에 의한 벼줄기세포 제조

상기 벼 유래 캘러스를 액체배양을 위한 미세 현탁 세포로 유도하는 공정을 이하에 설명하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

미세 현탁 세포 배양을 위한 배지로는 MS(Murashige & Skoog, 1962) 배지, Chu(N6)(Chu et al., 1975)배지, Amino Acid(Thompson, 1986)배지 등이 사용될 수 있고, 여기에 포함될 수 있는 식물생장조절물질로는 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid(2,4-D), kinetin, gibberellic acid(GA3) 등이 예시될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 30g/L 자당, 2mg/L 2,4-D, 0.2mg/L 키네틴(kinetin)을 함유하는 Chu(N6) 배지 또는 AA(amino acid) 배지를 사용할 수 있으며, 상기 배지에 캘러스를 접종하고 25 내지 30℃(바람직하게는 28℃) 90 내지 150rpm, (바람직하게는 110rpm), 암조건에서 진탕배양(shaking incubation)하면서 2주 간격으로 계대배양한다. 이때, 세포응집체(cell aggregate)로부터 분리된 미세 현탁 세포만을 선별하여 계대배양함이 바람직하다. 상기와 같이 계대하여 현탁배양한지 2~3개월 된 벼 현탁세포를, 수크로스 30g/L, 2,4-D 2.0mg/L, 키네틴 0.2mg/l 및 지베렐릭산 0.1mg/L를 포함하는 AA배지로 옮겨 계대배양한다. 안정화된 현탁세포는 배양시 2,4-D를 포함하지 않고 배양하여 식물호르몬의 잔류로 인한 독성발생 가능성을 제거할 수도 있다.

3) 대량배양

상기 안정화된 현탁세포는, stirred tank reactor, airlift reactor, fluidized reactor 등 당업자에게 알려진 공지의 식물세포배양을 위한 바이오리액터(bioreactor)라면 어느 것이라도 이용하여 대량배양할 수 있고, 본 발명에서는 디스크타입의 가스 스파저(gas sparger), 할로우-패들 임펠러(hollow-paddle impeller) 및 식물세포수집에 적합한 크기로 제작된 샘플링포트(sampling port)를 추가하여 식물세포배양에 적합하게 변형된 바이오리액터(bioreactor) 내에서 배양하지만 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 배양방법은 회분식, 연속식 또는 유가식 등 어느 방법으로도 가능하다.

배양 조건으로는, 배양 온도 25 내지 30℃(바람직하게는 28℃), 교반속도 50 내지 150rpm(바람직하게는 90 내지 110rpm), 배양기간동안 용존산소(dissolved oxygen, DO) 수준은 15% 이상(바람직하게는 20% 이상), 유지하기 위해 폭기율(aeration rate) 및 교반속도를 조절하여 제어함이 적절한 배양 환경 조성에 바람직하다.

바이오리액터 배양은 암조건과 형광등 조건을 번갈아가며 주며, 배양 5일 이후(바람직하게는 7~8일차)에 세포를 회수하는 것이 좋다. 여분의 배지 제거, 세척, 세척액을 완전히 제거하여 준비된 벼줄기세포는 바로 추출에 사용하거나, 추출시까지 냉동 또는 동결하여 보관할 수 있다.

본 발명의 벼줄기세포 추출물은 벼줄기세포 자체 또는 액체질소로 동결하여 분말화한 벼줄기세포에 물, 완충액, C1 내지 C4의 저급 알코올, 다가 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추출 용매, 바람직하게는 완충액(예를들어, 인산염완충액), 물, C1-C4 저급 무수알콜 또는 이들의 함수알콜, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 및 부틸렌글리콜 중에서 선택된 하나 이상의 추출용매를 처리하여, 이를 열추출, 환류냉각추출, 교반추출, 초음파추출, 고온고압추출법 등의 추출방법에 가하여 추출하고 여과하여 여액 상태로서 수득할 수 있다.

본 발명의 벼줄기세포 추출물은 벼줄기세포를 인산염완충액, 물, 에탄올 또는 이들의 혼합물 중에서 선택된 추출용매로 추출한 후 동결건조하여 분말화한 것이 바람직하며, 상기 추출은 교반추출법, 초음파추출법, 열추출법 및 고온고압추출법 중에서 선택된 방법에 의한 것이 바람직하다.

그러나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니며, 그 일례로서 하기와 같은 제조 공정을 들 수 있다:

i) 상기 벼줄기세포를 동결시켜, 바람직하게는 LN₂로 동결하여 약 1℃ 내지 10℃(바람직하게는 약 4℃)의 온도에서 마쇄한 후 물, 완충액, C1 내지 C4의 저급 알코올, 다가 알코올, 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추출 용매[바람직하게는 인산염완충액(phosphate buffered saline, PBS)] 내에서 약 60분 내지 360분(바람직하게는 120분 내지 180분)동안 교반하여 추출하는 공정; 또는

ii) 상기 벼줄기세포를 물, 완충액, C1 내지 C4의 저급 알코올, 다가 알코올, 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추출 용매, 바람직하게는 물 또는 함수에탄올에 부유시켜 약 4℃ 내지 30℃(바람직하게는 20℃ 내지 25℃)의 온도에서 약 60분 내지 360분( 바람직하게는 120분 내지 180분)동안 또는 약 100℃ 내지 130℃,(바람직하게는 121℃ 내지 125℃)의 온도 및 약 1.0MPa 내지 2.0MPa( 바람직하게는 1.2 MPa 내지 1.5MPa)의 압력을 약 20분 내지 30분 동안 가하여 파쇄하여 약 30분 내지 120분(바람직하게는 60분 내지 90분)동안 교반하여 추출하는 공정.

상기 여액을 얻는 방법에 있어서는 여과 후, 필요에 따라 농축 과정을 더 수행할 수도 있다.

본 발명은 상기의 제조 공정으로 얻어진 벼줄기세포 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물 중 상기 추출물은, 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 10 중량%로 함유되는 것이 바람직하다. 상기 추출물이 0.001중량% 미만이면 유용성분 부족에 의해 콜라겐 합성에 의한 탄력개선 및 주름방지효과가 미약하며, 10중량%를 초과하는 경우에는 화장료 제형이 불안정해지거나 사용자의 피부에 자극을 발생시킬 소지가 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 피부의 표피 및 진피 세포의 증식, 표피 줄기세포의 증식과 colony forming effect, 및 콜라겐 합성 증진 효과를 통한 피부 탄력 개선 및 주름 방지 효과를 나타내어 노화방지용 화장료 조성물로 유용하게 이용될 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 조성물에서 항노화는 Collagen type Ⅰ의 합성 촉진에 기초한 주름개선 및 피부탄력 개선 효과에 의한 것이거나, 표피줄기세포(WPE-stem cell) 증식에 기초한 주름개선 및 피부 탄력 개선(리프팅) 효과에 의한 것이다.

본 발명의 조성물은 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 성분 중 1개 이상을 포함할 수 있다.

수용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 피리독신, 염산피리독신, 비타민 B12, 판토텐산, 니코틴산, 니코틴산아미드, 엽산, 비타민 C, 비타민 H 등을 들 수 있으며, 그들의 염 (티아민염산염, 아스코르빈산나트륨염 등)이나 유도체 (아스코르빈산-2-인산나트륨염, 아스코르빈산-2-인산마그네슘염 등)도 본 발명에서 사용할 수 있는 수용성 비타민에 포함된다. 수용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 수득할 수 있다.

유용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 A, 카로틴, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E (d1-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤, d-델타 토코페롤) 등을 들 수 있으며, 그들의 유도체 (팔미틴산아스코르빈, 스테아르산아스코르빈, 디팔미틴산아스코르빈, 아세트산dl-알파 토코페롤, 니코틴산dl-알파 토코페롤비타민 E, DL-판토테닐알코올, D-판토테닐알코올, 판토테닐에틸에테르 등) 등도 본 발명에서 사용되는 유용성 비타민에 포함된다. 유용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 취득할 수 있다.

고분자 펩티드로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 콜라겐, 가수 분해 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 가수 분해 엘라스틴, 케라틴 등을 들 수 있다. 고분자 펩티드는 미생물의 배양액으로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 정제 취득할 수 있으며, 또는 통상 돼지나 소 등의 진피, 누에의 견섬유 등의 천연물로부터 정제하여 사용할 수 있다.

고분자 다당으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 히드록시에틸셀룰로오스, 크산탄검, 히알루론산나트륨, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 (나트륨염 등) 등을 들 수 있다. 예를 들어, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 등은 통상 포유동물이나 어류로부터 정제하여 사용할 수 있다.

스핑고 지질로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 세라마이드, 피토스핑고신, 스핑고당지질 등을 들 수 있다. 스핑고 지질은 통상 포유류, 어류, 패류, 효모 또는 식물 등으로부터 통상의 방법에 의해 정제하거나 화학 합성법에 의해 취득할 수 있다.

해초 엑기스로는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 갈조 엑기스, 홍조 엑기스, 녹조 엑기스 등을 들 수 있으며, 또, 이들의 해초 엑기스로부터 정제된 칼라기난, 아르긴산, 아르긴산나트륨, 아르긴산칼륨 등도 본 발명에서 사용되는 해초 엑기스에 포함된다. 해초 엑기스는 해초로부터 통상의 방법에 의해 정제하여 취득할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 상기 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 성분과 배합될 수 있다.

이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알코올, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

유지 성분으로서는 에스테르계 유지, 탄화수소계 유지, 실리콘계 유지, 불소계 유지, 동물 유지, 식물 유지 등을 들 수 있다.

에스테르계 유지로서는 트리2-에틸헥산산글리세릴, 2-에틸헥산산세틸, 미리스틴산이소프로필, 미리스틴산부틸, 팔미틴산이소프로필, 스테아르산에틸, 팔미틴산옥틸, 이소스테아르산이소세틸, 스테아르산부틸, 리놀레산에틸, 리놀레산이소프로필, 올레인산에틸, 미리스틴산이소세틸, 미리스틴산이소스테아릴, 팔미틴산이소스테아릴, 미리스틴산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 세바신산디에틸, 아디핀산디이소프로필, 네오펜탄산이소알킬, 트리(카프릴, 카프린산)글리세릴, 트리2-에틸헥산산트리메틸롤프로판, 트리이소스테아르산트리메틸롤프로판, 테트라2-에틸헥산산펜타엘리슬리톨, 카프릴산세틸, 라우린산데실, 라우린산헥실, 미리스틴산데실, 미리스틴산미리스틸, 미리스틴산세틸, 스테아르산스테아릴, 올레인산데실, 리시노올레인산세틸, 라우린산이소스테아릴, 미리스틴산이소트리데실, 팔미틴산이소세틸, 스테아르산옥틸, 스테아르산이소세틸, 올레인산이소데실, 올레인산옥틸도데실, 리놀레산옥틸도데실, 이소스테아르산이소프로필, 2-에틸헥산산세토스테아릴, 2-에틸헥산산스테아릴, 이소스테아르산헥실, 디옥탄산에틸렌글리콜, 디올레인산에틸렌글리콜, 디카프린산프로필렌글리콜, 디(카프릴,카프린산)프로필렌글리콜, 디카프릴산프로필렌글리콜, 디카프린산네오펜틸글리콜, 디옥탄산네오펜틸글리콜, 트리카프릴산글리세릴, 트리운데실산글리세릴, 트리이소팔미틴산글리세릴, 트리이소스테아르산글리세릴, 네오펜탄산옥틸도데실, 옥탄산이소스테아릴, 이소노난산옥틸, 네오데칸산헥실데실, 네오데칸산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 이소스테아르산이소스테아릴, 이소스테아르산옥틸데실, 폴리글리세린올레인산에스테르, 폴리글리세린이소스테아르산에스테르, 시트르산트리이소세틸, 시트르산트리이소알킬, 시트르산트리이소옥틸, 락트산라우릴, 락트산미리스틸, 락트산세틸, 락트산옥틸데실, 시트르산트리에틸, 시트르산아세틸트리에틸, 시트르산아세틸트리부틸, 시트르산트리옥틸, 말산디이소스테아릴, 히드록시스테아르산 2-에틸헥실, 숙신산디2-에틸헥실, 아디핀산디이소부틸, 세바신산디이소프로필, 세바신산디옥틸, 스테아르산콜레스테릴, 이소스테아르산콜레스테릴, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 올레인산콜레스테릴, 올레인산디히드로콜레스테릴, 이소스테아르산피트스테릴, 올레인산피트스테릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소세틸, 12-스테알로일히드록시스테아르산스테아릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소스테아릴 등의 에스테르계 등을 들 수 있다.

탄화 수소계 유지로서는 스쿠알렌, 유동 파라핀, 알파-올레핀올리고머, 이소파라핀, 세레신, 파라핀, 유동 이소파라핀, 폴리부덴, 마이크로크리스탈린왁스, 와셀린 등의 탄화 수소계 유지 등을 들 수 있다.

실리콘계 유지로서는 폴리메틸실리콘, 메틸페닐실리콘, 메틸시클로폴리실록산, 옥타메틸폴리실록산, 데카메틸폴리실록산, 도데카메틸시클로실록산, 디메틸실록산ㆍ메틸세틸옥시실록산 공중합체, 디메틸실록산ㆍ메틸스테알록시실록산 공중합체, 알킬 변성 실리콘유, 아미노 변성 실리콘유 등을 들 수 있다.

불소계 유지로서는 퍼플루오로폴리에테르 등을 들 수 있다.

동물 또는 식물 유지로서는 아보카도유, 아르몬드유, 올리브유, 참깨유, 쌀겨유, 새플라워유, 대두유, 옥수수유, 유채유, 행인(杏仁)유, 팜핵유, 팜유, 피마자유, 해바라기유, 포도종자유, 면실유, 야자유, 쿠쿠이너트유, 소맥배아유, 쌀 배아유, 시아버터, 월견초유, 마커데이미아너트유, 메도홈유, 난황유, 우지(牛脂), 마유, 밍크유, 오렌지라피유, 호호바유, 캔데리러왁스, 카르나바왁스, 액상 라놀린, 경화피마자유 등의 동물 또는 식물 유지를 들 수 있다.

보습제로서는 수용성 저분자 보습제, 지용성 분자 보습제, 수용성 고분자, 지용성 고분자 등을 들 수 있다.

수용성 저분자 보습제로서는 세린, 글루타민, 솔비톨, 만니톨, 피롤리돈-카르복실산나트륨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜B (중합도 n=2 이상), 폴리프로필렌글리콜 (중합도 n=2 이상), 폴리글리세린B (중합도 n=2 이상), 락트산, 락트산염 등을 들 수 있다.

지용성 저분자 보습제로서는 콜레스테롤, 콜레스테롤에스테르 등을 들 수 있다.

수용성 고분자로서는 카르복시비닐폴리머, 폴리아스파라긴산염, 트라가칸트, 크산탄검, 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 수용성 키틴, 키토산, 덱스트린 등을 들 수 있다.

지용성 고분자로서는 폴리비닐피롤리돈ㆍ에이코센 공중합체, 폴리비닐피롤리돈ㆍ헥사데센 공중합체, 니트로셀룰로오스, 덱스트린지방산에스테르, 고분자 실리콘 등을 들 수 있다.

에몰리엔트제로서는 장쇄아실글루타민산콜레스테릴에스테르, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 12-히드록시스테아르산, 스테아르산, 로진산, 라놀린지방산콜레스테릴에스테르 등을 들 수 있다.

계면 활성제로서는 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제, 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

비이온성 계면 활성제로서는 자기 유화형 모노스테아르산글리세린, 프로필렌글리콜지방산에스테르, 글리세린지방산에스테르, 폴리글리세린지방산에스테르, 솔비탄지방산에스테르, POE (폴리옥시에틸렌)솔비탄지방산에스테르, POE 솔비트지방산에스테르, POE 글리세린지방산에스테르, POE 알킬에테르, POE 지방산에스테르, POE 경화피마자유, POE 피마자유, POEㆍPOP (폴리옥시에틸렌ㆍ폴리옥시프로필렌) 공중합체, POEㆍPOP 알킬에테르, 폴리에테르변성실리콘, 라우린산알카놀아미드, 알킬아민옥시드, 수소첨가대두인지질 등을 들 수 있다.

음이온성 계면 활성제로서는 지방산비누, 알파-아실술폰산염, 알킬술폰산염, 알킬알릴술폰산염, 알킬나프탈렌술폰산염, 알킬황산염, POE 알킬에테르황산염, 알킬아미드황산염, 알킬인산염, POE 알킬인삼염, 알킬아미드인산염, 알킬로일알킬타우린염, N-아실아미노산염, POE 알킬에테르카르복실산염, 알킬술포숙신산염, 알킬술포아세트산나트륨, 아실화 가수분해 콜라겐펩티드염, 퍼플루오로알킬인산에스테르 등을 들 수 있다.

양이온성 계면 활성제로서는 염화알킬트리메틸암모늄, 염화스테아릴트리메틸암모늄, 브롬화스테아릴트리메틸암모늄, 염화세토스테아릴트리메틸암모늄, 염화디스테아릴디메틸암모늄, 염화스테아릴디메틸벤질암모늄, 브롬화베헤닐트리메틸암모늄, 염화벤잘코늄, 스테아르산디에틸아미노에틸아미드, 스테아르산디메틸아미노프로필아미드, 라놀린 유도체 제 4급 암모늄염 등을 들 수 있다.

양성 계면 활성제로서는 카르복시베타인형, 아미드베타인형, 술포베타인형, 히드록시술포베타인형, 아미드술포베타인형, 포스포베타인형, 아미노카르복실산염형, 이미다졸린 유도체형, 아미드아민형 등의 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

유기 및 무기 안료로서는 규산, 무수규산, 규산마그네슘, 탤크, 세리사이트, 마이카, 카올린, 벵갈라, 클레이, 벤토나이트, 티탄피막운모, 옥시염화비스무트, 산화지르코늄, 산화마그네슘, 산화아연, 산화티탄, 산화알루미늄, 황산칼슘, 황산바륨, 황산마그네슘, 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 산화철, 군청, 산화크롬, 수산화크롬, 칼라민 및 이들의 복합체등의 무기 안료 ; 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 비닐수지, 요소수지, 페놀수지, 불소수지, 규소수지, 아크릴수지, 멜라민수지, 에폭시수지, 폴리카보네이트수지, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 실크파우더, 셀룰로오스, CI 피그먼트옐로우, CI 피그먼트오렌지 등의 유기 안료 및 이들의 무기 안료와 유기 안료의 복합 안료 등을 들 수 있다.

유기 분체로서는 스테아르산칼슘 등의 금속비누; 세틸린산아연나트륨, 라우릴린산아연, 라우릴린산칼슘 등의 알킬인산금속염 ; N-라우로일-베타-알라닌칼슘, N-라우로일-베타-알라닌아연, N-라우로일글리신칼슘 등의 아실아미노산 다가금속염 ; N-라우로일-타우린칼슘, N-팔미토일-타우린칼슘 등의 아미드술폰산 다가금속염 ; N-엡실론-라우로일-L-리진, N-엡실론-팔미토일리진, N-알파-파리토일올니틴, N-알파-라우로일아르기닌, N-알파-경화우지지방산아실아르기닌 등의 N-아실염기성아미노산 ; N-라우로일글리실글리신 등의 N-아실폴리펩티드 ; 알파-아미노카프릴산, 알파-아미노라우린산 등의 알파-아미노지방산 ; 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 사불화에틸렌 등을 들 수 있다.

자외선 흡수제로서는 파라아미노벤조산, 파라아미노벤조산에틸, 파라아미노벤조산아밀, 파라아미노벤조산옥틸, 살리실산에틸렌글리콜, 살리신산페닐, 살리신산옥틸, 살리신산벤질, 살리신산부틸페닐, 살리신산호모멘틸, 계피산벤질, 파라메톡시계피산-2-에톡시에틸, 파라메톡시계피산옥틸, 디파라메톡시계피산모노-2-에틸헥산글리세릴, 파라메톡시계피산이소프로필, 디이소프로필ㆍ디이소프로필계피산에스테르 혼합물, 우로카닌산, 우로카닌산에틸, 히드록시메톡시벤조페논, 히드록시메톡시벤조페논술폰산 및 그 염, 디히드록시메톡시벤조페논, 디히드록시메톡시벤조페논디술폰산나트륨, 디히드록시벤조페논, 테트라히드록시벤조페논, 4-tert-부틸-4'-메톡시디벤조일메탄, 2,4,6-트리아닐리노-p-(카르보-2'-에틸헥실-1'-옥시)-1,3,5-트리아진, 2-(2-히드록시-5-메틸페닐)벤조트리아졸 등을 들 수 있다.

살균제로서는 히노키티올, 트리클로산, 트리클로로히드록시디페닐에테르, 크로르헥시딘글루콘산염, 페녹시에탄올, 레조르신, 이소프로필메틸페놀, 아줄렌, 살리칠산, 진크필리티온, 염화벤잘코늄, 감광소 301호, 모노니트로과이어콜나트륨, 운데시렌산 등을 들 수 있다.

산화 방지제로서는 부틸히드록시아니솔, 갈릭산프로필, 엘리소르빈산 등을 들 수 있다.

pH 조정제로서는 시트르산, 시트르산나트륨, 말산, 말산나트륨, 프말산, 프말산나트륨, 숙신산, 숙신산나트륨, 수산화나트륨, 인산일수소나트륨 등을 들 수 있다.

알코올로서는 세틸알코올 등의 고급 알코올을 들 수 있다.

또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하지만, 조성물 총중량에 대하여 바람직하게는 0.01-50중량%, 보다 바람직하게는 5-20중량%로 배합된다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 상기 화합물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 추가로 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 본 발명의 화장료 조성물은 업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 페이스트, 크림, 겔, 파우더, 스프레이, 용액, 유탁액, 현탁액 등이 있다. 구체적으로, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저에서 선택된 제형인 것일 수 있다.

이들 제형의 제조방법은 통상의 화장료 제형의 제조방법에 따라 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 벼 줄기세포 추출물은, 피부의 표피 및 진피 세포를 증식시키고 콜라겐의 합성을 촉진시켜 피부의 기계적 견고성 및 결합조직의 저항력과 조직의 결합력을 증가시켜 피부의 주름 개선 및 탄력을 증진시키는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 벼줄기세포 추출물의 HPLC 결과 그래프로서, 위쪽은 190~400nm 범위에서의 HPLC 핑거프린트를 나타내고, 아래쪽은 254nm에서의 HPLC 핑거프린트를 나타낸다.
도2는 본 발명의 벼줄기세포 추출물의 인간 표피 줄기세포(WPE-stem cell, keratinocyte progenitor cell, ATCC CRL-2887)의 colony forming assay 실험 결과 사진으로, 도 2A는 40배 비율로 찍은 현미경 사진이고, 도 2B는 0.2% 크리스탈 바이올렛으로 염색한 플레이트를 찍은 사진이다.

이하, 본 발명을 다음의 참조예, 실시예, 제형예 및 시험예를 들어 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 다음의 참조예, 제형예, 실시예 및 시험예에 대한 설명은 본 발명을 예시하여 설명하고자 하는 것일 뿐이며, 본 발명의 권리범위를 이들에 기재된 내용으로 한정하거나 제한 해석하고자 의도하는 것은 아니다.

[ 참조예 1] 벼줄기세포의 준비

벼 유래 캘러스(기탁번호: KCTC 11760BP)를 미세 현탁세포 배양을 위한 배지인 30g/L 자당, 2mg/L 2,4-D, 0.2mg/L 키네틴(kinetin)을 함유하는 AA(amino acid) 배지에 접종하고 28℃, 110rpm, 암조건에서 진탕배양하면서 2주 간격으로 계대배양하였다. 이때, 세포응집체(cell aggregate)로부터 분리된 미세 현탁 세포만을 선별하여 계대배양하였다. 상기와 같이 계대하여 현탁배양한지 3개월 된 벼 현탁세포를, 수크로스 30g/L, 2,4-D 2.0mg/L, 키네틴 0.2mg/l 및 지베렐릭산 0.1mg/L를 포함하는 AA배지로 옮겨 계대배양하였다. 식물호르몬의 잔류로 인한 독성발생 가능성을 제거하기 위해, 직경이 약 1mm 이하로 안정화된 미세 현탁세포는 배양시 2,4-D를 포함하지 않고 배양하였다.

상기 안정화된 현탁세포는, 디스크타입의 가스 스파저(gas sparger), 할로우-패들 임펠러(hollow-paddle impeller) 및 식물세포수집에 적합한 크기로 제작된 샘플링포트(sampling port)를 추가하여 식물세포배양에 적합하게 변형된 7L용량 바이오리액터(Applikon, 네덜란드)내에서 회분식으로 배양하였다. 배양부피(working volume)는 3.2L로 하였으며, 최초 교반 속도(initial agitation rate) 및 폭기율(aeration rate)은 각각 80rpm 및 0.2vvm이었다. AA배지(2.3L)는 121℃의 바이오리액터 내에서 25분간 오토클레이브(autoclaving)하여 멸균한 후, 0.22-㎛ 필터(Millipore, 미국)로 제균필터한 300ml의 10배농축(10x) 아미노산 용액을 상기 AA배지에 주입하였다. 그 후, 플라스크 배양된 세포를 상기 바이오리액터에 10% FCWV(fresh cell weight volume)로 접종하였다. 이때, 접종 용기(inoculation bottle)와 바이오리액터 용기(bioreactor vessel) 사이의 튜빙(tubing)을 멸균상태로 연결시키도록 튜브용접기(tube welder, Wave Biotech, 스위스)를 이용하였다.

배양 조건으로, 배양 온도는 28℃, 90-110rpm이었으며, 배양기간동안 용존산소(dissolved oxygen, DO) 수준을 20% 이상 유지하기 위해 폭기율 및 교반속도를 조절하여 제어하였다. 공기(air)와 산소(oxygen)를 혼합하여 넣어주었으며, 폭기율은 공기는 0.5L/min, 산소는 0.1ml/min 및 100ml/min의 사이에서 간헐적으로 들어가도록 조절하였다.

바이오리액터 배양은 암조건과 형광등 조건을 번갈아가며 주었으며, 배양 7일차에 세포를 회수하였다. 상기 회수한 세포는 PBS로 다시 현탁시켜 2~3회 세척하여 여분의 배지를 제거하였다. 마지막 세척 후 필터링하여 세척액을 완전히 제거하였다. 이렇게 준비된 벼줄기세포는 바로 추출에 사용하거나, 추출시까지 냉동 또는 동결하여 보관하였다.

[ 참조예 2] 인간 피부 세포의 준비

2-1. 인간 섬유아세포의 준비

인간 섬유아세포 (fibroblast cell, ATCC 2076)는 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)을 첨가한 Iscove's modified Dulbeco's medium (IMDM) 배지에 세포수가 5×10⁵ cells/dish가 되도록 하여 배양하였다. 배양용기는 100mm cell culture dish를 사용하였으며 10-12 ㎖의 배지로 37℃, 포화습도로 유지되는 5% CO₂ 배양기에서 단층 배양하였다. 배지는 일주일에 두 번씩 갈아주고, confluency에 도달한 세포는 0.25% trypsin-EDTA를 사용하여 trypsinization한 후 계대 배양하여 유지하였다.

2-2. 인간 표피세포의 준비

인간 표피세포 (HaCaT cell, 동국대 생명공학과로부터 분양)는 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin을 첨가한 DMEM (Dulbacco's Modified Eagle's Medium, GIBCO) 배지를 사용하는 것을 제외하고는 상기 참조예 2-1과 동일한 조건 하에서 계대 배양하여 유지하였다.

2-3. 인간 표피 줄기세포의 준비

인간 표피 줄기세포(WPE-stem cell, keratinocyte progenitor cell, ATCC CRL-2887)는 0.05 ㎎/㎖ BPE (bovine pituitary extract)와 5 ng/㎖ EGF (epidermal growth factor)가 첨가된 Keratinocyte Serum Free Medium (K-SFM) 배지에 세포수가 1ⅹ10⁵ - 1.5ⅹ10⁵ cells/㎠가 되도록 하여 배양하였다. 배양 용기는 2.5 ㎍/㎠　Mouse Collagen Type Ⅳ과 2.5 ㎍/㎠ Human Fibronectin mixture로 pre-coating된 75T flask를 사용하며 15-20 ㎖의 배지로 37℃, 포화습도로 유지되는 5% CO₂ 배양기에서 단층 배양하였다. 배지는 일주일에 두 번씩 갈아주고, confluency에 도달한 세포는 1:1 비율로 D-PBS로 희석된 0.05% Trypsin-EDTA를 사용하여 trypsinization한 후, 0.1% Trypsin inhibitor를 사용하여 Trypsin-EDTA를 불활성화시켜 계대 배양하여 유지하였다.

[ 실시예 1] 벼줄기세포 추출물의 제조

제1법- 상기 참조예 1에서 준비한 벼줄기세포 60g를 액체질소로 동결하여 막자사발에서 마쇄한 후 인산염완충액(phosphate buffered saline, PBS) 300ml 내에서 교반기(magnetic stirrer, Corning, 미국)상에서 실온에서 교반하여 24시간 동안 추출한 후, 상기 준비된 추출물을 와트만페이퍼로 여과하여 세포 부유물을 제거하고 여액을 수득하고, 상기 여액을 모두 동결건조하여 용기에 담아 사용 전까지 실온 보관하였다.

제2법- 상기 참조예 1에서 준비한 벼줄기세포 60g을 액체질소로 동결하여 막자사발에 마쇄한 후 물 300ml에 부유시킨 후 sonicator(Sonic & Materials사, 모델 Vibra Cell)로 10초간 처리한 후 실온에서 24시간 동안 교반하여 추출한 후, 상기 준비된 추출물을 와트만페이퍼로 여과하여 세포 부유물을 제거하고 여액을 수득하고, 상기 여액을 모두 동결건조하여 용기에 담아 사용 전까지 실온 보관하였다.

제3법- 상기 참조예 1에서 준비한 벼줄기세포 60g을 액체질소로 동결하여 막자사발에 마쇄한 후 물 300ml에 부유시킨 후 sonicator(Sonic & Materials사, 모델 Vibra Cell)로 10초간 처리한 후 37℃에서 24시간 동안 교반하여 추출한 후, 상기 준비된 추출물을 와트만페이퍼로 여과하여 세포 부유물을 제거하고 여액을 수득하고, 상기 여액을 모두 동결건조하여 용기에 담아 사용 전까지 실온 보관하였다.

제4법- 상기 참조예 1에서 준비한 벼줄기세포 60g을 액체질소로 동결하여 4℃의 온도에서 막자사발에 마쇄한 후 80(v/v)% 함수에탄올 300ml에 부유시켜 sonicator로 10초간 처리한 후 실온에서 24시간 동안 교반하여 추출한 후, 상기 준비된 추출물을 와트만페이퍼로 여과하여 세포 부유물을 제거하고 여액을 수득하고, 상기 여액을 모두 동결건조하여 용기에 담아 사용 전까지 실온 보관하였다.

제5법- 상기 참조예 1에서 준비한 벼줄기세포 60g을 물 300ml에 부유시킨 후 125℃에서 30분간 1.5MPa의 압력에서 추출한 후, 추출물을 와트만페이퍼로 여과하여 세포 부유물을 제거하고 여액을 수득하고, 상기 여액을 모두 동결건조하여 용기에 담아 사용 전까지 실온 보관하였다.

[ 실시예 2] 벼줄기 세포 추출물의 HPLC 핑거프린트 확인

제조된 벼 줄기세포 추출물 내에 함유되어 있는 성분들의 피크를 기록하여 주요 피크들의 상대적인 비율을 확인함으로서 벼줄기 세포 추출물을 일관성 있게 제조하기 위한 방법으로서 벼줄기 세포 추출물의 HPLC 핑거프린트를 확인하였다.

실시예1의 제5법에 의해 제조한 벼줄기세포 추출물 8.8mg을 취하여 50ml 볼륨메트릭플라스크에 넣고 50%(v/v) MeCN(아세토나이트릴) 수용액 40mL를 넣어 용해시킨 후 50%(v/v) MeCN을 부어 정확하게 50ml표선까지 맞춰 제조한 용액을 0.45㎛로 여과한 시험액을 하기 조건으로 분석하여 HPLC 핑거프린트를 확인하였으며 그 결과를 도 1에 나타내었다.

- 이동상: H₂OㆍMeCN (30:70(v/v))

- 흐름속도(flow rate): 1.0 ml/min

- 칼럼: Kromasil 100-5NH2. 250 * 4.6 mm (Akzo Nobel)

- 파장: 254nm

- 온도: 30℃

- 주입부피: 20㎕

- 사용기기: HPLC(LC-10AT, SHIMADZU),

Photodiode detector(SPD-M10A,SHIMADZU),

Injector(SPD-M10AVP,SHIMADZU),

Pump(LC-10AT,SHIMADZU),

Controller(SPD-10AVA,SHIMADZU),

Software(SHIMADZU CLASS-VP)

[ 제형예 1] 실시예 1의 추출물을 포함하는 유연 화장수( 스킨 )의 제조

하기 표 1에 나타낸 조성비로, 실시예 1의 벼줄기세포 추출물을 포함하는 유연 화장수(스킨)를 1kg 제조하였다.

[표 1]

〈제조방법〉

상기 [표 1]의 성분 11에 성분 2, 3, 4 및 8을 순서대로 투입하고 교반하여 실온에서 용해시킨 후 성분 5를 60℃ 정도에서 가열하여 용해시킨 후 성분 10을 투입 교반하였다. 마지막으로 성분 1, 6, 7 및 9를 투입하여 충분히 교반한 뒤 마이크로플루다이져를 통과시킨 후 숙성시켜 본 발명의 유연 화장수(스킨)를 제조하였다.

[ 비교제형예 1]

성분 1을 제외하고 상기 제형예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.

[ 제형예 2] 실시예 1의 추출물을 포함하는 영양화장수(로션)의 제조

하기 표 2에 나타낸 조성비로, 실시예 1의 벼줄기세포 추출물을 포함하는 영양화장수(로션)를 1kg 제조하였다.

[표 2]

〈제조방법〉

[표 2]의 성분 2, 3, 4 및 5을 실온에서 균질화하여 비이온계 양친매성 지질을 제조하였다. 상기 비이온계 양친매성 지질과 성분 1, 6, 7 및 13을 혼합하고 실온에서 균질화하여 마이크로플루다이져를 통과하고 이어 성분 8을 실온에서 서서히 첨가하여 균질화한 후 다시 마이크로플루다이져에 재차 통과시켰다. 그리고 성분 9, 10, 11 및 12를 투입하고 분산시켜 안정화하고 숙성시켜 영양화장수(로션)를 제조하였다.

[ 비교제형예 2]

성분 1을 제외하고 상기 제형예 2와 동일한 방법으로 제조하였다.

[ 제형예 3] 실시예 1의 추출물을 포함하는 영양크림의 제조

하기 표 3에 나타낸 조성비로, 실시예 1의 벼줄기세포 추출물을 포함하는 영양크림 1kg 을 제조하였다.

[표 3]

〈제조방법〉

[표 3]의 성분 2, 3, 4 및 5를 실온에서 균질화하여 비이온계 양친매성 지질을 제조하였다. 상기 비이온계 양친매성 지질과 성분 1, 6, 7 및 13을 혼합하고 실온에서 균질화하여 마이크로플루다이져를 통과시키고 이어 성분 8을 실온에서 서서히 첨가하여 균질화시킨 후 다시 마이크로플루다이져에 재차 통과시켰다. 그리고 성분 9, 10, 11 및 12를 투입하여 분산시켜 안정화하고 숙성시켜 영양크림을 제조하였다.

[ 비교제형예 3]

성분 1을 제외하고 상기 제형예 3과 동일한 방법으로 제조하였다.

[ 시험예 ] 용어 정리

이하, 시험예 1 내지 5에서 언급된 “실시예 1의 벼줄기세포추출물”은 특별한 수식어가 없는 이상,“실시예 1의 제5법에 의해 제조된 벼줄기세포 추출물”을 의미한다.

[ 시험예 １] 벼줄기세포 추출물의 세포독성 확인

벼줄기세포의 세포독성은 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide]의 대사 환원에 근거한 MTT 분석법에 의해 측정하였다. 살아있는 세포는 미토콘드리아에 존재하는 탈수소 효소에 의해 MTT가 MTT-formazan 결정으로 전환되므로 이것의 양을 재면 살아있는 세포 생존율을 측정할 수 있다 (참고문헌: The EMBO Journal(2002) 21, pp2407-2417 외 다수).

1-1. 인간 섬유아세포에 대한 세포 독성 측정

참조예 2-1에서 준비한 인간 섬유아세포를 24-multiwell plate에 5×10⁴ cells/well 농도로 분주하고 10% FBS가 첨가된 IMDM 배지에 접종하여 24시간 배양하였다. 이렇게 배양된 세포의 배지를 serum-free 배지로 교체하고 실시예 1의 벼줄기세포 추출물을 물에 녹여 농도별 처리하여 24시간동안 배양하였다. 대조군에는 동량의 물을 처리하여 동일하게 배양하였다. 상기 배양이 끝난 세포에 MTT 용액 (2.5 ㎎/㎖) 100 ㎕를 첨가하여 37℃에서 4시간 반응시켰다. 배양 상등액을 제거하고 각각의 웰에 dimethyl sulfoxide (DMSO) 500 ㎕를 첨가하여 생성된 MTT-formazan 결정체를 용해시킨 후 ELISA reader로 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존율(cell viability)은 하기 [수학식 1]에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여 흡광도의 백분율로 나타내었으며, 그 결과는 [표 4]에 나타내었다.

[수학식 1]

[표 4]

상기 [표 4]에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 벼줄기세포 추출물은 100 ㎍/㎖의 농도까지 인간 섬유아세포에 대해 세포 독성을 거의 나타내지 않음을 알 수 있었다.

1-2.인간 표피세포에 대한 세포 독성측정

참조예 2-2에서 준비한 인간 표피세포를 48-multiwell plate에 2×10⁵ cells/well 농도로 분주하고 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지에 접종하여 24시간 배양한 것을 제외하고는 상기 시험예 1-1과 동일하게 시험하였으며, 상기 세포생존율 또한 상기 [수학식 1]에 나타낸 바와 같이 계산하여 그 결과를 [표 5]에 나타내었다. 상기 [표 5]에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 벼줄기세포 추출물은 100 ㎍/㎖의 농도까지 인간 표피세포에 대해 세포 독성을 거의 나타내지 않음을 알 수 있었다.

[표 5]

상기 [표 5]에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 벼줄기세포 추출물은 100 ㎍/㎖의 농도까지 인간 표피세포에 대해 세포 독성을 거의 나타내지 않음을 알 수 있었다.

1-3. 인간 표피 줄기세포에 대한 세포독성 측정

참조예 2-3에서 준비한 WPE-Stem cell을, 2.5 ㎍/㎠ Mouse Collagen Type Ⅳ과 2.5 ㎍/㎠ Human Fibronectin mixture로 pre-coating된 96-multiwell plate에 2×10⁴ cells/well 농도로 분주하고 0.05 ㎎/㎖ BPE와 5 ng/㎖ EGF가 첨가된 K-SFM 배지에서 24시간 배양하였다. 이렇게 배양된 세포의 배지를 새 배지로 교체하고 실시예 1의 벼줄기세포 추출물을 물에 녹여 농도별 처리하여 24시간 배양하였다. 대조군에는 동량의 물을 처리하여 배양하였다. 상기 배양이 끝난 세포에 MTT 용액 (2.5 ㎎/㎖) 0.01 ㎖를 첨가하여 37℃에서 4시간 반응시켰다. 배양 상등액을 제거하고 각각의 웰에 DMSO 100 ㎕를 첨가하여 생성된 MTT- formazan 결정체를 용해시킨 후 ELISA reader로 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존율은 상기 [수학식 1]로 계산하였으며, 그 결과를 [표 6]에 나타내었다.

[표 6]

상기 [표 6]에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 벼줄기세포 추출물은 100 ㎍/㎖의 농도까지 인간 표피 줄기세포에 대해 세포 독성을 거의 나타내지 않음을 알 수 있었다.

[ 시험예 2] 벼줄기세포 추출물의 피부세포 증식효과 확인

벼줄기세포 추출물의 피부세포 증식효과 또한 MTT 분석법에 의해 측정하였다.

2-1. 인간 섬유아세포의 증식 효과 측정

참조예 2-1에서 준비한 인간 섬유아세포를 12-multiwell plate에 5×10⁴ cells/well 농도로 분주하고 10% FBS가 첨가된 IMDM 배지에서 24시간 배양하였다.

이렇게 배양된 세포의 배지를 serum-free 배지로 교체하고 실시예 1의 벼줄기세포 추출물을 물에 녹여 농도별 처리하여 72시간 배양하였다. 대조군에는 동량의 물을 처리하여 72시간 동일하게 배양하였다. 상기 배양이 끝난 세포에 MTT 용액 (2.5 ㎎/㎖) 100 ㎕를 첨가하여 37℃에서 4시간 반응시켰다. 배양 상등액을 제거하고 각각의 웰에 DMSO 500 ㎕를 첨가하여 생성된 MTT-formazan 결정체를 용해시킨 후 ELISA reader로 570㎚에서 흡광도를 측정하였다. 세포증식율(%)은 하기 [수학식 2]에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여 흡광도의 백분율로 나타내었으며, 그 결과를 [표 7]에 나타내었다.

[수학식 2]

[표 7]

상기 [표 7]에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 벼 줄기 세포 추출물은 농도의존적으로 섬유아세포 증식에 더욱 효과가 있음을 알 수 있었으며, 특히 250 ㎍/㎖의 농도에서는 대조군 대비 15%의 증식 효과를 나타냄을 확인하였다.

2-2. 인간 표피세포의 증식 효과 측정

참조예 2-2에서 준비한 인간 표피세포를 사용하는 것을 제외하고는 상기 시험예 2-1과 동일하게 시험하였으며, 상기 세포증식율 또한 상기 [수학식 2]에 나타낸 바와 같이 계산하여 그 결과를 [표 8]에 나타내었다.

[표 8]

상기 [표 8]에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 벼 줄기 세포 추출물은 1㎍/㎖ 이상의 처리농도에서 대조군 대비하여 표피세포 증식에 효과가 있음을 알 수 있었다.

2-3. 인간 표피 줄기세포에 대한 증식 효과 측정

2-3-1. MTT assay

참조예 2-3에서 준비한 WPE-Stem cell을, 2.5 ㎍/㎠ Mouse Collagen Type Ⅳ과 2.5 ㎍/㎠ Human Fibronectin mixture로 pre-coating된 96-multiwell plate에 1×10⁴ cells/well 농도로 분주하고 0.05 ㎎/㎖ BPE와 5 ng/㎖ EGF가 첨가된 K-SFM 배지에서 24시간 배양하였다. 이렇게 배양된 세포의 배지를 새 배지로 교체하고 실시예 1의 벼줄기세포 추출물을 물에 녹여 농도별 처리하여 72시간 배양하였다. 대조군에는 동량의 물을 처리하여 72시간 배양하였다. 상기 배양이 끝난 세포에 MTT 용액 (2.5 ㎎/㎖) 0.02 ㎖를 첨가하여 37℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 배양 상등액을 제거하고 각각의 웰에 DMSO 100 ㎕를 첨가하여 생성된 MTT-formazan 결정체를 용해시킨 후 ELISA reader로 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 세포 증식율은 상기 [수학식 2]에 나타낸 바와 같이 계산하여 그 결과를 [표 9]에 나타내었다.

[표 9]

상기 [표 9]에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 벼줄기세포 추출물은 농도 의존적으로 세포증식효과가 증가하다가 30 ㎍/㎖의 처리농도에서 대조군 대비 약 37%의 유의한 증식효과를 보였다. 또한, 100 ㎍/㎖의 처리농도까지 20% 이상의 세포 증식 효과를 나타내었으며, 대조군 대비하여 표피줄기세포 증식에 효과가 있음을 알 수 있었다.

2-3-2. Colony forming assay

줄기세포는 인 비트로( in vitro ) 배양시 콜로니를 형성하는 특징을 갖는다.

상기 콜로니는 줄기세포(stem cell), 일시적 증가 세포(transient amplifying cell) 및 분화세포(differentiated cell)로 구성된다. 여기서 형성된 콜로니의 수는 줄기세포 밀도 값으로 볼 수 있는데, 이는 분화세포는 분할능을 잃고, 빠르게 분할하는 일시적 증가 세포는 콜로니를 형성할만큼 증식하지 않기 때문이다. 상기 형성된 콜로니의 수는 콜로니형성율(colony forming efficiency, CFE)로 불린다.

참조예 2-3에서 준비한 WPE-Stem cell을, 100mm cell culture dish에 1×10⁴ cells/dish 농도로 분주하고 0.05 ㎎/㎖ BPE와 5 ng/㎖ EGF가 첨가된 K-SFM 배지에서 24시간 배양하였다. 이렇게 배양된 세포의 배지를 새 배지로 교체하고 실시예 1의 벼줄기세포 추출물을 물에 녹여 농도별 처리하여 11일간 배양하였다. 대조군에는 동량의 물을 처리하여 배양하였다. 배양 완료 후, 배지를 제거하고, 0.2% Crystal violet 용액을 1 ㎖ 첨가하여 상온에서 10분간 염색시켰으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 동일 면적 당 콜로니의 개체수 및 콜로니 내의 세포수가 본 발명의 벼줄기세포 추출물 처리시 현저하게 증가하였다.

또한, 상기 염색 후, 세포 수가 50개 이상이 되는 colony의 수를 계수(counting)하여 하기 [수학식 3]과 같이 콜로니형성율(colony-forming efficiency, %CFE)을 계산하였으며, 그 결과를 [표 10]에 나타내었다.

[수학식 3]

콜로니형성율(% CFE)

= (number of colonies formed at the end of growth period / number of cells inoculated at start of growth period) X100 (%)

[표 10]

상기 [표 10]에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 벼줄기세포 추출물은 전 시험농도에서 약 30~50%의 콜로니 형성 증가율을 나타내었다. 또한, 도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 벼줄기세포 추출물의 처리가 세포의 증식 및 그에 따른 콜로니 형성 촉진 효과를 가짐을 알 수 있었다.

이는 본 발명의 벼줄기세포 추출물이 표피줄기세포의 증식을 촉진시킬 뿐 아니라, 상기 증식된 세포가 줄기세포의 특성(stemness)을 유지한다는 것을 나타내는 것이다.

[ 시험예 3] 벼줄기세포 추출물의 Collagen Type I 발현 촉진 효과 확인

참조예 2-1에서 준비한 인간 섬유아세포를, 10% FBS가 첨가된 IMDM 배지가 담긴 60mm culture dish (NUNC, USA)에 1×10⁶의 밀도로 접종하였다. 24시간 배양 후 세포를 HBSS(Hank's balanced salt solution)로 세척하고 FBS가 첨가되지 않은 DMEM 배지로 교체하였다. 24시간 배양 후 다시 HBSS로 세척하고 FBS가 첨가되지 않은 IMDM 배지로 교체하면서 실시예 1의 벼줄기세포 추출물을 물에 녹여 농도별로 처리하고 37℃, 5% CO₂ 배양기 (REVCO, USA)에서 24시간 배양하였다. 음성대조군은 동량의 물을 처리하여 배양하였으며, 양성대조군은 콜라겐 형성을 활성화시키는 것으로 기공지된 Vit C를 처리하여 배양하였다(상기 Vit C는 콜라겐 형성을 활성화시키지만 화장료 제형에서 불안정한 것으로 알려져 있다).

상기 배양 세포의 RNA를 수집하기 위해, 상기 배양 세포를 TRLZOL (Invitrogen, USA) 1 ㎖로 모아 1.5 ㎖ tube에 옮기고, Chloroform (Sigma, USA) 200 ㎕를 첨가하여 vortex하고 상온에 5분 방치하였다. 이후 원심분리(15,000 rpm, 4℃, 30분)하여 상층액을 새로운 tube로 옮기고 동량의 2-propanol과 섞어 상온에서 5분 방치하였다. 이를 원심분리(12,000 rpm, 4℃, 20분)한 후 2-propanol은을 버리고 75%(v/v) 함수에탄올 1 ㎖를 첨가하여 원심분리(10,000 rpm, 4℃, 10분)하고 75%(v/v) 함수에탄올은 버리고 RNA 펠렛(pellet)은 상온에서 말려 남아있는 에탄올을 제거하였다. 상기 펠렛에 DEPC(diethyl pyrocarbonate)가 처리된 정제수 40 ㎕를 넣어 녹인 후 260 nm에서 정량하였다.

RT-PCR은 1㎍의 total RNA, RexGene Biotech사(Korea)의 All-in-one RT-PCR kit를 사용하였으며, PCR에 사용된 Collagen Type I와 Actin 프라이머(primer)는 Bioneer사 (Korea)에서 합성하여 사용하였으며, 상기 프라이머의 sequence및 역전사 조건은 하기 [표 11a] 및 [표 11b]에 기재하였다. RT-PCR product는 2% agarose gel에 전기 영동하여 image analysis system (BIO-RAD, USA)을 이용하여 정량하였으며, 그 결과는 하기 [표 12]에 나타내었다.

[표 11a]

[표 11b]

[표 12]

상기 [표 12]에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 벼줄기세포 추출물은 1, 10, 25, 50 ㎍/㎖의 농도로 처리하였을 때, 시료를 처리하지 않은 대조군에 비해 Collagen Type I의 발현량을 294.39, 417.20, 371.93, 288.07% 증가시시키는 효과가 있음을 알 수 있었다. 또한, 본 발명의 벼줄기세포 추출물은 양성대조군인 Vit C의 처리군에 비해서도 Collagen Type I의 발현을 촉진시키고 있는 것으로 나타났다. 이와 같이, 본 발명의 벼줄기세포 추출물이 콜라겐 합성에 의해 주름개선, 탄력개선 효과에 이바지할 수 있음을 확인하였다.

[ 시험예 4] 인체 첩포시험( Patch test )

상기 실시예 1에서 준비된 벼줄기세포 추출물을 포함하는 화장료 조성물에 대하여 피부 자극 정도를 알아보기 위하여, 인체 첩포시험을 실시하였다.

피검자는 20-50세의 시험 부위에 피부 질환이 없는 여자로 선정하였으며 총 15명에게 실시하였다. 첩포 부위인 상박부를 70(v/v)% 함수에탄올로 닦아내고 건조시킨 후, 핀챔버(fin chamber)를 사용하여 제형예 1의 유연화장수, 제형예 2의 영양 로션, 제형예 3의 영양 크림을 각각 0.02g씩 가하여 시험부위에 부착시켰다.

24시간 후에 챔버 제거 후 1시간 이내에 피부반응을 평가하고, 다음날(48시간 후) 다시 피부반응을 평가하였다. 피부 반응 판정은 하기 [표 13]의 평가기준에 의해 판정하고, 피부 자극 유발 가능성의 평가는 하기 [수학식 4]에 따라 계산된 평균반응률을 계산하여 수행하였으며, 그 결과를 [표 14]에 나타내었다.

[수학식 4]

평균반응률(%) = [Σ(24시간 후 반응 피검자수 × 점수) + Σ(48시간 후 반응 피검자수 × 점수)] × 100 / (총 검사횟수 × 최대점수 × 전체피검자수)

[표 13]

[표 14]

상기 [표 14]에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 벼줄기세포 추출물을 함유하는 화장료 조성물은 피부자극을 유발하지 않았으며, 이로서 본 발명의 벼줄기세포 추출물의 안전성을 확인할 수 있었다.

[ 시험예 5] 벼줄기세포 추출물의 피부 주름 및 탄력 개선효과 평가

본 발명의 제형예 3과 비교제형예 3의 영양크림의 피부도포에 따른 피부 주름 및 탄력 개선효과를 확인하기 위하여 다음과 같은 시험을 수행하였다.

피검자는 20-55세의 여성 60명을 대상으로 하였으며, 피부 상태를 기준으로 정상, 지성, 건성, 복합성 피부의 소유자가 각각 25%씩 구성되도록 하였다.

동일인에게 안면 왼쪽 볼 부분에는 제형예 3의 영양크림을, 안면 오른쪽 볼 부분에는 비교제형예 3의 영양크림을 매일 아침 세안 후 피부에 1일 1회 20일간 도포한 후 피부 주름 및 탄력 개선 정도를 육안으로 측정하였으며, 그 결과를 하기 [표 15]에 나타내었다.

[표 15]

상기 [표 15]에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 벼줄기세포 추출물을 첨가하지 않은 제형(비교제형예 3)을 도포한 부위에 비해, 벼줄기세포 추출물을 함유한 제형(제형예 3)을 도포한 부위의 피부 주름 및 탄력 개선 효과가 높은 것으로 조사되었다. 이와 같이, 본 발명의 벼줄기세포 추출물이 피부 주름 및 탄력 개선에 따른 항노화 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

한국생명공학연구원 미생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC) KCTC11760BP 20100907

Claims (11)

1. 벼 유래 캘러스로부터 분리된 현탁 세포 추출물을 유효성분으로 함유하는 항노화 화장료 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 벼 유래 캘러스는 벼의 잎, 줄기, 종자 및 뿌리를 포함하여 이루어지는 군으로부터 선택된 조직으로부터 유래한 미분화된 세포인 것인 화장료 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 벼 유래 캘러스는 기탁번호 KCTC 11760BP의 벼 유래 캘러스인 화장료 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 현탁 세포를 인산염 완충액, 물, 에탄올 및 이들의 혼합용매 중에서 선택된 추출용매로 추출하여 수득된 것인 화장료 조성물.
5. 제4항에 있어서, 상기 추출은 교반추출법, 초음파추출법, 열추출법 및 고온고압추출법 중에서 선택된 방법에 의한 것인 화장료 조성물.
6. 제5항에 있어서, 상기 추출은 고온고압추출법인 화장료 조성물.
7. 제6항에 있어서, 상기 고온고압 추출법은 100 내지 130℃의 온도 및 1.0MPa 내지 2.0MPa 압력에서 추출하는 것인 화장료 조성물.
8. 제1항에 있어서, 상기 현탁 세포 추출물은 조성물 총중량에 대하여 0.001 내지 10중량%로 함유되는 것인 화장료 조성물.
9. 제1항에 있어서, 상기 항노화가 Collagen type Ⅰ의 합성 촉진에 기초한 주름개선 및 피부탄력개선 효과에 의한 것인 화장료 조성물.
10. 제1항에 있어서, 상기 항노화가 표피줄기세포 증식에 기초한 주름개선 및 피부 탄력 개선효과에 의한 것인 화장료 조성물.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저에서 선택된 제형인 것인 화장료 조성물.

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