KR20190067701A

KR20190067701A - 갈근초 및 아데노신을 포함하는 피부 노화 방지 또는 주름 개선용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20190067701A
Application number: KR1020180154928A
Authority: KR
Inventors: 김영미
Original assignee: 김영미
Priority date: 2017-12-07
Filing date: 2018-12-05
Publication date: 2019-06-17
Also published as: KR102052001B1

Abstract

본 발명은 갈근초 및 아데노신을 포함하는 피부 노화 방지 또는 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 피부에 안전하면서도 갈근초 및 아데노신을 동시 처리함에 따른 피부 노화 억제, 주름 개선 또는 피부탄력 개선 효과가 뛰어나다.

Description

갈근초 및 아데노신을 포함하는 피부 노화 방지 또는 주름 개선용 화장료 조성물{Cosmetic composition for skin anti-aging or improving skin wrinkle comprising Kudzu root vinegar and adenosine}

본 발명은 갈근초 및 아데노신을 포함하는 피부 노화 방지 또는 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부 노화는 크게 내인성 피부 노화와 외인성 피부 노화로 나눌 수 있다. 내인성 피부 노화는 시간이 지남에 따라 발생하는 자연적인 노화 현상으로 피부에 잔주름, 피부 건조, 탄력 감소 등으로 나타난다. 외인성 피부 노화는 자외선, 오염, 혹한 날씨, 담배 연기 등과 같은 외부 요인에 따라 발생하는 노화 현상으로 자외선으로 인한 광노화가 대표적이다. 광노화는 얼굴, 목덜미, 손등 등 햇볕에 주로 노출되는 부위에서 많이 나타나며 굵고 깊은 주름, 피부 탄력 감소, 색소 침착증 등을 비롯한 증상을 야기한다. 내인성 노화와 비교할 때, 외인성 노화(광노화)는 그 현상이 심하고 내인성 효과를 촉진시킨다는 것이 특징이다.

천연 발효 갈근초는 칡뿌리 농축액에서 발효과정을 거쳐 생성되며, 상기 칡뿌리 농축액은 콩보다 300배 이상 농축된 이소플라본이 함유되어 있다. 칡뿌리 농축액을 발효시키면 다양한 유기산이 생성되는데 갈근초(Kudzu vinegar)는 천연 아세트산으로 피부 각질을 탈락시켜 피부를 안전하게 필링하며 새로운 피부층으로의 대체를 신속하게 해준다. 이에 자사에서는 핑크필(Pink Peel)이라는 이름으로 주름 개선에 도움을 주는 천연 리프팅 필링제를 출시한 바 있으며, 해당 제품은 갈근 액기스인 kudzu-THERA를 사용한다. 천연 발효 갈근초를 이용한 주름 개선용 화장료 조성물은 자사 제품이 유일하다.

피부관리, 특히, 안티에이징에 대한 관심이 폭발적으로 증가하고 있는 현 시점에서, 장기적으로 사용가능하며 정상 피부의 손상이 적어 피부에 안전하고 주름 개선 효과가 우수한 화장료 원료를 천연물 소재로부터 개발할 필요가 있다.

이에, 본 발명자들은 자사의 핑크필을 개선시킨 피부 노화 방지 또는 주름 개선용 화장료 조성물을 연구하던 중, 천연 발효 갈근초와 함께 아데노신을 포함하는 화장료 조성물의 피부 노화 방지 또는 주름 개선 효과가 뛰어남을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 갈근초 및 아데노신을 포함하는 피부 노화 방지 또는 주름 개선용 화장료 조성물을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 갈근초 및 아데노신을 포함하는 피부 노화 방지 또는 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 갈근초 및 아데노신을 포함하는 피부 노화 방지 또는 주름 개선용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 갈근초 및 아데노신을 포함하는 피부 노화 방지 또는 주름 개선용 의약외품을 제공한다.

본 발명은 피부에 안전하면서도 갈근초 및 아데노신을 동시 처리함에 따른 피부 노화 억제, 주름 개선 또는 피부탄력 개선 효과가 뛰어나다.

도 1은 갈근초의 제조 방법 모식도를 나타낸 도이다.
도 2는 갈근초 단독 처리에 따른 세포 생존율 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 아데노신 단독 처리에 따른 자외선 조사 전후 세포 생존율 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 갈근초 및 아데노신의 혼합물 처리에 따른 자외선 조사 전후 세포 생존율 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 자외선 조사 전 갈근초 및 아데노신의 혼합물 처리에 따른 세포 보호효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 자외선 조사 후 갈근초 및 아데노신의 혼합물 처리에 따른 세포 보호효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 갈근초 및 아데노신 혼합물 처리에 따른 세포사멸 억제능 평가 결과를 나타낸 도이다(A: FACS 결과, B: 세포사멸 효과).
도 8은 갈근초 및 아데노신 혼합물 처리에 따른 세포 내 활성산소종(ROS) 제거능 평가 결과를 나타낸 도이다(A: DCF-DA 염색에 따른 형광 강도 측정 결과, B: RFU(Relative fluorescence unit)로 표시한 형광 강도).
도 9는 갈근초 및 아데노신 혼합물 처리에 따른 세포 노화 저해능 평가 결과를 나타낸 도이다(A: SA-β염색 결과, B: 대조군에 대한 β-galactosidase 형광 강도를 정량화한 결과).
도 10은 갈근초 및 아데노신 혼합물 처리에 따른 MAPKs 신호전달 경로의 억제능 평가 결과를 나타낸 도이다(A: 웨스턴 블롯 결과, B: p-JNK 인산화 정도를 정량화한 결과).
도 11은 갈근초 및 아데노신 혼합물 처리에 따른 MMP-9 발현 억제능 평가 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 본 발명의 갈근초 및 아데노신을 포함하는 화장료 조성물을 주름 피부에 임상 시험한 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 본 발명의 갈근초 및 아데노신을 포함하는 화장료 조성물을 주름 피부에 임상 시험한 결과를 나타낸 도이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 갈근초 및 아데노신을 포함하는 피부 노화 방지 또는 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 갈근초 및 아데노신을 포함하는 피부 노화 방지 또는 주름 개선용 화장료 조성물은 갈근초 및 아데노신을 병용 처리함에 따라 자외선에 의한 피부 손상, 세포 노화 및 세포 사멸을 억제하고, 피부 탄력을 증가시켜 주름 개선 효과가 뛰어난 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 용어 "피부 노화(skin aging)"는 내재적 및 외부요인에 의해 발생하는 피부의 노화를 말하며, 바람직하게는 피부주름 형성을 동반하는 피부 광노화(photoaging)일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 피부주름 형성을 동반하는 자외선 자극에 의한 피부 광노화일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 용어 "피부 주름(skin wrinkle)"는 피부 상에 형성된 주름(wrinkle formation on skin)을 말한다.

본 발명에 있어서, 상기 “갈근초”는 제조방법에 따라 발효식초 또는 합성식초일 수 있으며, 바람직하게는 발효식초일 수 있다. 상기 발효식초는 만드는 방법에 따라 천연 발효식초 또는 알코올 발효식초로 나뉘는데 천연 발효식초는 당을 발효시켜 술을 만든 후 그것을 다시 초산 발효시켜서 만드는 것을 의미하며, 알코올 발효식초는 순도 99% 이상의 에틸알코올을 원료로 하여 초산을 발효시킨 것을 의미하고, 본 발명의 갈근초는 바람직하게는 천연 발효식초인 것을 특징으로 할 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명에 따른 갈근초는 (a) 갈근을 세척하여 분쇄하는 단계; (b) 분쇄된 갈근 1 중량부에 대하여 물 1.8 내지 2.2 중량부를 혼합 후 압축하여 즙을 추출하는 단계; (c) 추출된 즙을 1차 여과하는 단계; (d) 상기 1차 여과된 갈근즙 1 중량부에 대하여 칡 녹말 0.12 내지 0.18 중량부와 누룩 0.08 내지 0.12 중량부를 첨가하여 혼합하고 20 내지 40℃의 온도에서 발효하는 단계; 및 (e) 상기 발효된 갈근즙을 2차 여과 후 효모를 첨가하여 20 내지 40℃의 온도에서 숙성시키는 단계;에 의하여 제조될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 (a) 갈근을 세척하여 분쇄하는 단계; (b) 분쇄된 갈근 1 중량부에 대하여 물 2 중량부를 혼합 후 압축하여 즙을 추출하는 단계; (c) 추출된 즙을 1차 여과하는 단계; (d) 상기 1차 여과된 갈근즙 1 중량부에 대하여 칡 녹말 0.15 중량부와 누룩 0.10 중량부를 첨가하여 혼합하고 30℃의 온도에서 1개월 동안 발효하는 단계; 및 (e) 상기 발효된 갈근즙을 2차 여과 후 효모를 첨가하여 30℃의 온도에서 숙성시키는 단계;에 의하여 갈근초를 제조하고 있으며, 상기 제조 과정은 도 1에 기술하였다.

본 발명에 있어서, 상기 갈근초는 전체 화장료 조성물 100 중량부에 대하여 10 내지 50중량부, 바람직하게는 20 내지 40중량부, 보다 바람직하게는 25 내지 35중량부로 포함될 수 있고, 상기 아데노신은 전체 화장료 조성물 100 중량부에 대하여 0.01 내지 0.10 중량부, 바람직하게는 0.02 내지 0.08중량부, 보다 바람직하게는 0.03 내지 0.05중량부로 포함되는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 갈근초 및 아데노신의 함량이 전술한 범위에 해당될 때, 세포독성 없이 피부 노화 방지 및 주름 개선 효과를 유의적으로 발휘할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 피부 노화 방지 또는 주름 개선용 화장료 조성물은 유기용매를 더 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 유기용매는 에탄올, 메탄올, 이소프로판올, 프로필렌 글리콜, 부틸렌글라이콜, 1,2-헥산디올, 글리세린 및 아세트산 에틸 에스테르로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 에탄올 또는 1,2-헥산디올일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 유기용매는 에탄올 및 1,2-헥산디올일 수 있으며, 전체 화장료 조성물에 100 중량부에 대하여 각각 에탄올 1 내지 5 중량부, 1,2-헥산디올 1 내지 5 중량부로 포함될 수 있고, 바람직하게는 각각 에탄올 1.5 내지 2.5 중량부, 1,2-헥산디올 1.5 내지 2.5 중량부로 포함될 수 있다.

또한, 본 발명에 의한 화장료 조성물은 상기 성분 이외에 일반적으로 피부 노화 방지 또는 주름 개선용 화장료 조성물 제조 시 통상적으로 사용하는 색소, 향, 방부제 및 기타 첨가제 등의 보조 성분을 더 포함할 수 있으며, 이들 보조 성분의 종류 및 함량은 당업자에게 주지되어 있으며, 당업자는 어려움 없이 이들을 선정 및 배합하여 사용할 수 있다. 또한 이들의 함량은 최종 제품의 용도 및 그 사용목적에 따라 적절히 조절될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 화장료 조성물은 전체 화장료 조성물 100 중량부에 대하여 갈근초 30 중량부, 아데노신 0.04 중량부, pH 조절제 8.30 중량부, 에탄올 2 중량부, 1,2-헥산디올 2 중량부, 판테놀 0.70 중량부, 점도조절제 0.54 중량부, 유화제 0.15 중량부, 색소 0.10 중량부 및 디소듐이디티에이 0.02 중량부 및 상기 혼합물의 총량이 100 중량부가 되도록 조절하는 잔량의 용매를 포함하는 조성일 수 있다. 이때 상기 용매는 당 업계에 알려진 통상적인 용매를 제한 없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 갈근수를 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 당 업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예컨대 화장수, 유액, 젤, 크림, 에센스, 팩, 앰플, 로션, 세정료, 비누, 바디제품류, 비누, 오일, 립스틱, 스프레이, 파우더 및 파운데이션에서 선택되는 어느 하나의 제형일 수 있다. 보다 상세하게는, 유연 화장수(스킨), 수렴화장수, 영양 화장수(밀크로션), 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형을 가질 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 매일 사용할 수 있으며 또한 정해지지 않은 기간 동안에도 사용할 수 있다. 바람직하게는 사용자의 연령, 피부상태 또는 피부타입에 따라 사용량, 사용횟수 및 기간을 적절히 조절할 수 있다.

상기 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및 희석제는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여용 고상 제제로 제형화할 경우, 경구 투여를 위한 고상 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되는데, 이러한 고상 제제는 상기 갈근초 및 아데노신의 혼합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 혼합하여 제형화된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여용 액상 제제로 제형화할 수도 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 이러한 액상 제제에는 통상적으로 사용되는 불활성 희석제(예를 들면, 정제수, GaIN/LPS, 리퀴드 파라핀) 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 비경구, 바람직하게는 복강내 투여를 위한 제제로 제형화될 수도 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 멸균된 수용액으로는 한스 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 적절한 완충용액을 이용할 수 있으며, 비수성용제로, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 이용될 수 있다. 필요에 따라 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제를 이용할 수도 있다. 한편, 좌제의 경우에는 이의 통상적인 기제인 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다. 상기와 같은 방법으로 제형화된 조성물은 유효량으로 비경구 또는 경구(경피, 피하, 정맥, 근육, 복강등)를 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 상기에서 "유효량"이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명에 따른 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 연령, 성별, 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 바람직하게는 0.1~10000 mg/체중kg/day, 보다 바람직하게는 10~1000mg/체중kg/day의 유효량으로 투여될 수 있다.

상기 의약외품이란 질병을 치료하거나 예방하기 위해 쓰는 의약품보다는 인체에 대한 작용이 경미한 물품에 대해 보건복지부가 따로 정한 분류 기준에 의한 약품을 지칭하는 것이다. 약사법에 따르면 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람ㆍ동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 섬유ㆍ고무 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않으며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염병을 막기 위한 살균ㆍ살충제 등이 포함될 수 있다.

이하, 하기의 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 예시의 목적으로 제공된 것일 뿐, 본 발명의 범주 및 범위가 이에 한정되지는 않는다.

실시예 1. 갈근초의 제조

본 발명에서 사용한 갈근초의 제조 방법 모식도를 도 1에 나타내었다.

먼저, 갈근을 세척하고 분쇄하여 이후 액화공정을 보다 용이하고 빠르게 진행시키기 위한 전처리 공정을 수행하였다. 상기 분쇄된 갈근 1 중량부에 대하여 물 2 중량부를 혼합하고 압축하여 갈근즙을 추출하였다. 이후, 추출된 갈근즙을 1차 여과시켰다. 1차 여과를 통해 얻은 갈근즙에 4:1로 혼합한 칡 녹말과 천연 누룩가루를 첨가하여 혼합하고 30℃에서 1개월 동안 발효시켰다. 상기 발효된 갈근즙을 2차 여과시킨 후, 효모를 첨가하여 30℃에서 숙성시켰다. 상기 과정을 거쳐 제조한 갈근초(이하, 실시예 또는 실험예에서 용어 “갈근초”는 “갈근”과도 혼용하여 사용하였다)를 이후 실시예에서 사용하였다.

실시예 2. 세포 배양

인간 각질형성 세포주인 HaCaT 세포를 ATCC로부터 분양 받아 이후 실험에서 사용하였다. 10% FBS(fetal bovine serum)와 1% 항생제(페니실린(penicillin) / 스트렙토마이신(streptomycin))를 첨가한 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium) 배지를 이용하여 상기 세포주를 5% CO₂가 존재하는 37℃ 인큐베이터에서 유지하며, 1주일에 2∼3회 계대 배양하였다.

실시예 3. 세포 생존율 측정

3-1. 갈근초 단독 처리

상기 실시예 2에서 계대 배양한 배지에 실시예 1에서 제조한 갈근초를 농도 별로 처리하여 배양하였다.

세포 생존율은 MTS(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt) 분석법으로 측정하였다. 구체적으로, 갈근초 처리군을 10, 50, 100, 200, 500μg/ml의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하고 MTS 염료를 처리하였다. 이때 살아있는 세포는 처리한 MTS 염료가 미토콘드리아에 있는 환원효소에 의해 자주색의 포르마잔을 생성하지만 사멸된 세포는 미토콘드리아가 기능을 하지 않기 때문에 포르마잔을 생성하지 못한다. 형성된 포르마잔을 마이크로플레이트 리더(precision microplate reader)로 490/590nm에서 흡광도를 측정하여 갈근초 처리가 세포 생존율에 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 갈근초를 10 내지 100μg/ml의 농도로 처리한 경우에는 세포 생존율에 별다른 영향이 없었으나, 200μg/ml의 농도로 처리한 경우 세포 생존율이 약 20%, 500μg/ml의 농도로 처리한 경우 세포 생존율이 약 30% 정도 감소함을 확인하였다. 이에, 갈근초를 200μg/ml 이상으로 처리시에는 세포 독성이 있는 것으로 판단하여 이후 실험에서는 갈근초 농도를 세포 독성이 10% 이하로 나타나는 100μg/ml까지로 제한하여 실험하였다.

3-2. 아데노신 단독 처리

상기 실시예 2에서 계대 배양한 배지에 아데노신을 농도 별로 처리하여 배양하고 아데노신 단독 처리에 따른 자외선 조사 전후의 세포 생존율을 분석하였다. 구체적으로, HaCaT 세포에 1, 10, 20, 50, 100 μM 아데노신을 각각 처리하여 24시간 동안 배양 후 세포 생존율을 측정하고, 동일 배지에 자외선 조사 후 동일 농도의 아데노신을 처리하여 24시간 동안 배양하고 세포 생존율을 측정하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 아데노신을 단독 처리한 경우 아데노신을 처리하지 않은 대조군(con)에 비해 세포 생존율에서 유의한 차이를 나타내지 않음을 확인하였다. 또한, 자외선을 조사한 후 아데노신을 처리한 결과에서도 세포 활성도에서 비처리구에 비해 유의한 차이가 나타나지 않는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통해 아데노신 단독 처리시 자외선 조사 전후 세포에 별다른 변화가 없음을 확인하였다.

3-3. 갈근초 및 아데노신 혼합물 처리

상기 실시예 2에서 계대 배양한 배지에 실시예 1에서 제조한 갈근초 및 아데노신의 혼합물을 각각 농도 별로 처리하여 추가로 배양하였다. 구체적으로, HaCaT 세포에 갈근초 10, 50 또는 100μg/ml(갈근초 단독 처리군), 상기 갈근초 및 50μM 또는 100μM 아데노신의 혼합물(갈근초 및 아데노신 혼합물 처리군)을 각각 처리하여 24시간 동안 배양 후 세포 생존율을 측정하였다. 이후, 동일 배지에 자외선을 조사하고 동일 농도 조건으로 갈근초 단독 또는 갈근초 및 아데노신 혼합물을 처리하여 24시간 동안 배양 후 세포 생존율을 측정하였다. 비처리군 또는 갈근초 단독 처리군을 대조군으로 하여 갈근초 및 아데노신의 혼합물 처리군과 세포 생존율(Cell viability)을 분석하고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 갈근초 및 아데노신 혼합물 처리군의 경우, 자외선 조사 후 세포 생존율이 대조군에 비해 농도 의존적으로 증가함을 확인하였다. 특히, 자외선을 조사하여 세포생존율이 약 35% 정도로 감소된 배지에 갈근초 100μg/ml 및 아데노신 100μM의 혼합물을 처리한 경우 세포 생존율이 대조군에 비하여 약 21% 정도 증가함을 확인하였다. 상기 결과를 통해, 본 발명의 갈근초 및 아데노신 혼합물은 세포 독성을 나타내지 않으며, 자외선에 대한 보호효과가 우수하고, 각질형성세포를 활성화시킴을 확인하였다. 이에, 이후 실험에서는 아데노신의 농도를 100μM로 하여 혼합한 갈근초 및 아데노신의 혼합물을 사용하였다.

실시예 4. 자외선 조사에 따른 세포 형태 관찰

UVB 조사에 의해 단백질, DNA, 지질막 등이 손상되어 세포사멸이 유도되는데, 이와 같은 세포 손상에 대한 갈근초와 아데노신의 세포 보호효과를 형태학적 관찰을 통해 확인하였다. 갈근초를 각각 20μg/ml 및 100μg/ml로 처리한 갈근초 단독 처리군 및 아데노신 100μM과 동일 농도의 갈근초를 병용 처리한 병용 처리군에 대하여 위상차 현미경으로 세포의 변화를 관찰하였다. UVB를 조사하지 않은 세포에 상기 갈근초 및 아데노신을 처리한 결과를 도 5에 나타내었고, UVB(30mJ/㎠)를 조사한 세포에 갈근초 및 아데노신을 처리한 결과를 도 6에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, UVB를 조사하지 않은 세포의 경우 갈근초 단독 처리군과 갈근초 및 아데노신 병용 처리군 모두 대조군과 비교하여 유의한 차이가 나타나지 않는 것으로 확인되었다. 반면, 도 6에 나타낸 바와 같이, UVB를 조사 한 경우 정상세포와는 달리 UVB로 유도된 손상으로 인한 세포의 형태 변화가 확인되었고, 갈근초 단독 처리군과 갈근초 및 아데노신 병용 처리군 모두에서 UVB로 인한 세포 자살이 진행중임을 확인하였다. 이 중 갈근초 100 μg/ml 및 아데노신 100 μM을 병용 처리하였을 때 세포 사멸로 인한 부산물도 가장 적고, UVB만 조사한 대조군과 비교할 때 세포의 수가 현저히 많고 세포의 형태도 많이 망가지지 않으며, 세포 생존율이 35% 증가함을 확인하였다. 상기 결과를 통해, 본 발명의 갈근초 및 아데노신 혼합물이 우수한 세포 보호효과를 나타냄을 확인하였다.

실시예 5. 세포사멸 억제능 평가

본 발명에 따른 갈근초 및 아데노신 혼합물의 자외선(UVB) 조사로 인한 세포사멸(apoptosis) 및 세포사(cell death)와의 직접적인 연관성을 확인하기 위하여, UVB 조사된 HaCaT 세포 및 FITC-conjugated annexin-V 검출 키트를 이용하여 FACS(Fluorescence-activated cell sorting) 분석을 수행하였다. 먼저, HaCaT 세포를 10% FBS가 있는 배지에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 2 × 10⁵ cells/well이 되도록 DMEM 배지로 희석하고 세포 현탁액을 6-웰 배양용기에 각 웰당 2ml씩 넣고 24시간 동안 배양하여 세포를 배양용기에 부착시켰다. 24시간 후 상기 실시예 3에서 사용한 갈근초 100μg/ml 및 아데노신 100μM의 혼합물을 처리하고, 다시 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, 세포를 PBS로 세척한 뒤, 100μl의 결합 버퍼(binding buffer)로 다시 부유시킨 후, annexin V-FITC 2μl를 첨가하여 암실에서 15분 동안 반응시켰다. 그 다음, FACS 버퍼 500μL 및 P.I(propium Iodide) 5μL를 첨가하여 유세포 분석기(flow cytometry (BD Biosciences, CA))를 이용하여 분석하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, HaCaT 세포에 UVB를 처리하였을 때 세포사멸은 약 30%까지 증가하였으나, 갈근초 및 아데노신 혼합물 처리군은 세포사멸이 15%로 감소한 것을 확인하였다. 이를 통해, 갈근초 및 아데노신 혼합물은 인간 피부세포에서 자외선에 의한 세포 사멸을 억제함으로써 피부노화 예방에 탁월한 효과를 나타냄을 확인하였다.

실시예 6. 세포 내에서 활성산소종 ( ROS ) 제거능 평가

본 발명에 따른 갈근초 및 아데노신 혼합물이 자외선(UVB) 조사로 인한 ROS(reactive oxygen species)의 양적 변화에 미치는 영향을 확인하기 위하여 DCF-DA(2'-7'dichlorofluorescin diacetate)를 이용하여 ROS 생성량을 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 5에서 배양용기에 부착시켜 준비한 HaCaT 세포에 상기 실시예 3에서 사용한 갈근초 100μg/ml 및 아데노신 100μM의 혼합물을 처리하고, 24시간 배양 후 PBS로 두 번 세척하였다. 그 다음, 배지를 DCF-DA 25μM이 첨가된 배지로 갈아주고 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 이를 다시 PBS로 두 번 세척하고 유세포 분석기(flow cytometry (BD Biosciences, CA))를 이용하여 분석하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 활성산소종은 UVB를 처리하지 않은 대조군(Control)에 비해 UVB만 처리한 대조군(UVB)에서 60% 정도 증가하였다. 반면, 갈근초 및 아데노신 혼합물 처리군(UVB+갈근+Adenosine)에서는 대조군에 비해 활성산소종 축적량이 27% 감소함을 확인하였다. 이를 통해, 본 발명의 갈근초 및 아데노신 혼합물의 ROS 제거 효과가 뛰어남을 확인하였다.

실시예 7. 세포 노화 저해능 평가

본 발명에 따른 갈근초 및 아데노신 혼합물의 자외선(UVB) 조사로 인한 세포 노화 저해능을 확인하기 위하여 노화 마커의 지표인 SA-βSenescence Associated-ß-galatoctosidase) 분석을 실시하였다(senescence detection kit; Biovision, USA).

구체적으로, 상기 실시예 5에서 배양용기에 부착시켜 준비한 HaCaT 세포에 실시예 3에서 사용한 갈근초 100μg/ml 및 아데노신 100μM의 혼합물을 처리하고, UVB 30 mJ/㎠를 조사한 후 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 배지를 제거하고 1ml PBS로 세척 후 고정 용액(fixing solution) 0.5ml를 첨가하여 상온에서 15분간 방치하여 고정화시켰다. 고정화된 HaCaT에 염색 용액 혼합액(staining solution 470μl, staining supplement 5μl, 20mg/ml X-gal in DMF(dimethylformamide) 25μl)을 0.5ml씩 첨가하고 37℃에서 24시간 동안 배양하여 세포 염색을 하였다. 이를 PBS로 세척한 후 형광현미경(fluorescence microscope (Olympus Co, Japan))을 통하여 염색된 세포 수를 측정하였다. 또한, 마이크로플레이트 리더를 사용하여 흡광도를 측정하고, 대조군에 대한 형광 강도(fluorescence intensity)를 분석하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.

노화된 세포일수록 β-galactosidase의 발현이 높기 때문에 염색된 세포 수를 비교하여 노화의 진행 정도를 확인할 수 있다. 도 9에 나타낸 바와 같이, UVB 처리 시 염색된 세포의 수가 많아 노화가 진행된 반면, 갈근초 및 아데노신 혼합물 처리군(UVB+갈근+Adenosine)에서는 세포노화가 현저히 억제됨을 확인하였다. 이를 통해, 자외선 조사 후 갈근초 및 아데노신 혼합물 처리 시 세포노화방지 효과가 뛰어남을 확인하였다.

실시예 8. MAPKs 신호전달 경로의 억제능 평가

본 발명에 따른 갈근초 및 아데노신 혼합물이 UVB에 의해 유도된 JNK MAPKs의 인산화에 미치는 효과를 확인하기 위하여 HaCaT 세포에 상기 혼합물을 처리하고 웨스턴 블롯을 수행하였다.

먼저, HaCaT 세포를 10% FBS가 있는 배지에서 24시간 동안 배양한 후, 상기 세포들을 1.5 × 10⁶ cells/well이 되도록 DMEM 배지로 희석하여 세포 현탁액을 100mm 배양용기에 10ml씩 넣고 24시간 동안 배양하여 세포를 배양용기에 부착시켰다. 24시간 후, 실시예 3에서 사용한 갈근초 100μg/ml 및 아데노신 100μM의 혼합물을 처리하고 UVB 30mJ/㎠를 조사한 다음 다시 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 세포를 PBS로 2~3회 세척한 뒤 lysis 버퍼를 첨가하여 30분 동안 용해시키고, 13,000 xg에서 원심분리 하여 세포막 성분 등을 제거하고 상등액만을 모아 단백질 분석 키트(bicinchoninic acid protein assay kit; Pierce Biotechnology, USA)를 사용하여 단백질을 정량하였다. 이후, 10% 러닝 젤(running gel)과 4.5% 스태킹 젤(stacking gel)을 이용하여 분리된 단백질 20~50μg에 대하여 SDS-PAGE 전기영동을 실시하였다(0.02 mA). 전기영동으로 분리한 단백질은 PVDF(polyvinylidene difluoride) 막과 트랜스퍼 버퍼(20% 메탄올, 25mM Tris, 192mM 글라이신)를 사용하여 100V에서 1시간 동안 막으로 이동시켰다. 단백질이 이동된 막은 5% skim milk 용액으로 1시간 동안 블로킹하였다.

JNK, p-JNK(Cell Signaling, USA) 및 GAPDH(Sigma, USA)에 대한 1차 항체를 1：1,000의 배율로 0.1% TBST(10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.5 및 10% Tween 20) 완충용액에 희석하여 4℃에서 하룻밤 동안 반응시킨 후 0.1% TBST로 3회 세정하였다. 세정 후 2차 항체(Santa Cruz Biotechnology, USA)를 1:5000으로 희석하여 상온에서 1시간 반응시킨 후 0.1% TBST로 3회 세정하고, ECL 웨스턴 블롯 검출 시스템(ECL detection kit; Thermo Scientific, USA) 및 imagequantTM LAS 4000(Fujifilm Life Science, Japan)을 사용하여 단백질 발현을 분석하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다.

도 10에 나타낸 바와 같이, 갈근초 및 아데노신 혼합물 처리군에서 JNK의 인산화(p-JNK)가 현저히 감소되어 본 발명의 갈근초 및 아데노신 혼합물이 MAPK 신호전달 경로를 효과적으로 조절할 수 있음을 확인하였다. 이를 통해, 본 발명에 따른 혼합물은 피부노화, 피부염증 및 피부주름에 대한 개선을 통해 피부 항노화, 항주름, 항염증 화장료 조성물로 유용하게 활용될 수 있음을 확인하였다.

실시예 9. MMP -9 발현 억제능 평가

MMPs(matrix metalloproteinase)는 기질단백질 분해효소로, 자외선 조사 시 MMP-1, MMP-2 및 MMP-9과 같은 특정 MMP 패밀리들의 발현이 증가하는데, 이는 프로토콜라겐의 생합성을 억제하여 콜라겐의 함량을 감소시켜 피부의 주름생성을 촉진하고, 색소 침착을 유발하여 피부톤을 칙칙하게 만든다. 본 발명에 따른 갈근초 및 아데노신 혼합물이 MMP-9 발현량에 미치는 영향을 확인하기 위하여 젤라틴 자이모그래피(gelatin zymography)를 수행하였다.

구체적으로, 실시예 5에서 배양용기에 부착시켜 준비한 HaCaT 세포에 대하여 실시예 3에서 사용한 갈근초 100μg/ml 및 아데노신 100μM의 혼합물을 처리하고, UVB 30 mJ/㎠를 조사한 후 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 상등액을 모으고 이를 5X sample 완충용액에 섞은 후 0.1% 젤라틴을 함유한 아크릴아마이드 젤을 사용하여 전기영동을 하였다. 그 다음 상기 젤을 실온에서 10분 동안 2.5% Tripton X-100 용액으로 두 번 세척한 후 배양 완충액을 넣고 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 이후, 상기 젤은 쿠마시 블루 용액으로 1시간 동안 염색하고 탈염색(destaining) 용액으로 고정하여 MMP-9에 의한 젤라틴 분해 활성(염색이 제거된 하얀색 밴드)을 imagequantTM LAS 4000(Fujifilm Life Science, Japan)을 사용하여 분석하였다. 그 결과를 도 11에 나타내었다.

도 11에 나타낸 바와 같이, MMP-9 단백질 활성도는 갈근초 및 아데노신 혼합물 처리군에서 현저히 낮음을 확인하였다. 상기 결과를 통해 본 발명에 따른 갈근초 및 아데노신 혼합물은 UVB에 유도되는 MMP-9의 발현을 억제하여 피부 항노화, 항주름 화장료 조성물로 유용하게 활용될 수 있음을 확인하였다.

실시예 10. 갈근초 및 아데노신 혼합물을 포함하는 화장료 조성물 제조

상기 실시예 3 내지 4에서 세포 생존율 및 보호효과로 우수한 것으로 확인된 갈근초 및 아데노신 혼합물을 포함하는 화장료 조성물을 하기 표 1의 조성으로 제조하였다. 한편, 시판중인 자사의 핑크필의 조성을 비교예 1로서 함께 나타내었다.

No.	원료	본 발명 ( 중량% )	비교예 1 ( 중량% )
1	갈근수	QS	QS
2	갈근초	30.00	30.00
3	pH 조절제	8.30	8.30
4	에탄올	2.00	2.00
5	1,2-헥산디올	2.00	2.00
6	판테놀	0.70	0.70
7	점도조절제	0.54	0.54
8	유화제	0.15	0.15
9	색소	0.10	0.10
10	아데노신	0.04	-
11	디소듐이디티에이	0.02	0.02
T O T A L		100.00	100.00

실험예 1. 본 발명의 화장료 조성물의 경시 안정성 평가

상기 실시예 10에서 제조한 본 발명의 갈근초 및 아데노신을 포함하는 화장료 조성물을 이용하여 4℃, 25℃ 및 40℃의 온도에서 경시 안정성 비교 평가를 수행하였다. 경시 안정성 비교 방법으로는 냉장(4℃), 상온(25℃) 및 고온(40℃)에서의 외관 성상의 변화여부를 관찰하였고, 3달의 기간 동안 관찰한 결과를 하기 표 2에 나타내었다(0: 경시 안정성 양호, ±: 경시 안정성 약간 불안정, +: 경시 안정성 불안정).

시험물질	보관온도 (℃)
시험물질	4℃	25℃	40℃
실시예10	0	0	0

표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 화장료 조성물은 4 내지 40℃의 범위 모두에서 뛰어난 온도 안정성을 나타내어 냉장, 상온 및 고온에서 화장료 조성물의 제형적 안정성을 유지할 수 있음을 확인하였다.

실험예 2. 본 발명의 화장료 조성물의 주름 개선 효과

상기 실시예 10에서 제조한 본 발명의 갈근초 및 아데노신을 포함하는 화장료 조성물을 이용하여 피부 개선 만족도에 대한 설문조사를 실시하였다. 화장료 조성물은 1회 도포량을 2cc로 하여, 1회 도포 후 2주 간격으로 4회에 걸쳐 사용하였다. 평가자는 총 20명을 대상으로 하였으며, 총 그 결과를 표 3에 나타내었다.

평가 항목	평가 점수 (인원)
안색이 맑아졌다	17
미세주름이 감소되었다	18
탄력이 증가되었다	18
피부가 매끄러워졌다	18
촉촉해졌다	17

표 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 화장료 조성물의 피부 개선 만족도 평가 결과 안색 맑아짐, 미세주름 감소, 탄력 증가, 매끄러움 증가 등에 대한 피부 개선 만족도가 높음을 확인하였다.

실험예 3. 본 발명의 화장료 조성물의 피부 반응 평가

상기 실시예 10에서 제조한 본 발명의 갈근초 및 아데노신을 포함하는 화장료 조성물을 이용하여 피부반응 평가를 수행하였다. 평가자는 총 20명을 대상으로 하여, 하기 표 4의 평가기준에 따라 본 발명의 화장료 조성물의 평균피부반응도를 측정하였다. 평가 결과를 표 5에 나타내었다.

기호	점수	평가기준
-	0	반응없음
±	1	희미한 홍반
+	2	약한 홍반, 부종
++	3	뚜렷한 홍반. 부종, 소수포
+++	4	심한 홍반, 부종, 대수포

시험물질	24시간 후				반응률 (%)
시험물질	±	+	++	+++	반응률 (%)
실시예5	-	-	-	-	0

표 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 화장료 조성물은 피부에 대한 자극이 없는 화장료 조성물임을 확인하였다.

실험예 4. 임상 시험 예

본 발명의 화장료 조성물을 임상 시험한 결과를 도 12 및 도 13에 나타내었다. 구체적으로, 본 발명의 화장료 조성물을 사용하여 1회 도포양을 2cc로 하고 1회 도포 후 2주간격으로 4회에 걸쳐 치료한 후 사진을 촬영하였다. 또한, 피부진단기기인 더마비젼을 사용하여 UV를 이용해 환자 피부의 주름 및 탄력도를 분석하였다.

도 12 및 도 13에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 화장료 조성물을 주름 부위에 적용한 결과, 잔주름과 거친 피부가 개선됨을 확인하여 주름 개선에 우수한 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

상기 실시예 및 실험예에서 확인한 바와 같이 갈근초 및 아데노신을 포함하는 본 발명의 주름 개선용 화장료 조성물은 자외선에 의한 피부 노화 억제 및 주름 개선에 우수한 특성을 가지는 것을 확인할 수 있었다.

Claims

갈근초 및 아데노신을 포함하는 피부 노화 방지 또는 주름 개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 갈근초는 전체 화장료 조성물 100 중량부에 대하여 10 내지 50중량부로, 상기 아데노신은 전체 화장료 조성물 100 중량부에 대하여 0.01 내지 0.10중량부로 포함되는 것을 특징으로 하는, 피부 노화 방지 또는 주름 개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 갈근초는
(a) 갈근을 세척하여 분쇄하는 단계;
(b) 분쇄된 갈근 1 중량부에 대하여 물 1.8 내지 2.2 중량부를 혼합 후 압축하여 즙을 추출하는 단계;
(c) 추출된 즙을 1차 여과하는 단계;
(d) 상기 1차 여과된 갈근즙 1 중량부에 대하여 칡 녹말 0.12 내지 0.18 중량부와 누룩 0.08 내지 0.12 중량부를 첨가하여 혼합하고 20 내지 40℃의 온도에서 발효하는 단계; 및
(e) 상기 발효된 갈근즙을 2차 여과 후 효모를 첨가하여 20 내지 40℃의 온도에서 숙성시키는 단계; 에 의하여 제조되는 것을 특징으로 하는, 피부 노화 방지 또는 주름 개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 에탄올, 메탄올, 이소프로판올, 프로필렌 글리콜, 부틸렌글라이콜, 1,2-헥산디올, 글리세린 및 아세트산 에틸 에스테르로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 유기용매를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 피부 노화 방지 또는 주름 개선용 화장료 조성물.
제4항에 있어서, 상기 유기용매는 에탄올 및 1,2-헥산디올이며, 전체 화장료 조성물에 100 중량부에 대하여 각각 에탄올 1 내지 5 중량부, 1,2-헥산디올 1 내지 5 중량부로 포함되는 것을 특징으로 하는, 피부 노화 방지 또는 주름 개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 화장수, 유액, 젤, 크림, 에센스, 팩, 앰플, 로션, 세정료, 비누, 바디제품류, 비누, 오일, 립스틱, 스프레이, 파우더 및 파운데이션으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종으로 제형화 되는 것을 특징으로 하는, 피부 노화 방지 또는 주름 개선용 화장료 조성물.
갈근초 및 아데노신을 포함하는 피부 노화 방지 또는 주름 개선용 약학적 조성물.
갈근초 및 아데노신을 포함하는 피부 노화 방지 또는 주름 개선용 의약외품.