KR20170021958A - 세네데스무스 속 미세조류의 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세네데스무스 속(Scenedesmus sp.) 미세조류의 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 상기 세네데스무스 속 미세조류의 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물은 항산화, 주름개선, 세포성장촉진, 진피세포성장촉진, 콜라겐 증가, 콜라겐분해효소 감소, 면역세포성장촉진, 염증억제, 피부 유수분 조절, 피부주름개선, 진피친밀도 증가, 피부탄력 증진, 보습, 피부장벽 회복, 피부결 개선, 피부 홍반 감소, 색소침착 감소 효과를 제공한다.

Description

세네데스무스 속 미세조류의 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물{COMPOSITION FOR SKIN EXTERNAL APPLICATION COMPRISING EXTRACT OF SCENEDESMUS SP.}

본 발명은 세네데스무스 속(Scenedesmus sp.) 미세조류의 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

최근 건강에 대한 관심이 증가함에 따라 기능성 생물소재에 대한 관심도 점점 증가하고 있다. 이러한 기능성 생물소재는 대부분 미생물을 대상으로 연구가 수행되었으나, 최근 국내외적으로　미세조류에서 다양한 생리활성물질이 발견되어, 이를 자원으로 이용하려는 연구가 활발히 진행되면서　미세조류가 생산하는 고부가가치 생리활성물질에 대한 관심이 매우 증대되고 있다.　미세조류는 광합성을 하여 생장하는 미생물로써 지구의 태고 시절부터 산소의 공급자였으며 많은 유용한 물질의 생산자이기도 하다. 최근　미세조류는 새로운 기능성 생물 소재로 연구되고 있으며,　미세조류의 산업적 이용은 대체에너지원 및 건강보조식품, 수산양식용 사료 및 의약 원료 물질과 더불어 생화학 물질 등의 응용분야에 이용되고 있는 실정이다.

한편, 세네데스무스는는 녹조류로 분류되며, 분류체계로는 Chlorophyta 목, Scenedesmaceae 과에 속한다. 세네데스무스는 전세계의 담수에 고르게 분포하고 있으며, 체내 지질의 함량이 20~30%로 존재하고, 지질의 조성은 팔미트산(C16:0)과 리놀레산(linoleic acid, 18:2)이 주성분을 이루고 있다(Yoo, C., Jun, S-Y., Lee, J-Y., Ahn, C-Y., and Oh, H-M. 2010. Selection of microalgae for lipid production under high levels carbon dioxide. Biores . Technol .101:S71-S74). 현재까지 세네데스무스를 이용해 바이오디젤을 생산한 연구결과가 나와 있으나, 세네데스무스과의 세네데스무스를 이용한 피부 외용제 조성물에 대한 연구는 전무하다.

이에, 본 발명자들은 세네데스무스 속 신규 미세조류가 우수한 항산화 효과, 피부 미백 및 피부 주름 개선 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

대한민국 공개특허 제2012-0057335호

본 발명의 목적은 세네데스무스 속(Scenedesmus sp.) 미세조류의 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세네데스무스 속(Scenedesmus sp.) 미세조류의 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물을 제공한다.

본 발명의 구체예에서, 상기 세네데스무스 속 미세조류는 세네데스무스 오블리쿠스(Scenedesmus obliquus)일 수 있으며, 가장 바람직하게 Scenedesmus sp. JD026일 수 있다.

상기 미세조류 추출물은 C1-C4의 저급 알코올, 헥산, 에틸아세테이트, 물 또는 이들의 혼합물을 용매로 사용하여 추출된 것일 수 있으며, 바람직하게 상기 저급 알코올은 메탄올 또는 에탄올일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 세네데스무스 속 미세조류 추출물의 추출 방법으로는 여과법, 열수추출, 침지추출, 환류냉각추출 및 초음파추출 등 당업계의 통상적인 방법을 이용할 수 있으며, 열수추출 방법으로 1회 내지 5회 추출하는 것일 수 있고, 보다 구체적으로 3회 반복 추출하는 것일 수 있으나 이에 한정하지 않는다. 상기 추출용매는 파쇄한 클로렐라에 0.1 내지 10배로 첨가할 수 있으며, 0.3 내지 5배 첨가하는 것이 바람직하다. 추출온도는 20℃ 내지 80℃인 것일 수 있으나 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 12 내지 72 시간인 것일 수 있으나 이에 한정하지 않는다.

상기 방법에 있어서, 상기 감압농축은 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것일 수 있으나 이에 한정하지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조하는 것일 수 있으나 이에 한정하지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 추출물은 농축, 또는 희석하여 사용할 수 있고, 추출물의 증류액을 사용할 수도 있다. 구체적으로, 일 실시예에서, 감압농축기를 이용하여 농축할 수 있다.

본 발명의 상기 세네데스무스 속 미세조류의 추출물을 유효성분으로 함유하는피부 외용제 조성물은 이에 제한되는 것은 아니나 항산화, 주름개선, 세포성장촉진, 진피세포성장촉진, 콜라겐 증가, 콜라겐분해효소 감소, 면역세포성장촉진, 염증억제, 피부 유수분 조절, 피부주름개선, 진피친밀도 증가, 피부탄력 증진, 보습, 피부장벽 회복, 피부결 개선, 피부 홍반 감소, 색소침착 감소용으로 사용될 수 있다.

본 발명의 용어,　"피부 개선용"이란,　피부　보호 및　피부　상태　개선, 자외선으로부터의　피부　손상 방지,　피부　미백,　피부　노화　및 주름의 예방 또는　개선,　피부　보호 및　피부의 염증 반응의 완화, 면역질환　개선능, 또는　피부　장벽 기능　개선,　피부자극 완화,　피부　세포 증식 및 재생능, 항산화능, 콜라겐 합성 증진능 등을 모두 포함하는 개념이다.

본 발명의 용어, "유효성분으로 함유하는"은,　피부　외용제 조성물로써　피부 개선　효과를 나타낼 수 있는, 예컨대,　피부　외용제 조성물로써 UV 세포 손상 방지를 통한　피부세포 노화방지, 티로시나제 활성 억제를 통한 미백능, L-DOPA 산화　저해를 통한 미백능, 멜라닌 합성 억제능, 항산화능을 나타낼 수 있는 정도의 유효량을 함유하는 것을 의미한다.

따라서, 본 발명에 따른　피부　외용제 조성물은, 특히,　피부　노화　방지,　피부 주름　개선/방지용, 미백용, 항산화용으로 적용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 세네데스무스 속 미세조류 추출물은 자외선에 의한　피부　손상(광노화) 방지, 경감, 치유에도 효능이 있는 것으로 나타나, 자외선으로부터의　피부　손상 방지,　피부보호용으로도 적용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기　피부　외용제 조성물은　화장료 조성물 또는 약제학적 조성물일 수 있다.

상기　화장료 조성물에 있어서는,　화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있다. 여기서, "화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체"란　화장품 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는　화합물 또는 조성물이거나 앞으로 개발될　화합물 또는 조성물로서　피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 이상의 독성, 불안정성 또는 자극성이 없는 것을 말한다.

상기 담체는 본 발명의　피부　외용제 조성물에 그것의 전체 중량에 대하여 약 1 중량 % 내지 약 99.99 중량 %, 바람직하게는 조성물의 중량의 약 90 중량% 내지 약 99.99 중량 %로 포함될 수 있다. 그러나 상기 비율은 본 발명의　피부　외용제 조성물이 제조되는 후술한 바의 제형에 따라 또 그것의 구체적인 적용 부위(얼굴, 목 등)나 그것의 바람직한 적용량 등에 따라 달라지는 것이기 때문에, 상기 비율은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.

상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다. 상기 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료로 사용될 수 있는　화합물/조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 물질/조성물을 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명의 일 구현예로써, 본 발명에 따른　피부　외용제 조성물은 상기 세네데스무스 속 미세조류 추출물 이외에 디소디움 EDTA, 파라옥시안식향산에스텔, 클로페네신, 히아루론산, 알로에겔, 산탄검 1％ 수용액, 카르복시비닐폴리머, 스쿠알랑, 디메치콘, 사이크로메치콘, 폴리솔베이트 60, 솔비탄올레이트, 스테아린산, 트리에탄올아민, 쉐어버터, 그리세릴스테아레이트, 세토스테아릴알코올, 1,3-부틸렌글리콜, 구연산, 구연산나트륨, 하이드로젠이티드, 캐스터오일, 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글키롤, 폴리옥시에틸렌 경화피마자유, 에탄올, 트리에탄올아민 등을 포함할 수 있으며, 방부제, 항료, 착색료, 정제수 등을 필요에 따라 미량 포함할 수 있다.

본 발명에 따른　피부　외용제 조성물은, 다양한 형태로 제조될 수 있는데, 예컨대,　화장수, 에센스, 수용성 리퀴드, 스킨 토너, 젤, 에멀젼, 로션, 크림(수중유(O/W)형, 유중수(W/O)형, 다중상), 용액, 현탁액(무수 및 수계), 무수 생성물(오일 및 글리콜계), 젤, 마스크, 팩, 분말, 또는 젤라틴 등의 피막이 있는 캅셀 (소프트 캅셀, 하드 캅셀) 제형 등의 형태로 제조될 수 있다.

본 발명에 있어서의　피부는 얼굴뿐만 아니라, 두피, 전신도 포함되는 개념으로, 이러한 두피에 적용될 수 있는　피부　외용제 조성물로써, 샴푸, 린스, 트리트먼트, 발모제 등이 있고, 전신에 적용될 수 있는 바디클렌져 등의 용도로써 다양한 형태로 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 세네데스무스 속 미세조류 추출물을 함유　피부　외용제 조성물의 제조방법은 전술한 제조방법에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 제조방법을 일부 변형시킨 방법으로도 본 발명에 따른 세네데스무스 속 미세조류 추출물을 함유　피부　외용제 조성물을 제조할 수 있다.

특히, 상기　피부　외용제 조성물은 본 발명에 특별히 개시된 제조방법 이외에도, 통상적으로 알려진 제조방법을 이용하여, 일반적인 유화　제형 및 가용화　제형의 형태로 제조될 수 있다.

화장료 조성물로 제조될 경우, 유화　제형의　화장품으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 가용화　제형의　화장품으로는 유연화장수가 있다. 또한,　피부과학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유함으로써　피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소적용 또는 전신적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있다.

또한, 적합한　화장품의 제형으로는, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의　피부　외용제 조성물은 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는　화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은　화장품학 또는　피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고, 상기의 성분들은　피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

이러한, 본 발명에 따른　피부　외용제 조성물은 콜라겐 합성 증진능에 따른　피부　주름　개선, 노화된　피부　세포 활성화능에 기반한　피부　노화　방지의 기능을 할 수 있는 기능성　화장품의 형태를 포함한다.

이러한 약제학적 조성물은 유효성분인 세네데스무스 속 미세조류 추출물 외에, "약학적으로 허용가능한 담체"를 포함할 수 있으며, 이러한 담체는 희석제, 활택제, 결합제, 붕해제, 감미제, 안정제 및 방부제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 약학 조성물은 첨가제를 더 포함할 수 있다. 상기 첨가제로 향료, 비타민, 및 항산화제가 포함될 수 있다. 상기 담체로 약제학적으로 허용 가능한 담체는 모두 가능하며, 예를 들면, 희석제로는 유당, 덱스트린, 타피오카(tapioca) 녹말, 옥수수 전분, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 또는 만니톨, 활택제로는 스테아린산 마그네슘 또는 탈크, 결합제로는 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필셀룰로오스일 수 있다. 또한, 붕해제로는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분글리콜산나트륨, 폴라크릴린칼륨, 또는 크로스포비돈, 감미제로는 백당, 과당, 솔비톨, 또는 아스파탐, 안정제로는 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 베타-사이클로덱스트린, 또는 잔탄검, 방부제로는 파라옥시안식향산메틸, 파라옥시안식향산프로필, 또는 솔빈산칼륨일 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 약제학적 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 경구 투여제제, 주사제, 좌제, 경피 투여제제, 및 경비 투여제제의 제형으로 제제화되어 투여될 수 있다. 예를 들면, 상기 제형은 액제, 현탁제, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 또는 엑스제와 같은 경구 투여용 제형일 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 청정수계지역에서 신규한 미세조류인 Scenedesmus SP. JD026를 분리 및 동정하였다. 또한 본 발명의 구체예에서, Scenedesmus SP. JD026은 일반적인 배양 환경에서 1 g/L의 바이오매스까지 배양되었고, 12시간 동안 high light(1000 uE)에 반응하여 미세조류 추출물의 양을 증가시킬 수 있었다. 또한 Scenedesmus SP. JD026 추출물을 이용하여 스킨토너, 수분크림 그리고 크림을 제조하였고, 피부 안정성에 이상이 없는 것으로 확인되었다. 또한 Scenedesmus SP. JD26 추출물은 양성대조군인 알파-토코페롤에 비해 활성산소 분해가 촉진된 것을 확인하였으며, 대조군(무처리군)에 비해 인간진피섬유아세포 성장을 촉진하는 것을 확인하였다. 또한 본 발명의 구체예에서, Scenedesmus SP. JD026 추출물 처리시, B-actin, COL1A1, MMP1 mRNA의 발현이 대조군과 비교하여 유사하거나 증가하였으며, 대조군에 비해 면역세포 생장을 증가시킴을 확인하였다. 또한 Scenedesmus SP. JD026 추출물은 LPS처리군에서 사이토카인 전사요인인 NF-kB의 발현을 감소시켰으며, 양성대조군인 L-NMMA에 비해 염증성 사이토카인 합성 유전자인 IL-1B의 발현감소율이 유사한 것을 확인하였다. 또한 본 발명의 Scenedesmus SP. JD026 추출물을 함유한 크림 및 토너를 2주 및 4주간 처리한 후, 대조군(무처리군)에 비해 피부 수분 증가, 피부주름 개선, 피부 두께가 증가, 피부탄력 개선, 경피수분 손실량 감소, 주름 깊이 감소, 홍반 감소, 및 피부 색소 침착 면적 감소를 확인하였다. 이는 양성대조군인 알로에보다 우수한 것을 확인하였다.

본 발명의 청정수계지역에서 분리 및 동정하여 얻은 Scenedesmus SP. JD026의 추출물은 항산화, 진피세포성장촉진, 콜라겐 증가, 콜라겐분해효소 감소, 면역세포성장촉진, 염증억제, 피부 유수분 조절, 피부주름개선, 진피친밀도 증가, 피부탄력 개선, 피부장벽 회복, 피부결 개선, 피부홍반 감소 그리고 색소침착 감소 효과가 있다. 따라서, 피부 외용제 조성물로 용이하게 활용할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 Scenedesmus SP. JD026의 크기 및 형태를 나타낸 현미경 사진이다.
도 2는 Scenedesmus sp. JD026 의 성장 곡선을 나타낸 그래프이다.
도 3은 Scenedesmus sp. JD026의 배양 완료 후 광처리 반응 결과를 나타낸다. A) 배양 환경; B)High light 상태.
도 4는 Scenedesmus sp. JD026 추출물에 의한 활성산소의 분해를 추출물의 농도 및 용매종류별로 확인한 결과이다.
도 5는 Scenedesmus sp. JD026의 용매별 추출물을 인간진피섬유아세포인 nHDF 세포에 처리한 후의 세포 성장 효과를 확인한 그래프이다.
도 6은 Scenedesmus sp. JD026 추출물이 MMP1 mRNA의 발현에 미치는 효과를 추출 용매 및 추출물 농도별로 확인한 그래프이다.
도 7은 Scenedesmus sp. JD026 추출물이 Col1A1 mRNA의 발현에 미치는 효과를 추출 용매 및 추출물 농도별로 확인한 그래프이다.
도 8은 Scenedesmus sp. JD026 추출물이 면역세포인 Raw264.7의 성장에 미치는 효과를 추출 용매 및 추출물 농도별로 확인한 그래프이다.
도 9는 Scenedesmus sp. JD026 추출물의 NF-κB의 전사능력 억제 효과를 추출 용매 및 추출물 농도별로 확인한 그래프이다.
도 10은 Scenedesmus sp. JD026 추출물에 의해 면역반응을 유도하는 염증성 사이토카인의 합성이 억제되는지 여부를 TNF-α 유전자 발현 변화로 확인한 결과이다(LPS: lipopolysaccharide 처리 면역세포; L-NMMA: L-NG-Monomethylarginine, Acetate Salt 양성대조군).
도 11은 Scenedesmus sp. JD026 추출물에 의해 면역반응을 유도하는 염증성 사이토카인의 합성이 억제되는지 여부를 IL-1β 유전자 발현 변화로 확인한 결과이다.
도 12는 Scenedesmus sp. JD026 추출물로 제조한 크림 및 토너를 2, 4주간 처리한 후 피부 수분량 변화를 측정한 결과이다.
도 13은 Scenedesmus sp. JD026 추출물로 제조한 크림 및 토너를 2, 4주간 처리한 후 피부 유분량 변화를 측정한 결과이다.
도 14는 Scenedesmus sp. JD026 추출물로 제조한 크림 및 토너를 2, 4주간 처리한 후 피부 주름 변화를 측정한 결과이다.
도 15는 Scenedesmus sp. JD026 추출물로 제조한 크림 및 토너를 2, 4주간 처리한 후 피부 두께 변화를 측정한 결과이다.
도 16은 Scenedesmus sp. JD026 추출물로 제조한 크림 및 토너를 2, 4주간 처리한 후 피부 탄력 변화를 측정한 결과이다.
도 17은 Scenedesmus sp. JD026 추출물로 제조한 크림 및 토너를 2, 4주간 처리한 후 피부 장벽 개선 효과를 경피수분손실량 변화로 확인한 결과이다.
도 18은 Scenedesmus sp. JD026 추출물로 제조한 크림 및 토너를 2, 4주간 처리한 후 피부결 개선 정도를 피부결 정도를 PRIMOS Lite로 측정한 결과이다.
도 19는 Scenedesmus sp. JD026 추출물로 제조한 크림 및 토너를 2, 4주간 처리한 후 피부 홍반 개선 정도를 분광광도계로 측정한 결과이다.
도 20은 Scenedesmus sp. JD026 추출물로 제조한 크림 및 토너를 2, 4주간 처리한 후 피부 색소 침착 개선 정도를 ANTERA 3D로 측정한 결과이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 이 기술분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1> 청정 담수로부터 미세조류 분리 및 동정

<1-1> 미세조류의 분리

청정지역 수계인 섬진강 유역 전라도 남원에서 담수 시료를 채취한 뒤 담수 시료는 1L 채수병에 채취하여 즉시 아이스박스를 이용하여 저온보관을 유지하였고, 실험실에서 시료를 Combi 514R(Hanil, 한국)를 이용하여 농축하였다. 농축한 담수시료를 마이크로피펫팅(micropipetting)을 통해 각각의 미세조류로 분리하였으며, 분리된 미세조류들을 BG11 media(표 1)가 들은 96 well plate에서 100μmol/m²/s의 광원하에서 배양하였다. 분리된 미세조류는 광학현미경(Nicon ECLIPSE 80i, nikon, 일본) 및 형광현미경(Nicon ECLIPSE 80i, nikon, 일본)으로 관찰하였다.

그 결과, 형태적으로 Scenedesmus sp .와 유사함을 알 수 있었다 (도 1).

<1-2> 분리 미생물의 동정

상기 실시예 <1-1>에서 분리한 미세조류를 동정하기 위해 유전학적 방법이 사용되었다. 구체적으로, 하기 표 2에 기재된 ch165F와 ch1200R 프라이머 쌍을 이용하여 하기 표 3과 같은 구성으로 PCR을 위한 혼합물을 혼합한 뒤 표 4의 PCR 조건으로 GeneAmp PCR system 2700(ABI, 미국)을 이용하여 분리된 미세조류 JD026의 18S rRNA을 동정하였다.

동정한 JD026의 18S rRNA 서열을 ncbi의 blast 프로그램을 이용하여 확인한 결과, Scenedesmus obliquus 와 99% 유사한 것으로 동정되었다. 따라서, 본 발명에서 분리한 미세조류를 Scenedesmus sp. JD026으로 정하였다.

< 실시예 2> 미세조류 배양 및 수확

분리 및 동정된 미세조류 Scenedesmus sp. JD026미세조류의 cell biomass를 얻기 위해 2L culture bottle를 멸균상태로 준비하고 1 L의 BG11 배지를 넣고 미세조류를 접종하였다. 배양 조건은 온도 25℃, 교반속도 100 rpm, 광조사 70~100 μmol/m²/s에서 건조중량 1 g/L 수준으로 배양하였다. 균체농도 1 g/L 수준으로 배양된 미세조류 배양액은 High light condition(PAR 1,200 μmol/m²/s) 조건에서 12시간 동안 반응하였다(도 3).

미세조류 배양 및 반응이 끝난 Scenedesmus sp. JD026 시료는 50 ml tube로 옮겨 4000 rpm(3,800 x g)에서 20~40분 원심분리하여 cell biomass를 얻었다. 획득한 미세조류 cell biomass는 -70℃에서 동결 후, 동결건조기를 이용하여 수분을 제거하였음. 동결건조는 수분을 완전히 제거하기 위하여 over night으로 진행하였다.

< 실시예 3> 시료의 제조

Scenedesmus sp. JD026 추출물을 얻기 위하여 당업계에서 통상적으로 이용되는 추출법을 사용하였다. 먼저 파쇄한 Scenedesmus sp. JD026를 에탄올, 헥산, 에틸아세테이트 그리고 멸균수에 각각 혼합하였다. 상기 혼합된 원료를 60℃ 의 온도에서 48 시간 교반하여 추출하였다. 상기 Scenedesmus sp. JD026 추출물을 250 메쉬와 0.5 ㎛ 필터페이퍼로 여과하여 액상추출물을 수득하였다. 상기 여과된 액상추출물을 회전감압농축기를 이용하여 감압 농축하여 본 발명의 화장료 조성물의 농축물을 획득하였다. 이와 같이 조성된 본 발명에 따른 피부 개선용 화장료 조성물에 대한 관련 시험예를 실시한 결과, 피부 안정성에서 이상이 없는 것으로 조사되었다.

< 제조예 1> 스킨토너의 제조

실험재료인 스킨토너를 만들기 위한 성분의 구성은 아래의 표 5에 나타내었으며, 다음 과정을 거쳐 제조하였다. A상(수상)은 상온에서, B상(알코올상)은 히터를 이용하여 50℃로 가온하여 완전 용해시켰다. A상에 B상을 섞어 Disper로 1000rpm으로 10분간 가용화시켰다. 교반 혼합과정을 거쳐 냉각, 여과하고 pH 5.2 상태를 유지시켜 스킨토너를 완성하였다. 알로에(양성대조군)와 Scenedesmus sp. JD026 추출물은 용매별로 각각 5 중량％의 양을 첨가하여 제조하였다.

< 제조예 2> 수분크림의 제조

수분크림을 만들기 위한 성분구성은 아래 표 6에 나타내었다. 제조과정은 A상을 80℃로 가온하여 교반하고, B상을 80℃로 가온하여 용해하고 나서 A상에 투입 2000 rpm, 10분 정도 유화하였다. C상을 고르게 섞은 뒤 80℃에서 A + B상에 투입 2000 rpm, 5분 정도 중화하였다. 그리고 서서히 교반하면서 30℃로 냉각 pH 6.15를 완성하였다. 알로에(양성대조군)와 Scenedesmus sp. JD026 추출물은 각각 5 중량％의 양을 첨가하여 제조하였다.

< 제조예 3> 크림의 제조

크림을 제조하기 위한 성분구성은 아래 표 7에 나타내었다. 크림의 제조는 A상을 80℃로 가온하여 교반하고 B상을 80℃로 가온하여 용해하고 나서 A상에 투입하여 2000 rpm, 10분 정도 유화하였다. C상을 고르게 섞은 뒤 80℃에서 A + B상에 투입 2000 rpm, 5분 정도 중화하였다. 이어서, 서서히 고르게 혼합 교반하면서 30℃로 냉각하여 pH 6.23을 완성하였다. 알로에(양성대조군)와 Scenedesmus sp. JD026 추출물은 각각 5 중량％의 양을 첨가하여 제조하였다.

< 실험예 1> 활성 측정

1) 추출물에 의한 활성산소 분해 효과

본 발명에서 Scenedesmus sp. JD026 추출물에 의한 피부 미용 개선효과를 알아보기 위해 피부 노화에 주요한 역할을 하는 활성산소종이 (미세조류) 추출물에 의해 제거되는지 확인하였다.

Scenedesmus sp. JD026 추출물의 활성산소 분해 효과를 확인하기 위하여 자유라디칼인 DPPH(1, 1-diphenyl-2-picryl hydrazyl)를 이용한 자유라디칼 소거활성 측정방법을 이용하였다. 시험관에 4㎖ 메탄올을 넣고 (미세조류) 추출물을 농도별로 첨가한 다음 0.15mM DPPH 용액 1㎖를 첨가하여 실온에서 30분간 반응시킨 뒤 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 기질과 DPPH가 없는 Initial(Ai)과 blank(Ab)를 측정하였고, RC50(mg/l)은 추출물을 첨가하지 않은 대조군의 값을 50% 감소시키는 추출물의 농도를 나타냈으며, 양성대조군은 α-tocopherol 및 BHA를 상호 비교하였다.

분석결과, 양성대조군인 α-tocopherol 과 BHA보다 낮은 RC50을 나타냈다. 따라서 Scenedesmus sp. JD026 추출물에 의해 활성산소의 분해가 촉진되는 것으로 피부미용 개선에 효과가 있음을 확인하였다(표 8, 도 4).

2) Scenedesmus sp . JD026 추출물에 의한 인간진피섬유아세포의 생장 촉진 효과

Scenedesmus sp. JD026 추출물에 의한 피부 개선효과를 알아보기 위해 진피의 구성성분인 콜라겐을 합성하는 섬유아세포 생장이 (미세조류) 추출물에 의해 촉진되는지 확인하였다. 인간진피섬유아세포(normal Human Dermal Fibroblasts, nHDF)는 Lonza(Switzerland)에서 구매하여 사용하였다. 세포배양액은 Dulbeco's Modified Eagle's Medium(DMEM; Gibco, USA)에 10% fetal bovine serum(FBS; Gibco), 10% penicillin(100 unit/mL)과 streptomycin(100 g/mL)를 첨가하여 사용하였다. 배양조건은 37℃, 95% 습도, 5% CO₂ incubator에서 배양하였으며, 3-10세대 사이의 세포를 실험에 사용하였다. 인간진피섬유아세포인 nHDF 세포에 (미세조류) 추출물을 처리하였을 때, 세포독성이 어느 정도 발생되는지 확인하기 위하여 (미세조류) 추출물을 농도로 처리 후에 24시간 동안 세포를 배양하였고, 이후 세포의 MTT을 이용하여 viability를 측정하였다.

분석 결과, 추출 용매에 따라 진피섬유아세포의 성장에 미치는 효과가 상의하였지만 모든 Scenedesmus sp. JD026 추출물을 처리 후 농도의존적으로 세포의 성장이 대조군(무처리군)에 비해서 증가한 것을 확인할 수 있다(표 9, 도 5).

3) Scenedesmus sp . JD026 추출물에 의한 Col1A1의 발현 증가 및 MMP1의 발현 감소

본 발명자들은 Scenedesmus sp. JD026 추출물에 의한 피부미용 개선 효과를 알아보기 위해 인간진피섬유아세포가 발현하는 대표적인 콜라겐(collagen) 중 하나인 COL1A1 및 콜라겐 분해효소인 MMP1의 발현 변화를 측정하였다. (미세조류) 추출물에 의한 collagen 발현 변화 정도를 확인하기 위하여 인간 진피섬유아세포에 미세조류 추출물을 농도로 처리한 후, 24시간 배양하였다. 이후, 유전자 발현 변화는 polymerase chain reaction(PCR) 과정중에 증폭되는 DNA 산물에 형광물질을 붙이고 형광물질을 지속적으로 검출하는 방식인 quantitative real time PCR(qRT-PCR)로 측정하였다(Higuchi et al., 1992). A. obliquus JD026 추출물에 의한 COL1A1과 MMP1 유전자 발현 변화를 정량적으로 확인하기 위하여 PCR 산물이 발산하는 형광값을 통하여 결과값을 확인하는 방식으로 SYBR green Ⅰ(Invitrogen)을 사용하였다. PCR tube에 0.2μM primers, 50 mM KCl, 20 mM Tris/HCl pH 8.4, 0.8 mM dNTP, 0.5U Extaq DNA polymerase, 3 mM MgCl₂, 1×SYBR green을 혼합 하여 반응액을 제조하였다. 반응액을 제조 후 Linegene K(BioER, China)를 이용하여 94℃에서 3분 동안 primary denaturation 한 후 denaturation, annealing, polymerization을 각각 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초로 총 40 cycle을 수행하였고, 매 cycle 이 끝난 후 형광강도를 측정하였다. PCR 결과는 각 결과별 melting curve로 검증하였다. 각 유전자의 threshold cycle (Ct)값을 β-actin의 Ct값으로 표준화한 후, Ct값의 변화량을 비교하여 분석하였다. Ct값은 PCR 산물에 의해 발생하는 형광의 양(증폭된 PCR 산물의 수)이 기본 값 이상의 일정한 기준 값에 도달했을 때의 cycle 수로서 Ct값을 통하여 유전자 발현량을 확인할 수 있다. 실험에 사용한 각 유전자의 아래의 표 10과 같다.

분석 결과, 추출방법에 따라 MMP1 mRNA의 발현에 미치는 효과가 상의하였지만 모든 Scenedesmus sp. JD026 추출물을 처리 후 농도의존적으로 MMP1 mRNA의 발현이 대조군에 비해서 감소한 것을 확인할 수 있다. 양성 대조군인 1 μM Retinoic acid에 의해서 감소된 MMP1 mRNA의 발현과 비교하였을 때 (미세조류) 추출물은 유사한 효과를 보임을 확인하였다(표 11, 도 6). 또한 그림에서 나타낸 것과 같이 추출방법에 따라 Col1A1 mRNA의 발현에 미치는 효과가 상의하였지만 모든 Scenedesmus sp. JD026 추출물을 처리 후 농도의존적으로 Col1A1 mRNA의 발현이 대조군에 비해서 증가한 것을 확인할 수 있다. 양성 대조군인 10 ng/ml TGF-β에 의해서 증가된 Col1A1 mRNA의 발현과 비교하였을 때 (미세조류) 추출물은 유사한 효과를 보임을 확인하였다(표 12, 도 7).

4) Scenedesmus sp . JD026 추출물에 의한 면역세포의 생장 억제 효과

Scenedesmus sp. JD026 추출물에 의한 피부 미용 개선효과를 알아보기 위해 피부의 염증과 홍반에 작용하는 마우스 면역세포(mouse macrophage, RAW 264.7) 생장이 (미세조류) 추출물에 의해 억제되는지 확인하였다. 마우스 면역세포(mouse macrophage, RAW 264.7)는 한국세포주은행(KCTC, korea)에서 구매하여 사용하였다. 세포배양액은 Dulbeco's Modified Eagle's Medium(DMEM; Gibco, USA)에 10% fetal bovine serum(FBS; Gibco), 10% penicillin(100 unit/mL)과 streptomycin(100 g/mL)를 첨가하여 사용하였다. 배양조건은 37℃, 95% 습도, 5% CO2 incubator에서 배양하였으며, 3-10세대 사이의 세포를 실험에 사용하였다. 마우스 면역세포인 RAW 264.7 세포에 (미세조류) 추출물을 처리하였을 때, 세포독성이 어느 정도 발생되는지 확인하기 위하여 미세조류 추출물을 각각의 농도로 처리 후에 24시간 동안 세포를 배양하였고, 이후 세포의 viability를 측정하였다.

분석 결과, 추출방법에 따라 면역세포인 Raw264.7의 성장에 미치는 효과가 상의하였지만 모든 Scenedesmus sp. JD026 추출물을 처리 후 농도의존적으로 세포의 성장이 대조군(무처리군)에 비해서 증가한 것을 확인할 수 있다(표 13, 도 8).

5) Scenedesmus sp . JD026 추출물에 의한 NF - kB 전사 억제 효과

본 발명자들은 Scenedesmus sp. JD026 추출물에 의한 피부 미용 개선효과를 알아보기 위해 면역반응에서 중요한 역할을 하는 사이토카인의 전사요인인 NF-kB의 전사능력이 (미세조류) 추출물에 의해 억제되는지 확인하였다.

면역세포에 Scenedesmus sp. JD026 추출물을 처리하였을 때 NF-kB 전사능력이 어느 정도 억제되는지 확인하기 위하여 NF-kB reporter assay를 진행하였다. NF-kB에 의하여 전사가 진행된다고 알려진 유전자의 promoter region을 luciferase 유전자가 포함된 벡터에 클로닝하여 면역세포에 삽입시켰다. 그 후에 NF-kB 전사를 유도하는 LPS를 처리하여 NF-kB 전사능력을 활성화시킨 뒤 Scenedesmus sp. JD026 추출물을 각각의 농도로 처리 후에 luciferase 활성을 측정하였다. Luciferase 활성은 IgGκ chain 유전자의 NF-κB binding site인 IgGκ-NF-κB site(sequence 5'-GGGGACTTTCC-3'; 서열번호 15) oligonucleotide가 minimal IL-8 promoter(position -67 to +44)의 상류(upstream)에 위치하도록 구축된 luciferase reporter gene construct를 이용하였으며, lipofectamine plus(Gibco-BRL)를 이용하여 시약 매뉴얼에 따라 유전자를 면역세포에 삽입시켰다. 유전자가 삽입된 면역세포에 LPS를 처리하여 NF-kB의 전사능력을 활성화 시킨 뒤, (미세조류) 추출물을 0, 1, 10, 100 ㎎/ℓ의 농도로 처리한 후, 24시간 배양하였다. 배양된 면역세포는 harvest 시점에서 0.1 ml의 lysis buffer(0.1 M HEPES, pH 7.6, 1% Triton-X, 1 mM DTT and 2 mM EDTA)를 직접 첨가하여 cell lysate를 harvest한 후 섭씨 4도에서 10분간 14,000 rpm으로 원심분리하여 세포 단백을 얻었다. Bradford assay(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)를 이용하여 단백 농도를 측정한 후 20 μg의 단백질을 luciferase assay mix(25 mM glycylglycine, 15 mM MgSO4, 1 mg/ml bovine serum albumin(BSA), 5 mM ATP and 1 mM D-luciferin(Analytical Luminescence Laboratory, San Diego, CA))에 첨가한 후 Monolight 2010(Analytical Luminescence Laboratory)을 이용하여 20초간 luminescence를 3회 반복 측정하여 평균값을 얻어 결정하였다.

분석 결과, 추출방법에 따라 LPS에 의해서 증가된 NF-κB의 transactivity (luciferase activity)에 미치는 효과가 상이하였지만 모든 Scenedesmus JD026 추출물을 처리 후 농도의존적으로 LPS에 의해서 증가된 NF-κB의 transactivity가 LPS처리군에 비해서 감소한 것을 확인할 수 있다. 양성 대조군인 10 μg/ml L-NMMA에 의해서 감소된 NF-κB의 transactivity와 비교하였을 때 Scenedesmus JD026 추출물은 유사한 효과를 보임을 확인하였다.

6) Scenedesmus sp . JD026 추출물에 의한 염증성 사이토카인 합성 억제 효과

본 발명자들은 Scenedesmus sp. JD026 추출물에 의한 피부 미용 개선효과를 알아보기 위해 면역반응을 유도하는 염증성 사이토카인의 합성이 Scenedesmus sp. JD026 추출물에 의해 억제되는지 확인하였다.

Scenedesmus sp. JD026 추출물에 의한 염증성 사이토카인의 발현 변화 정도를 확인하기 위하여 LPS(lipopolysaccharide)를 처리한 면역세포에 Scenedesmus sp. JD026 추출물을 각각의 농도로 처리한 후, 24시간 배양하였다. 이후, 유전자 발현 변화는 polymerase chain reaction(PCR) 과정중에 증폭되는 DNA 산물에 형광물질을 붙이고 형광물질을 지속적으로 검출하는 방식인 quantitative real time PCR(qRT-PCR)로 측정하였다(Higuchi et al., 1992). Scenedesmus sp. JD026 추출물에 의한 IL-1β 와 TNF-α 유전자 발현 변화를 정량적으로 확인하기 위하여 PCR 산물이 발산하는 형광값을 통하여 결과값을 확인하는 방식으로 SYBR green Ⅰ(Invitrogen)을 사용하였다. PCR tube에 0.2μM primers, 50 mM KCl, 20 mM Tris/HCl pH 8.4, 0.8 mM dNTP, 0.5U Extaq DNA polymerase, 3 mM MgCl2, 1×SYBR green을 혼합 하여 반응액을 제조하였다. 반응액을 제조 후 Linegene K(BioER, China)를 이용하여 94℃에서 3분 동안 primary denaturation 한 후 denaturation, annealing, polymerization을 각각 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초로 총 40 cycle을 수행하였고, 매 cycle 이 끝난 후 형광강도를 측정하였다. PCR 결과는 각 결과별 melting curve로 검증하였다. 각 유전자의 threshold cycle (Ct)값을 β-actin의 Ct값으로 표준화한 후, Ct값의 변화량을 비교하여 분석하였다. Ct값은 PCR 산물에 의해 발생하는 형광의 양(증폭된 PCR 산물의 수)이 기본 값 이상의 일정한 기준 값에 도달했을 때의 cycle 수로서 Ct값을 통하여 유전자 발현량을 확인할 수 있다. 실험에 사용한 각 유전자의 primer는 아래 표와 같다. 양성대조군은 L-NG-Monomethylarginine, Acetate Salt(L-NMMA)를 사용하였다.

분석 결과, 추출방법에 따라 LPS에 의해서 증가된 TNFα mRNA의 발현에 미치는 효과가 상의하였지만 모든 Scenedesmus sp. JD026 추출물을 처리 후 농도의존적으로 LPS에 의해서 증가된 TNFα mRNA의 발현이 LPS처리군에 비해서 감소한 것을 확인할 수 있다. 양성 대조군인 10 μg/ml L-NMMA에 의해서 감소된 TNFα mRNA의 발현과 비교하였을 때 Scenedesmus sp. JD026 추출물은 유사한 효과를 보임을 확인하였다(표 16, 도 10).

또한 추출방법에 따라 LPS에 의해서 증가된 IL-1β mRNA의 발현에 미치는 효과가 상의하였지만 모든 Scenedesmus sp. JD026 추출물을 처리 후 농도의존적으로 LPS에 의해서 증가된 IL-1β mRNA의 발현이 LPS처리군에 비해서 감소한 것을 확인할 수 있다. 양성 대조군인 10 μg/ml L-NMMA에 의해서 감소된 IL-1β mRNA의 발현과 비교하였을 때 Scenedesmus sp. JD026 추출물은 유사한 효과를 보임을 확인하였다(표 17, 도 11).

7) Scenedesmus sp . JD026 추출물에 의한 피부 유수분 지수 변화

본 발명자들은 Scenedesmus sp. JD026 추출물에 의한 피부 미용 개선효과를 알아보기 위해 corneometer와 sebumeter를 이용하여 피부 유수분을 분석하였다.

먼저, Scenedesmus sp. JD026 추출물이 피부 유수분 개선에 미치는 영향을 확인하기 위하여 30세 이상의 성인 여성 30명을 선별하여 상기 제조한 제조예 1 및 3의 크림과 토너를 사용하도록 하였다. 각각 2주, 4주간 크림 및 토너를 사용한 뒤 피부 수분지수를 corneometer(MPA5, Courage-Khazaka Electronic GmbH, Cologne, Germany)를 사용하여 기기 매뉴얼에 따라 측정하였다. Corneometer를 이용해 동일한 시험담당자가 피시험자의 측정부위인 우측 볼부위를 3회 연속하여 측정하였다. 피부 유분지수는 sebumeter(MPA5, Courage-Khazaka Electronic GmbH, Cologne, Germany)를 사용하여 기기 매뉴얼에 따라 측정하였다. Sebumeter를 이용해 동일한 시험담당자가 피시험자의 측정부위인 이마부위를 측정하였다.

분석 결과, 추출방법에 따라 피부의 수분에 미치는 효과가 상의하였지만 모든 Scenedesmus sp. JD026 추출물을 처리 후 시간의존적으로 피부 수분이 대조군(무처리군)에 비해서 증가하였고, 또한 양성대조군인 Aloe보다 높게 증가한 것을 확인할 수 있다(표 18, 도 12). 또한 유분의 경우도 추출방법에 따라 피부의 유분에 미치는 효과가 상의하였지만 모든 Scenedesmus sp. JD026 추출물을 처리 후 농도의존적으로 피부 수분이 대조군(무처리군)에 비해서 증가하였고, 또한 양성대조군인 Aloe보다 높게 증가한 것을 확인할 수 있다(표 19, 도 13).

8) Scenedesmus sp . JD026 추출물에 의한 피부 주름 개선효과

본 발명자들은 Scenedesmus sp. JD026 추출물에 의한 피부주름 개선 효과를 확인하기 위하여 피부 분석기를 이용하여 피부주름을 분석하였다. 먼저, Scenedesmus sp. JD026 추출물이 피부주름 개선에 미치는 영향을 확인하기 위하여 30세 이상의 성인 여성 30명을 선별하여 상기 제조한 제조예 1 및 3의 크림과 토너를 사용하도록 하였다. 상기 크림 및 토너를 각각 2주, 4주간 사용한 뒤 안면 주름 정도를 PRIMOS Lite(field of view 18×13-simple, flexible 3D measuring, GFMesstechnik GmbH, Germany)을 사용하여 기기 매뉴얼에 따라 측정하였다. PRIMOS Lite를 이용해 동일한 시험담당자가 피시험자의 얼굴을 특수 제작된 PRIMOS 안면고정장비세트에 얼굴을 고정하고, 측정의 재현성을 위해 측정 부위인 눈꼬리 끝부위가 PRIMOS Lite의 포커스 패턴과 맞도록 조정 후 측정하였다.

분석 결과, 같이 추출방법에 따라 눈꼬리 주름에 미치는 효과가 상의하였지만 모든 Scenedesmus sp. JD026 추출물을 처리 후 시간의존적으로 눈꼬리 주름이 대조군(무처리군)에 비해서 감소하였고, 또한 양성대조군인 Aloe보다 더 감소한 것을 확인할 수 있다(도 14, 표 20).

9) Scenedesmus sp . JD026 추출물에 의한 피부 두께 개선효과

Scenedesmus sp. JD026 추출물에 의한 진피섬유아세포의 증식 증가 및 콜라겐의 발현 증가를 확인하였다. 본 발명자들은 이에 따라 생성된 콜라겐에 의해 진피층의 두께가 증가하는지를 분석하여 Scenedesmus sp. JD026 추출물에 의한 피부 두께 개선효과를 확인하였다.

먼저, Scenedesmus sp. JD026 추출물이 피부 두께에 미치는 영향을 확인하기 위해 30세 이상의 성인 여성 30명을 선별하여 상기 제조한 제조예 1 및 3의 크림과 토너를 사용하도록 하였다. 상기 크림 및 토너를 각각 2주, 4주간 사용한 뒤 DUB-Skin Scanner (tpm taberna pro medicum, Germany)를 사용하여 기기 매뉴얼에 따라 측정하였다. DUB-Skin Scanner에 초음파 검사용 젤을 바르고 Probe를 피부와 직각이 되도록 한 후 동일한 시험담당자가 피시험자의 안면 우측눈가에 동일한 압으로 눌러 측정하였다.

분석 결과, 추출방법에 따라 피부 두께에 미치는 효과가 상의하였지만 모든 Scenedesmus sp. JD026 추출물을 처리 후 시간의존적으로 피부 두께가 대조군(무처리군)에 비해서 증가하였고, 또한 양성대조군인 Aloe보다 높게 증가한 것을 확인할 수 있다(표 21, 도 15).

10) Scenedesmus sp . JD026 추출물에 의한 피부 탄력 개선효과

본 발명자들은 Scenedesmus sp. JD026 추출물에 의한 피부 미용 개선효과를 알아보기 위해 피부 탄력 개선효과를 확인하였다. Scenedesmus sp. JD026 추출물이 피부 탄력에 미치는 영향을 확인하기 위해 30세 이상의 성인 여성 30명을 선별하여 상기 제조한 제조예 1 및 3의 크림과 토너를 사용하도록 하였다. 상기 크림 및 토너를 각각 2주, 4주간 사용한 뒤 피부 탄력의 변화정도를 DermaLab USB elasticity probe(DermaLab USB elasticity probe)로 측정하였다. DermaLab USB elasticity probe는 측정 부위 흡입과 흡입시간 지속에 따른 피부 변화와 복원력을 수치로 나타내며, 동일한 시험담당자가 probe를 테이프로 왼쪽 볼부위에 고정 후 3회 반복하여 측정하였다.

분석 결과, 추출방법에 따라 피부의 탄력에 미치는 효과가 상의하였지만 모든 Scenedesmus sp. JD026 추출물을 처리 후 시간의존적으로 피부의 탄력이 대조군(무처리군)에 비해서 증가하였고, 또한 양성대조군인 Aloe보다 높게 증가한 것을 확인할 수 있다(표 22, 도 16).

11) Scenedesmus sp . JD026 추출물에 의한 피부 장벽 개선효과

본 발명자들은 Scenedesmus sp. JD026 추출물에 의한 피부 미용 개선효과를 알아보기 위해 피부 장벽 개선효과를 확인하였다. 먼저, Scenedesmus sp. JD026 추출물이 피부 장벽 개선에 미치는 영향을 확인하기 위하여 30세 이상의 성인 여성 30명을 선별하여 상기 제조한 제조예 1 및 3의 크림과 토너를 사용하도록 하였다. 상기 크림 및 토너를 각각 2주, 4주간 사용한 뒤 표피수분손실량(TEWL: TransEpidermal Water Loss)을 수분손실측정기인 DermaLab USB TEWL probe(Cortex Technology, Inc., Denmark)를 이용하여 기기의 매뉴얼에 따라 측정하였다.

분석 결과, 추출방법에 따라 경피수분 손실량에 미치는 효과가 상의하였지만 모든 Scenedesmus JD026 추출물을 처리 후 시간의존적으로 경피수분 손실량이 대조군(무처리군)에 비해서 감소하였고, 또한 양성대조군인 Aloe보다 높게 감소한 것을 확인할 수 있다(표 23, 도 17).

12) Scenedesmus sp . JD026 추출물에 의한 피부결 개선효과

본 발명자들은 Scenedesmus sp. JD026 추출물에 의한 피부 미용 개선효과를 알아보기 위해 피부결 개선효과를 확인하였다. 먼저, Scenedesmus sp. JD026 추출물이 피부결 개선에 미치는 영향을 확인하기 위하여 30세 이상의 성인 여성 30명을 선별하여 상기 제조한 제조예 1 및 3의 크림과 토너를 사용하도록 하였다. 상기 크림 및 토너를 각각 2주, 4주간 사용한 뒤 피부결 정도를 PRIMOS Lite(field of view 45×30-simple, flexible 3D measuring, GFMesstechnik GmbH, Germany)을 사용하여 기기 매뉴얼에 따라 측정하였다. PRIMOS Lite를 이용해 동일한 시험담당자가 피시험자의 이마부위를 3회 연속하여 측정하여 동일한 부위를 측정하였다.

분석 결과, 추출방법에 따라 피부결에 미치는 효과가 상의하였지만 모든 Scenedesmus sp. JD026 추출물을 처리 후 시간의존적으로 피부결 결정하는 피부에 생성된 주름의 깊이가 대조군(무처리군)에 비해서 감소하였고, 또한 양성대조군인 Aloe보다 더 감소한 것을 확인할 수 있다(표 24, 도 8).

13) Scenedesmus sp . JD026 추출물에 의한 홍반 개선효과

본 발명의 Scenedesmus sp. JD026 추출물에 의한 면역세포의 증식억제 및 염증성 사이토카인의 발현 감소를 실험을 통해 확인하였다. 본 발명자들은 이에 따라 감소된 사이토카인에 의해 홍반이 감소하는지 여부를 분석하여 Scenedesmus sp. JD026 추출물의 홍반 개선효과를 확인하였다.

먼저, Scenedesmus sp. JD026 추출물이 홍반 개선에 미치는 영향을 확인하기 위하여 30세 이상의 성인 여성 30명을 선별하여 상기 제조한 제조예 1 및 3의 크림과 토너를 사용하도록 하였다. 상기 크림 및 토너를 각각 2주, 4주간 사용한 뒤 분광광도계(Spectrophotometer CR-2600D, Konica Minolta, Japan)을 사용하여 기기 매뉴얼에 따라 측정하였다. 동일한 시험담당자가 피시험자의 우측 볼부위를 3회 연속으로 측정하여 그에 대한 평균값을 계산하여 분석에 사용하였다. 분광광도계에서 측정되는 값은 L*, a*, b*이며 a*값이 홍반을 나타내는 값으로 증가할수록 붉은기가 많은 상태를 나타낸다.

분석 결과, 그림에서 추출방법에 따라 홍반에 미치는 효과가 상의하였지만 모든 Scenedesmus sp. JD026 추출물을 처리 후 시간의존적으로 홍반이 대조군(무처리군)에 비해서 감소하였고, 또한 양성대조군인 Aloe보다 더 홍반이 감소한 것을 확인할 수 있다(도 19, 표 25).

14) Scenedesmus sp . JD026 추출물에 의한 색소침착 개선효과

본 발명자들은 Scenedesmus sp. JD026 추출물에 의한 피부 미용 개선효과를 알아보기 위해 색소침착 개선효과를 확인하였다. 먼저, Scenedesmus sp. JD026 추출물이 색소침착 개선에 미치는 영향을 확인하기 위하여 30세 이상의 성인 여성 30명을 선별하여 상기 제조한 제조예 1 및 3의 크림과 토너를 사용하도록 하였다. 상기 크림 및 토너를 각각 2주, 4주간 사용한 뒤 ANTERA 3D(Miravex, Ireland)를 사용하여 기기 매뉴얼에 따라 측정하였다. 동일한 시험담당자가 왼쪽 볼부위를 3회 연속으로 동일부위를 측정하여 분석에 사용하였다.

분석 결과, 추출방법에 따라 색소침착에 미치는 효과가 상의하였지만 모든 Scenedesmus sp. JD026 추출물을 처리 후 시간의존적으로 색소침작면적이 대조군(무처리군)에 비해서 감소하였고, 또한 양성대조군인 Aloe보다 더 색소침작면적이 감소한 것을 확인할 수 있다(표 26, 도 20).

한국생명공학연구원 KCTC18353P 20150127

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> COMPOSITION FOR SKIN EXTERNAL APPLICATION COMPRISING EXTRACT OF SCENEDESMUS SP. <130> P15R16D0021 <160> 21 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Green Algae_ch165F <400> 1 cgacttctgg aagggacgta 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Green Algae_ch1200R <400> 2 gagtcaaatt aagccgcagg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Green Algae_ch1155F <400> 3 cctgcggctt aatttgactc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Green Algae_ch1780R <400> 4 ctaggtggga gggtttaatg 20 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyanobacteria_27F <400> 5 gagtttgatc ctggctcag 19 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyanobacteria_1542R <400> 6 agaaaggagg tgatccagcg 20 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Diatom_D514F <400> 7 attccagctc caatagcg 18 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Diatom_D987R <400> 8 gactacgatg gtatctaatc 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin_Forward primer <400> 9 ggattcctat gtgggcgacg a 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin_Reverse primer <400> 10 ggattcctat gtgggcgacg a 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COL1A1_Forward primer <400> 11 agggccaaga cgaagacatc 20 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COL1A1_Reverse primer <400> 12 agatcacgtc atcgcacaac a 21 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP1_Forward primer <400> 13 tctgacgttg atcccagaga gcag 24 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP1_Reverse primer <400> 14 cagggtgaca ccagtgactg cac 23 <210> 15 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgGk-NF-kB site <400> 15 ggggactttc c 11 <210> 16 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin_1-Forward primer <400> 16 ccaaggccaa ccgccgc 17 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin_1-Reverse primer <400> 17 agggtacatg gtgccgcc 18 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1beta-Forward primer <400> 18 ctcaatggac agaatatcaa ccaaca 26 <210> 19 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1beta-Reverse primer <400> 19 acaggacagg tatagattct ttcctttg 28 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha-Forward primer <400> 20 tgcctatgtc tcagcctctt c 21 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha-Reverse primer <400> 21 gaggccattt gggaacttct 20

Claims (6)

1. 세네데스무스 속(Scenedesmus sp.) 미세조류의 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물.　
   
2. 제1항에 있어서, 상기 세네데스무스 속 미세조류는 Scenedesmus sp. JD026(KCTC18353P)인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 주름개선, 세포성장촉진, 콜라겐 합성 촉진, 피부 탄력 증진, 보습, 피부결 개선, 피부 홍반 감소, 색초 침착 개선 또는 미백용임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 추출물은 C1-C4의 저급 알코올, 헥산, 에틸아세테이트, 물 또는 이들의 혼합물을 용매로 사용하여 추출된 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.　
   
5. 제4항에 있어서, 상기 저급 알코올은 메탄올 또는 에탄올인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.　
   
6. 제1항에 있어서, 상기 조성물이 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 샴푸, 수중유(O/W)형 또는 유중수(W/O)형으로부터 선택된 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   

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