KR20210155989A - 피부 탄력 또는 피부 주름 개선 활성, 피부 상처 재생 활성, 및 피부 장벽 강화 활성을 갖는 락토바실러스 사케이 균주, 그 배양액, 또는 그 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물 - Google Patents
피부 탄력 또는 피부 주름 개선 활성, 피부 상처 재생 활성, 및 피부 장벽 강화 활성을 갖는 락토바실러스 사케이 균주, 그 배양액, 또는 그 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 피부 탄력 또는 피부 주름 개선, 피부 상처 재생, 및 피부 장벽 강화 활성을 갖는 락토바실러스 사케이 균주, 그 배양액, 또는 그 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 세포 독성이 없고, 피부 탄력 또는 피부 주름 개선에 우수한 효과가 있으며, 피부 상처 재생을 촉진하고, 피부 장벽을 강화하는 우수한 효과가 있으므로 화장품과 식품 등의 분야에서 유용하게 이용 가능하다.
본 발명의 조성물은 세포 독성이 없고, 피부 탄력 또는 피부 주름 개선에 우수한 효과가 있으며, 피부 상처 재생을 촉진하고, 피부 장벽을 강화하는 우수한 효과가 있으므로 화장품과 식품 등의 분야에서 유용하게 이용 가능하다.
Description
본 발명은 락토바실러스 사케이 균주, 그 배양액, 또는 그 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 피부 탄력 또는 피부 주름 개선 활성, 피부 상처 재생 활성, 및 피부 장벽 강화 활성을 갖는 락토바실러스 사케이 균주, 그 배양액, 또는 그 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것이다.
생물체의 항상성(homeostasis)을 유지하기 위한 과정에서 중요한 역할을 담당하고 있는 물질들 중 일부가 각종 생물체 유래의 생리 활성 물질이다. 지금까지 수많은 생리 활성 물질에 관해 많은 연구가 진행되고 있으며, 그 중, 미생물, 식물, 또는 동물체 등에서 분리된 생리 활성을 갖는 물질에 관한 연구는 생명과학 및 의학 분야에서 매우 중요한 영역이다.
한편, 콜라겐은 피부 진피층에 존재하는데, 피부 전체 건조 중량의 약 70 내지 80%를 차지하는 엘라스틴과 함께 피부에 탄력을 부여하는 주요 성분으로 알려져 있다. 콜라겐은 자연 노화에 따른 세포 활성 저하와 같은 내부 요인에 의해 감소되고, 여러 유해 환경에서의 스트레스 증가나 태양 광선에 의한 활성 산소 종의 증가와 같은 외부 요인에 의하여 생합성이 감소되거나, 분해가 촉진되고 있다.
한편, 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 과생산은 UVB 노출 환경에서 보고된 바 있고, UVB 노출과 연관된 신호전달 체계는 MAPKs(mitogen activated protein kinases), ERK(extracellular signal-regulated kinase), p38 카이나아제, 및 JNK(c-Jun amino-terminal kinase) 등의 단백질과 관련되어 있는데, NF-ĸB 및 AP-1 전사인자의 발현증가를 유도한다. 또한, AP-1 단백질은 MMP(matrix metalloproteinase) 유전자의 활성과 관련되어 있고, NF-ĸB 단백질은 인터루킨과 같은 전염증 사이토카인(proinflammatory cytokines)의 발현에 영향을 미친다.
노화된 피부에서 콜라겐 및 엘라스틴의 붕괴는 주로 MMP 단백질과 같은 그 분해 효소의 증가된 발현에 의해 야기된다. 또한, 전염증 사이토카인은 콜라겐의 합성을 방해하고, 콜라겐의 붕괴를 촉진시킨다. 타입 I 콜라겐은 연결 조직의 세포외 기질에서 가장 풍부한 단백질이다. 세포외 기질에는 타입 III, V, 및 VII 콜라겐, 엘라스틴, 프로테오글라이칸, 파이브로넥틴과 같은 다른 유형의 단백질을 포함한다.
타입 I 콜라겐 단백질의 발현 수준을 조절하는 것은 피부 광노화를 예방하는데 있어서 가장 중요한 인자이다. UVB의 조사는 TGF-β/Smad 신호전달 체계의 억제를 통해 피부 섬유아세포에서 콜라겐 전구체인 프로콜라겐(procollagen)의 발현을 감소시키게 된다. 또한, TGF-β1 신호전달 체계는 인간 피부 섬유아세포에서 세포외 기질의 합성을 조절하는 중요한 인자의 하나이다.
따라서, AP-1 및 MAPKs 인자에 의해 조절되는 활성산소종(ROS)의 생성, 및 MMPs, ILs, TGF-β, 및 타입 I 프로콜라겐의 발현은 피부 광노화 연구에 있어서 유용한 마커로 작용한다.
이와 같이 콜라겐 감소를 저해하여 피부 탄력 또는 피부 주름의 개선에 효과가 있는 천연물질을 탐색하고자 하는 여러 다양한 시도가 있었다. 콜라겐의 주름개선 효과를 이용하기 위하여 화장품 또는 연고 등과 같은 피부외용제 조성물에 콜라겐을 배합한 제품들이 출시되었으나, 이들 제품들은 콜라겐 자체를 피부 표면에 도포하는 것으로 고분자 물질인 콜라겐의 경피 흡수가 어려워 본질적인 피부 탄력 또는 피부 주름 개선의 효과를 나타낼 수 없었다. 이러한 문제를 해결하기 위하여 콜라겐 합성 촉진 물질에 대한 관심이 높아졌으며, 종래 알려진 콜라겐 합성 촉진물질로는 비타민C, 레티노익산, 형질전환생장인자(transforming growth factor, TGF), 동물태반 유래의 단백질(JP8-231370), 베툴린산(betulinic acid, JP8-208424), 클로렐라 추출물(JP9-40523, JP10-36283, 섬유아세포 증식 촉진작용) 등이 있다. 그러나 상기 물질은 피부 적용시 자극과 발적 등 안전성 문제로 사용량에 제한이 있거나 그 효과가 미미하여 실질적으로 피부 탄력 또는 피부 주름의 개선 효과를 기대할 수 없다는 문제점이 있었다.
한편, 화장품 소재는 안전성, 효능, 물성 등이 균형을 이루어야 한다. 또한 경제성 확보도 중요한 요인으로서 화장품용 소재는 다양한 개발 방법, 천연물 추출과 미생물 등에 의한 발효를 이용하여 피부 투과, 노화 억제, 생리활성, 안전성 및 물성을 최적화하여 개발하게 된다. 화장품과 의약품의 경계가 무너지면서 화장품의 안정성과 의약품의 효과성을 겸비한 복합 기능성 원료 및 바이오소재를 통해 다양한 코스메슈티컬 제품들이 높은 성장세를 이어가고 있다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 피부 탄력 또는 피부 주름 개선에 효과가 우수한 유산균 소재에 관하여 연구를 수행하였으며, 피부 탄력 또는 피부 주름 개선 효과와 더불어 피부 상처 재생, 및 피부 장벽 강화 활성을 갖는 유산균 소재를 찾기 위해 예의 연구노력한 결과, 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) blanc001(기탁번호: KCTC 14206BP) 균주가 갖는 우수한 피부상태 개선 효과를 규명하여, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 피부 탄력 또는 피부 주름 개선 활성, 피부 상처 재생 활성, 및 피부 장벽 강화 활성을 갖는 락토바실러스 사케이 균주, 그 배양액, 또는 그 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) blanc001(기탁번호: KCTC 14206BP) 균주, 그 배양액, 또는 그 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 피부 탄력 또는 피부 주름 개선, 피부 상처 재생, 및 피부 장벽 강화에 뛰어난 효과가 있는 여러 가지 천연물질들을 대상으로 그 효과를 탐색하였고, 유산균 소재들의 피부 상태 개선 효과에 주목하여 우수한 유산균 소재를 발굴하고자 연구노력한 결과, 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) blanc001(기탁번호: KCTC 14206BP) 균주를 동정하였고, 동 균주의 배양액이 피부 탄력 또는 피부 주름 개선, 피부 상처 재생, 및 피부 장벽 강화에 우수한 효과가 있음을 규명하였고, 피부에 적용 시에도 안전성에 문제가 없음을 확인하였다(도 1 참조).
또한, 상기 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) blanc001 균주는 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국생명공학연구원(KACC)에 국제기탁하여 수탁번호 KCTC 14206BP를 부여받았다. 본 발명에서 "락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) blanc001 균주", "blanc001 균주", 및 "blanc001"과 혼용하여 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "추출물"은 식물의 추출 처리에 따라 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다. 본 발명의 상기 추출물은 바람직하게 추출 후 건조 분말 형태로 제조되어 사용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에서, 상기 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) blanc001(기탁번호: KCTC 14206BP) 균주, 그 배양액, 또는 그 추출물은 타입 I 프로콜라겐 유전자의 발현을 증가시키고, MMP-1(matrix metallo-proteinase 1) 유전자의 발현을 억제하여 피부 탄력 또는 피부 주름 개선 활성을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 용어, "피부 주름"이란, 피부가 쇠하여 생긴 잔줄을 의미하는데, 유전자에 의한 원인, 피부 진피에 존재하는 콜라겐의 감소, 외부 환경 등에 의해 유발될 수 있다. 본 발명에서 "피부 주름 예방 또는 개선"이란, 피부에 주름이 생성되는 것을 억제 또는 저해하거나, 이미 생성된 주름을 완화시키는 것을 말한다.
피부 섬유아세포의 주된 기능으로 세포외기질 합성과 증식을 통한 손상된 피부 조직 재생 등을 들 수 있는데, 광노화와 같은 외인성 노화 요인 또는 유리 산소에 의한 손상 누적, 텔로미어 단절로 인한 세포 노화 등에 따른 내인성 노화 요인들은 진피층 내에 있는 피부섬유아세포의 생리 활성 기능을 저하하게 된다. 피부 세포외기질 중 95% 이상을 차지하고, 세포의 부착분자(adhesion molecule) 및 세포 골격(cytoskeleton) 등과의 상호 작용과 신호 교류를 통해 섬유아세포의 생리 활성에 매우 주요한 부분을 담당하는 제I형 콜라겐의 합성이 저하될 경우, 피부 조직 내 콜라겐 양이 감소하고, 이에 따라 표면 장력이 감소하여 피부 탄력이 저하되고 피부 주름이 형성될 뿐만 아니라, 세포의 증식 및 재생 기능을 포함하는 생리 활성 기능이 감소하는 악순환의 원인이 된다.
따라서, 피부섬유아세포의 콜라겐은 피부 탄력, 피부 주름 형성 및 피부 손상 시 조직의 수복 또는 재생과 직접적인 관련이 있다고 볼 수 있다.
즉, 피부 섬유아세포의 콜라겐 또는 프로콜라겐의 합성이 촉진되거나, 콜라겐을 분해하는 기질 단백질 분해효소(matrix metallo-proteinase, 이하 'MMP'라 함)의 합성이 저해되면, 피부 탄력 개선, 피부 재생, 피부 주름 개선, 상처 치유, 손상된 피부 조직의 수복 및 재생, 및 피부 노화 방지 등의 효과를 얻을 수 있다.
본 발명의 실시예에서는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) blanc001(기탁번호: KCTC 14206BP) 균주의 배양액 추출물이 타입 I 프로콜라겐 유전자의 발현을 증가시키고, MMP-1(matrix metallo-proteinase 1) 유전자의 발현을 억제하여 피부 탄력 또는 피부 주름을 개선하는 활성을 갖는 것을 확인하였다(도 2 및 도 3 참조).
또한, 본 발명의 화장료 조성물에서, 상기 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) blanc001(기탁번호: KCTC 14206BP) 균주, 그 배양액, 또는 그 추출물은 피부 상처의 재생을 촉진하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 상기 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) blanc001(기탁번호: KCTC 14206BP) 균주의 배양액 추출물 처리에 의해서 피부 재생이 촉진되는 것을 확인할 수 있었으며, 500㎍/㎖ 용량에서는 양성대조군인 알란토인(Allantoin)처리군에 비해 133% 개선된 피부 재생 촉진 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다(도 4 참조).
또한, 본 발명의 화장료 조성물에서, 상기 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) blanc001(기탁번호: KCTC 14206BP) 균주, 그 배양액, 또는 그 추출물은 필라그린 유전자 발현을 증가시켜 피부 장벽 강화 활성을 갖는 것을 특징으로 한다. 필라그린은 표피 과립층에서 케라토히알린과립(keratohyalin granule)을 형성하는 단백질인 프로필라그린(profilaggrin)의 형태로 존재하다가, 각질형성세포의 최종분화과정에서 필라그린으로 분해된 후에 각질세포막을 형성할 때 케라틴 필라멘트를 응집하여 각질세포의 단단하고 편평한 구조를 형성함으로써 피부장벽에서 벽돌(brick)의 역할을 한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 상기 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) blanc001(기탁번호: KCTC 14206BP) 균주의 배양액 추출물 처리에 의해서 필라그린(filaggrin)의 mRNA 발현량이 현저하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 5 참조).
본 발명의 화장료 조성물은 식용 가능한 유산균 소재에서 유래하여 인체에 해가 없으며, 그 첨가로 인해 화장품의 물질의 품질을 손상하지 않으므로 화장료 조성물에 포함되어 사용되는데 적합하다. 특히, 피부 탄력 또는 피부 주름 개선과 피부 상처 재생, 그리고 피부 장벽 강화와 관련된 기능이 있으므로, 기능성 화장료 조성물에 포함되어 사용되는 것이 바람직하다.
본 발명의 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 마스크팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면 활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 화장료 조성물의 제형에 따라 다양하다.
본 발명의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 등이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로하드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제 등이 이용될 수 있으며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일 등이 이용될 수 있고, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타하이드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 비누인 경우에는, 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알코올, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에서, 상기 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) blanc001(기탁번호: KCTC 14206BP) 균주, 그 배양액, 또는 그 추출물은 구체적으로는 건조 중량으로, 화장료 조성물 총 중량의 0.0001 중량% 내지 50 중량%로 포함될 수 있으며, 보다 구체적으로는 0.0005 중량% 내지 10 중량%로 포함될 수 있다. 상기 범위 내에서 피부 탄력 또는 피부 주름 개선, 피부 상처 재생 및 피부 장벽 강화에 대한 우수한 효능을 나타내는 이점이 있으며, 조성물의 제형이 안정화되는 이점이 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) blanc001(기탁번호: KCTC 14206BP), 그 배양액, 또는 그 추출물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) blanc001(기탁번호: KCTC 14206BP) 균주, 그 배양액, 또는 그 추출물은 피부 탄력 또는 피부 주름 개선에 우수한 활성을 갖는 동시에 피부 상처 재생 및 피부 장벽 강화에도 우수한 효과를 나타내어 피부 상태 개선을 위한 식품 조성물로 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) blanc001(기탁번호: KCTC 14206BP) 균주와 "피부 탄력 또는 피부 주름의 개선", "피부 상처 재생" 및 "피부 장벽 강화"에 대한 효과는 상기에서 설명한 바와 같다. 상기 식품 조성물은 건강기능식품의 형태로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 식품 조성물은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) blanc001(기탁번호: KCTC 14206BP) 균주, 그 배양액, 또는 그 추출물과, 이들의 가공물의 형태로 포함될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 유효성분 이외에 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조첨가제를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, "식품 보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품 보조첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품 보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 식품 조성물에는 건강기능식품이 포함될 수 있다. 본 발명에 있어서, "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 “기능성”이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법으로 제조 가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다.
또한, 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식용 유산균을 원료로 하여 식품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나며, 피부에 주름 발생을 줄여주고, 피부를 탄력있게 개선하며, 피부 상처 재생을 촉진하고, 피부 장벽을 강화하는 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품이 취할 수 있는 형태에는 제한이 없으며, 통상적인 의미의 식품을 모두 포함할 수 있고, 기능성 식품 등 당업계에 알려진 용어와 혼용하여 사용할 수 있다. 아울러 본 발명의 건강기능식품은 당업자의 선택에 따라 식품에 포함될 수 있는 적절한 기타 보조 성분과 공지의 첨가제를 혼합하여 제조할 수 있다. 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 본 발명에 따른 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) blanc001(기탁번호: KCTC 14206BP) 균주, 그 배양액, 또는 그 추출물을 주성분으로 하여 제조한 즙, 차, 젤리 및 주스 등에 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 동물을 위한 사료로 이용되는 식품도 포함된다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(1) 본 발명은 피부 탄력 또는 피부 주름 개선, 피부 상처 재생, 및 피부 장벽 강화 활성을 갖는 락토바실러스 사케이, 그 배양액, 또는 그 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공한다.
(2) 본 발명의 조성물은 세포 독성이 없고, 피부 탄력 또는 피부 주름 개선에 우수한 효과가 있으며, 피부 상처 재생을 촉진하고, 피부 장벽을 강화하는 우수한 효과가 있으므로 화장품과 식품 분야에서 유용하게 이용 가능하다.
(3) 또한, 본 발명의 조성물은 인체에 매우 안전할 뿐만 아니라, 안정성도 매우 탁월하다.
도 1은 락토바실러스 사케이 균주의 배양액 추출물 처리에 따른 인간 피부 섬유아세포의 세포생존능을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 인간 섬유아세포에서 락토바실러스 사케이 균주의 배양액 추출물 처리에 따른 타입 I 프로콜라겐 단백질의 발현 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 3은 인간 섬유아세포에서 락토바실러스 사케이 균주의 배양액 추출물 처리에 따른 MMP-1 단백질의 발현 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 인간각질형성세포(HaCaT)에서 락토바실러스 사케이 균주의 배양액 추출물 처리에 따른 피부 재생 효과를 MTT(methylthiazole-2-yl-2.5-diphenyl tetrazolium bromide) 분석 방법과 디프 퀵 스테인(Diff quic stain) 방법을 이용하여 세포염색 후 현미경으로 확인하고 정상세포와 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 5는 인간각질형성세포(HaCaT)에서 락토바실러스 사케이 균주의 배양액 추출물 처리에 따른 필라그린 mRNA 발현 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 인간 섬유아세포에서 락토바실러스 사케이 균주의 배양액 추출물 처리에 따른 타입 I 프로콜라겐 단백질의 발현 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 3은 인간 섬유아세포에서 락토바실러스 사케이 균주의 배양액 추출물 처리에 따른 MMP-1 단백질의 발현 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 인간각질형성세포(HaCaT)에서 락토바실러스 사케이 균주의 배양액 추출물 처리에 따른 피부 재생 효과를 MTT(methylthiazole-2-yl-2.5-diphenyl tetrazolium bromide) 분석 방법과 디프 퀵 스테인(Diff quic stain) 방법을 이용하여 세포염색 후 현미경으로 확인하고 정상세포와 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 5는 인간각질형성세포(HaCaT)에서 락토바실러스 사케이 균주의 배양액 추출물 처리에 따른 필라그린 mRNA 발현 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. 락토바실러스 사케이 균주 배양액 추출물의 제조
MRS 브로쓰(Difco) 100mL에 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei subsp. sakei blanc001) 균주(기탁번호 KCTC 14206BP)를 접종하고 혐기적 조건 하에 30℃ 항온기에서 OD 600nm에서 1.0이 될 때까지 배양하여 배양물을 획득하였다. 배양액 10㎖를 4℃에서 4,000rpm으로 20분간 원심분리하여 상층액만을 모았다. 이렇게 얻은 락토바실러스 사케이 균주 배양액을 감압농축기(Rotary evaporator N-1000, EYELA, Japan)를 이용하여 55℃에서 감압 농축한 후, 동결건조하여 분말형태로 제조하였다.
실시예 2. 세포독성 시험(MTTAssay)
실시예 1에서 준비한 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei subsp. sakei blanc001) 균주(기탁번호 KCTC 14206BP) 배양액 추출물의 인간 피부 섬유아세포(NHDF, normal human dermal fibroblast)에 대한 세포 독성을 시험하였다.
세포 독성은 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 비색정량분석법(colorimetric assay)을 사용하여 측정하였다. MTT(Methyl thiazol tetrazolium) 분석은 세포 생존 능력을 측정하기 위해 사용되는 것으로, MTT가 보라색을 생성하는 포마잔 염색으로 바꾸는 것이다. 인큐베이션 72시간 후, 배지의 부피는 1㎖로 감소하였고, 1㎎/㎖ MTT의 100㎕는 각 벽에 첨가되었다. 이후, 인간 피부 섬유아세포(NHDF, normal human dermal fibroblast)를 37℃에서 2시간 동안 5%의 CO2 및 95%의 O2 존재 하에 배양하였다. 기질-함유 배지는 제거되었고, 1㎖의 DMSO는 포마잔 결정을 용해하기 위해 각 벽에 첨가되었다. 또한, 상온에서 30분 동안 오비탈 셰이커로 플레이트를 흔들었다. 100㎕의 부분 표본의 흡수율은 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices E09090; 샌프란시스코, CA, 미국)를 사용하여 570㎚에서 흡수율을 측정함으로써 정량화하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei subsp. sakei blanc001) 균주(기탁번호 KCTC 14206BP)의 배양액 추출물의 처리는 인간 피부 섬유아세포에 독성을 나타내지 않고, 오히려 농도 의존적으로 생장을 촉진하는 것을 확인할 수 있었으며, 양성 대조군인 TGF-β 처리군에 비해서도 개선된 세포 증식 효과가 우수한 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3. 피부 주름 및 탄력 개선 시험
3-1. 타입 1 프로콜라겐 단백질의 합성 촉진
실시예 1에서 준비한 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei subsp. sakei blanc001) 균주(기탁번호 KCTC 14206BP) 배양액 추출물 처리에 따른 인간 피부 섬유아세포(NHDF, normal human dermal fibroblast)에서 타입 1 프로콜라겐 단백질의 발현 변화를 측정하였다.
실험은 40mm 세포 배양 접시에 2㎖의 DMEM 배양액을 넣고, 인간 피부 섬유아세포를 약 1.2x105의 농도로 접종한 후, 37℃, 5% CO2 환경에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 실시예 1에서 제조한 락토바실러스 사케이 균주의 배양액 추출물을 포함하는 배지(각각 10, 100, 및 500㎍/㎖)로 교체하여 3일간 배양하였다. 이후 배양액을 회수(harvest)하여 4℃, 7,500rpm 환경에서 5분간 원심분리(centrifuge)하고 ELISA 방법을 이용하여 타입 1 프로콜라겐(Procollagen Type I C Peptide EIA Kit, Takara, Shiga, Japan)의 단백질 발현량 변화를 확인하였다.
도 2를 참조하면, 락토바실러스 사케이 균주의 배양액 추출물은 타입 1 프로콜라겐 단백질의 생성을 농도 의존적으로 증가시키는 것을 확인할 수 있었다. 10, 100, 및 500㎍/㎖ 처리군 모두에서 무처리 음성 대조군에 비교하여 각각 113%, 133%, 및 160% 개선된 타입 1 프로콜라겐 단백질의 합성 증가 효과를 나타내는 것으로 관찰되었다. 또한, 500㎍/㎖ 처리군에서는 종래 피부 주름 및 탄력 개선에 효과가 있는 것으로 알려진 TGF-β 처리군과 비교하여도 107% 개선된 타입 1 프로콜라겐 단백질의 합성 증가 효과를 나타내는 것으로 관찰되었다.
상기와 같은 결과를 통해, 본 발명의 락토바실러스 사케이 균주의 배양액 추출물은 TGF-β/Smad 신호전달체계에 작용하여 타입 1 프로콜라겐의 생성을 촉진하고, 주름생성을 효과적으로 예방하며, 피부 탄력을 개선하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
3-2. MMP-1 단백질의 합성 저해
실시예 1에서 준비한 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei subsp. sakei blanc001) 균주(기탁번호 KCTC 14206BP) 배양액 추출물 처리에 따른 인간 피부 섬유아세포(NHDF, normal human dermal fibroblast)에서 MMP-1 단백질의 발현 변화를 측정하였다.
실험은 40mm 세포 배양 접시에 2㎖의 DMEM 배양액을 넣고, 인간 피부 섬유아세포를 약 1.2x105의 농도로 접종한 후, 37℃, 5% CO2 환경에서 24시간 동안 배양하였다. 이후, 실시예 1에서 제조한 락토바실러스 사케이 균주의 배양액 추출물을 포함하는 배지(각각 10, 100, 및 500㎍/㎖)로 교체하여 3일간 배양하였다. 이후 배양액을 회수(harvest)하여 4℃, 7,500rpm 환경에서 5분간 원심분리(centrifuge)하여 ELISA 방법을 이용하여 MMP-1(Human Total MMP-1 kit, R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA)의 단백질 발현량 변화를 확인하였다.
도 3을 참조하면, 락토바실러스 사케이 균주의 배양액 추출물은 MMP-1 단백질의 생성을 농도 의존적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 10, 100, 및 500㎍/㎖ 처리군 모두에서 무처리 음성 대조군에 비교하여 각각 11%, 24%, 및 45% 개선된 MMP-1 단백질의 생성 억제 효과를 나타내는 것으로 관찰되어 주름 생성을 효과적으로 예방하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 4. 피부 재생 시험
세포배양 100㎜ 디쉬에 1차 배양 피부 세포인 인간각질형성세포(HaCaT)가 80% 증식했을 때, 멸균된 tip(200ul)의 끝단을 이용하여 피부 세포에 상처를 주고, 락토바실러스 사케이 균주의 배양액 추출물을 각각 10, 100, 및 500㎍/㎖ 농도로 주입한 후 세포 재생 효과를 확인하였다.
이때, 세포 증식의 측정은 MTT(methylthiazole-2-yl-2.5-diphenyl tetrazolium bromide) 분석 방법과 디프 퀵 스테인(Diff quic stain) 방법을 이용하여 세포염색 후 현미경으로 확인하고 정상세포와 비교하여 정량화하여 도 4에 나타내었다.
그 결과, 도 4를 참조하면, 본 발명의 락토바실러스 사케이 균주의 배양액 추출물이 처리된 인간각질형성세포(HaCaT)에서 피부 재생이 농도 의존적으로 촉진되는 것을 확인할 수 있었다. 구체적으로 락토바실러스 사케이 배양액 추출물을 처리한 시험군은 무처리 음성대조군 비교하여 10, 100, 및 500㎍/㎖ 농도에서 각각 139%, 167%, 및 208% 개선된 세포 재생 효과를 나타내었다.
또한, 락토바실러스 사케이 균주의 배양액 추출물을 500㎍/㎖ 농도로 처리한 시험군에서는 알란토인(Allantoin)을 처리한 양성대조군에 비해서도 133% 개선된 피부 재생 촉진 효과를 나타내었다. 또한, 재생된 피부세포의 형태적인 모양에 있어서도 무처리군의 피부 세포보다 세포 증식(proliferation) 및 분화(differentiation)가 원활하며 스크래치(scratch) 부위의 세포 밀도가 더욱 높은 것으로 관찰되었다(미도시).
상기와 같은 결과를 토대로 본 발명의 락토바실러스 사케이 배양액 추출물을 손상된 피부에 적용하는 경우, 재생된 피부조직이 주변의 정상 피부조직과 차이가 발생하지 않으므로, 성형학적으로도 피부 상처부위가 덧나지 않게 하면서도 피부 세포의 재생을 촉진하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 5. 피부 장벽 강화(Filaggrin 유전자 발현 분석)
락토바실러스 사케이 균주의 배양액 추출물이 필라그린(Filaggrin, FLG, 각질층 형성 인자) 유전자 발현에 미치는 영향을 실험하였다.
먼저, 100mm 세포 배양 접시에 인간각질형성세포(HaCaT)를 10% FBS를 첨가한 DMEM 배지에 1×106 세포 농도로 접종하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양하여 상기 락토바실러스 사케이 균주의 배양액 추출물을 각각 10, 100, 및 500㎍/㎖ 농도가 되도록 DMEM 배지에 희석하여 제조한 희석용액을 첨가하여 24시간 동안 동일 조건에서 배양하였다. 이후 Trizol reagent(invitrogen, USA)를 이용하여 세포를 회수하여 RNA를 분리하였다. RT-PCR은 PCR 기계(Step One Plus, Applied Biosystems, 미국)를 이용하였고, 사이버그린(SYBR Green supermix, Applied Biosystems, 미국)을 filaggrin 및 GAPDH, 그리고 cDNA와 함께 첨가하여 94℃에서 5분 동안 중합효소 활성화, 95℃ 30초, 54℃ 1분, 72℃ 1분간 40 사이클로 중합 반응을 수행하였다.
사용한 프라이머는 다음과 같다:
- Filaggrin : 정방향 5′-AAG CTT CAT GGT GAT GCG AC-3′, 역방향 5′-TCA AGC AGA AGA GGA AGG CA-3′
- GAPDH: 정방향 5'-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3', 역방향 5'-CCA CCA CCC TGT TGC TGT AG-3'.
상기와 같은 프라이머를 이용하여 RT-PCR 수행하고, 그 결과를 도 5에 정리하였다.
필라그린은 표피 과립층에서 케라토히알린과립(keratohyalin granule)을 형성하는 단백질인 프로필라그린(profilaggrin)의 형태로 존재하다가, 각질형성세포의 최종분화과정에서 필라그린으로 분해된 후에 각질세포막을 형성할 때 케라틴 필라멘트를 응집하여 각질세포의 단단하고 편평한 구조를 형성함으로써 피부장벽에서 벽돌(brick)의 역할을 수행하게 된다.
실험 결과, 시료 무처리군에 비해 락토바실러스 사케이 균주의 배양액 추출물 처리군에서는 필라그린(filaggrin)의 mRNA 발현량이 각각 160%(10μg/mL), 190%(100μg/mL) 및 420%(500μg/mL) 증가한 것으로 관찰되었다.
상기와 같은 결과를 통해, 본 발명의 락토바실러스 사케이 균주의 배양액 추출물은 세포 독성이 없고, 타입 1 프로콜라겐 단백질 발현 증진 및 MMP-1 단백질 발현 억제를 통해 피부 주름 개선에 기여하며, 피부 재생 및 피부 장벽 형성에 기여하여 우수한 피부 상태 개선 효과를 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (5)
- 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) blanc001(기탁번호: KCTC 14206BP) 균주, 그 배양액, 또는 그 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 타입 I 프로콜라겐 유전자의 발현을 증가시키고, MMP-1(matrix metallo-proteinase 1) 유전자의 발현을 억제하여 피부 탄력 또는 피부 주름 개선 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 피부 탄력 또는 피부 주름 개선용 화장료 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 조성물은 피부 상처의 재생을 촉진하는 것을 특징으로 하는 피부 상처 재생 촉진용 화장료 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 조성물은 필라그린 유전자 발현을 증가시켜 피부 장벽 강화 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 피부 장벽 강화용 화장료 조성물. - 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) blanc001(기탁번호: KCTC 14206BP) 균주, 그 배양액, 또는 그 추출물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물.
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| WO2023132415A1 (ko) * | 2022-01-10 | 2023-07-13 | 주식회사 피에프네이처 | 유산균 복합 균주를 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선, 보습, 피부 장벽 강화 및 피부 재생용 조성물 |
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