KR101834153B1 - 홍해삼 유래 펩타이드 분말 제조방법 및 이를 포함하는 미백 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 홍해삼 자숙 분말, 이의 제조방법 및 홍해삼 자숙 분말을 포함하는 미백 화장료 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 제조방법은 자숙조건 및 발효조건을 최적화하여 홍해삼 분말을 제조하고, 본발명에 따라 제조된 홍해삼 자숙 분말은 멜라닌 생성율을 낮춰주어 미백효과가 우수하므로, 미백화장료 조성물로 유용할 수 있다.

Description

홍해삼 유래 펩타이드 분말 제조방법 및 이를 포함하는 미백 화장료 조성물{Process for producing red sea cucumber-derived peptide powder and cosmetic composition for skin whitening containing the same}

본 발명은 홍해삼 유래의 피부 미백용 펩타이드 분말 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명은 홍해삼 유래 펩타이드 분말을 포함하는 미백 화장료 조성물에 관한 것이다.

생체 내에 존재하는 멜라닌은 피부의 색상을 변화시키는 주요한 생물학적 색소로서 작용한다. 피부 기저층에 존재하는 멜라노사이트에서 멜라노좀과 멜라닌이 생성되는데 멜라닌은 멜라노좀이라는 새포에 의해 만들어진다. 피부의 멜라닌 생합성에는 다양한 기전들이 연관되어 있는데 그 중에서도 자외선에 의한 자극으로 p53유전자가 만들어 내는 알파-멜라노사이트-조절호르몬에 의한 조절과, 이 호르몬에 의해 증가된 마이크로프탈미아 연합 전이 요소(MITF)가 멜라노좀 안에 존재하는 타이로시네이즈의 활성화를 촉진하고, 활성화된 타이로시네이즈에 의해 DOPA의 하이드록실레이션 과정이 개시되며, 타이로시네이즈 하위 단백질들인 TRP1과 TRP2에 의해 멜라닌 생합성을 촉진 및 조절하게 된다. 최종 산물인 멜라닌은 표피 세포 안으로 들어가 자외선과 같은 피부 자극 물질로부터 피부세포를 보호하는 역할을 수행하게 된다. 그러나 멜라닌 합성의 과다 촉진은 피부에 과색소 침착과 염증성 침착과 같은 기전을 일으키게 된다.

현재 피부 미백에 대해 알부틴(Arbutin)과 누룩산(Kojic acid)이 효과적으로 알려져 있는 대표적인 물질이다. 그러나 알부틴은 하이드로퀴논(Hydroquinone)기로 인해 멜라노사이트에 대한 독성이 있는 것으로 알려져 있고 누룩산(Kojic acid)의 경우 2.5%의 농도에서 피부염을 유발시키는 것으로 밝혀졌으며(Nakagawa Met, 1995), 1%의 농도에서도 색소접촉 피부염을 발생시킨다는 논문이 발표되었다(Juan Garcia-Gavin et, 2010). 이러한 피부독성과 부작용으로 인해 미백효과를 기대하는 물질들은 사용이 어려운 경우가 많다. 따라서, 최근에는 피부에 자극을 최소화하면서 우수한 미백효과를 기대할 수 있는 연구가 천연물에서 유래한 추출물 또는 정제된 미백물질을 중심으로 이루어지고 있다.

해삼은 전세계적으로 1500여종이 존재하며, 한국에는 14종이 서식하는 것으로 알려져 있으며, 그 중 상업적 가치가 높은 종은 돌기 해삼인 Apostichopus japonicas 종이다. 이 종은 분류학적으로 색에 따라 홍해삼, 청해삼, 흑해삼으로 분류되어 있으나. 최근 연구를 통해 유전적으로 다양성이 존재하는 것으로 밝혀졌으며, 이 중 홍해삼이 맛과 향, 크기가 가장 우수한 것으로 밝혀졌다. 해삼은 단백질 47.43% 탄수화물 16.67%, 회분 35.90%으로 단백질 함량이 가장 높은 특징을 가지고 있으며, 여러 영양성분이 풍부하여 식품 또는 이미용 원료로 사용하기 위해 다양한 연구가 진행되어 왔다.

한국등록특허 10-1764806 한국공개특허 10-2017-0027685

본 발명의 목적은 홍해삼 유래 펩타이드 분말의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 제조방법으로 제조된 홍해삼 유래 펩타이드 분말을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 홍해삼 유래 펩타이드 분말을 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 홍해삼을 40℃ 내지 80℃에서 12 내지 72시간 건조하는 단계(단계 1);

상기 단계 1의 건조된 홍해삼을 20 내지 100 mesh로 분쇄하는 단계(단계 2);

상기 단계 2의 홍해삼 100중량부에 정제수를 800 내지 1000 중량부로 혼합 후 100℃ 내지 145℃ 에서 5 내지 33분간 자숙하는 단계(단계 3);

상기 단계 3의 홍해삼 자숙물 1000중량부에 가수분해원을 1 내지 10 중량부로 혼합하여 3 내지 24시간 동안, 25 내지 45℃에서 발효 후, 50 내지 80℃에서 10 내지 20분간 효소를 비활성화 하는 단계 (단계 4); 및

상기 단계 4의 발효 후 2,500 내지 3,500rpm으로 원심분리 한 후 농축 및 동결건조하여 분말로 제조하는 단계(단계 5);

를 포함하는 홍해삼 유래 펩타이드 분말의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법에 따라 제조된 홍해삼 유래 펩타이드 분말을 제공한다.

나아가, 본 발명은 상기 홍해삼 유래 펩타이드 분말을 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 제조방법은 자숙조건 및 발효조건을 최적화하여 홍해삼 유래 펩타이드 분말을 제조함에 따라서 미백효과가 현저히 우수한 효과가 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

제조방법

본 발명은 홍해삼을 40℃ 내지 80℃에서 12 내지 72시간 건조하는 단계(단계 1);

상기 단계 1의 건조된 홍해삼을 20 내지 100 mesh로 분쇄하는 단계(단계 2);

상기 단계 2의 홍해삼 100중량부에 정제수를 800 내지 1000 중량부로 혼합 후 100℃ 내지 145℃ 에서 5 내지 33분간 자숙하는 단계(단계 3);

상기 단계 3의 홍해삼 자숙물 1000중량부에 가수분해원을 1 내지 10 중량부로 혼합하여 3 내지 24시간 동안, 25℃ 내지 45℃에서 발효 후, 50℃ 내지 80℃에서 10 내지 20분간 효소를 비활성화 하는 단계 (단계 4); 및

상기 단계 4의 발효 후 2,500 내지 3,500rpm으로 원심분리 한 후 농축 및 동결건조하여 분말로 제조하는 단계(단계 5);

를 포함하는 홍해삼 자숙분말 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 단계 1은 홍해삼을 40℃ 내지 80℃에서 12 내지 72시간 건조하는 단계이다. 바람직하게는 60℃에서 24시간 건조할 수 있다.

본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 단계 2는 상기 단계 1의 건조된 홍해삼을 20 내지 100 mesh로 분쇄하는 단계이다.

본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 단계 3은 상기 단계 2의 홍해삼 100중량부에 정제수를 800 내지 1000 중량부로 혼합 후 100℃ 내지 145℃ 에서 5 내지 33분간 자숙하는 단계이다. 바람직하게 자숙온도는 115℃ 내지 140℃에서 자숙시간은 12 내지 30분간 자숙할 수 있고, 더욱 바람직하게는 115℃ 내지 135℃에서 12 내지 27분간 자숙할 수 있다. 자숙온도가 100℃ 미만이거나 145℃ 초과할 경우 정제수에 용해되는 단백질의 함량이 낮아지는 문제가 있을 수 있고, 또한 자숙시간이 5분 미만이거나 30을 초과할 경우 정제수에 용해되는 단백질의 함량이 낮아지는 문제가 있을 수 있다.

본 발명에 따른 자숙 조건에서 홍해삼 유래 단백질이 정제수에 높은 비율로 용해될 수 있으며, 단백질이 용해될수록 이후 발효(가수분해)단계에서 전체 단백질 함량 대비하여 생성되는 펩타이드의 함량이 높아지는 효과가 있다.

본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 단계 4는 홍해삼 자숙물 1000중량부에 가수분해원을 1 내지 10 중량부로 혼합하여 3 내지 24시간 동안, 25℃ 내지 45℃에서 발효 후 50℃ 내지 80℃에서 10 내지 20분간 효소를 비활성화 하는 단계이다.

상기 가수분해원은 바람직하게 홍해삼 자숙물 1000중량부에 가수분해원 5중량부로 혼합할 수 있으며, 가수분해원은 프로테아제(protease) 또는 펩티다아제(peptidase)를 포함하는 미생물 또는 단백질 가수분해 효소인 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 프로테아제(protease) 또는 펩티다아제(peptidase)를 포함하는 미생물은 바실러스 서브틸러스(bacillus subtilis) 등을 사용할 수 있다.

또한, 상기 단백질 가수분해 효소는 메탈로펩티다아제, 메탈로프로테아제 등을 단독으로 또는 혼합하여 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 썰모라이신(Thermolysin: EC 3.4.24.27. Bacillus thermoproteolyticus가 생산하는 미생물유래 단백질 분해효소)을 사용할 수 있다.

또한, 상기 비활성화 하는 단계는 바람직하게 80℃에서 15분간 효소를 비활성화 할 수 있다.

본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 단계 5는 상기 단계 4의 발효 후 2,500 내지 3,500rpm으로 원심분리 한 후 농축 및 동결건조하여 분말로 제조하는 단계이다. 바람직하게는 상기 단계 4의 발효 후 3,000rpm으로 원심분리할 수 있다.

홍해삼 유래 펩타이드 분말

본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 홍해삼 유래 펩타이드 분말을 제공한다.

본 발명에 따른 홍해삼 유래 펩타이드 분말은 피부 미백 효능이 현저히 우수한 효과가 있다.

피부 미백용 화장료 조성물

본 발명은 상기 홍해삼 유래 펩타이드 분말을 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어, "미백"이란 피부의 과다 색소 침착을 억제, 저해 또는 완화시키는 것을 말한다. 피부의 과다 색소 침착은 주근깨, 기미, 자외선 노출 후 과다 색소 침착, 염증 후 과다 색소 침착, 노인흑색점, 갈색 반점 또는 검버섯 등을 포함한다.

본 발명에 따른 화장료 조성물에 있어서, 상기 피부 미백용 화장료 조성물은 상기 홍해삼 자숙분말 총 중량에 대하여 0.0001 내지 90 중량부의 양으로 함유할 수 있으나, 바람직한 미백 효과를 제공할 수 있는 유효량을 포함한다면 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 용어, "유효량"이란 피부의 과다 색소 침착을 억제, 저해 또는 완화시킬 수 있는 화합물의 양을 의미한다. 본 발명의 피부 미백용 조성물에 포함되는 상기 화합물의 유효량은 피부 미백용 조성물이 제품화되는 형태, 상기 화합물이 피부에 적용되는 방법 및 피부에 머무르는 시간 등에 따라 달라질 것이다. 예컨대, 상기 피부 미백용 조성물이 피부의 과다 색소 침착에 따른 피부과적 치료를 위한 의약품으로 제품화되는 경우에는 일상적으로 피부에 적용하게 되는 화장품으로 제품화되는 경우에 비해 높은 농도로 상기 홍해삼 자숙분말을 포함할 수 있을 것이다. 화장품으로 제품화되는 경우에 있어서도 유효성분이 단기간 내에 피부에 머무르게 되는 메이크업 제거제, 세정제 등과 같은 워쉬-오프(wash-off) 타입의 화장품의 경우에는 비교적 높은 농도의 상기 화합물을 포함할 수 있을 것이다. 반면 유효성분이 장기간 동안 피부에 머무르게 되는 화장수, 유액, 크림, 에센스 등의 리브-온(leave-on) 타입의 화장품의 경우에는 워쉬-오프 타입의 화장품에 비해 낮은 농도의 상기 홍해삼 자숙분말을 포함해도 무방할 것이다.

본 발명에 따른 피부 미백용 화장료 조성물은 피부외용연고, 크림, 유연화장수, 영양화장수, 팩, 에센스, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 트리트먼트, 젤, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드 크림, 파운데이션, 영양에센스, 선스크린, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디 로션 및 바디 클렌저로 이루어지는 군으로부터 선택된 제형을 가질 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 이들 각 제형의 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.

본 발명의 조성물은 본 발명의 홍해삼 자숙분말에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 피부 미백 활성 성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 피부 미백 활성 성분으로는 코지산 및 이의 유도체, 알부틴, 아스코르브산 및 이의 유도체, 하이드로퀴논 및 이의 유도체, 레조르시놀, 사이클로알카논, 메틸렌디옥시페닐 알칸올, 2,7-디니트로인다졸 또는 덩굴귤 추출물, 쌀 추출물, 감초 추출물과 같은 식물 추출물 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형은 형광물질, 살진균제, 굴수성 유발물질, 보습체, 방향제, 방향제 담체, 단백질, 용해화제, 당유도체, 일광차단제, 비타민, 식물 추출물 등을 포함하는 부형제를 추가로 함유할 수 있다.

상기와 같이 피부 미백용 화장료 조성물을 의약품 또는 화장품으로 제형화할 경우, 활성 성분에 대한 담체로 작용하는 피부에 적용가능한 공지의 부형제를 포함할 수 있다. 의약품으로의 제형화시에는 [Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA]에 개시되어 있는 내용을 참조할 수 있으며, 화장품으로 제형화시에는 [International cosmetic ingredient dictionary, 6th ed., The cosmetic, Toiletry and Fragrance Association, Inc., Washington, 1995]에 개시되어 있는 내용을 참조할 수 있을 것이다. 상기 문헌들은 본 명세서의 일부로서 포함된다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 홍해삼 자숙 분말의 제조방법

단계 1: 홍해삼의 내장을 제거한 후 정제수로 1회 수세한 후 60℃에서 24시간 건조 시킨다.

단계 2: 단계 1 후에 그라인더를 이용해 20 내지 100mesh로 분쇄한다.

단계 3: 분쇄된 홍해삼 분말 100g과 정제수 900ml을 혼합하여 120℃에서 15분간 밀폐된 고압(1.5atm) 고온의 용기내에서 가온하여 자숙한다.

단계 4: 자숙된 홍해삼(홍해삼 100g + 정제수 900ml)을 35℃까지 냉각한 후 온도를 유지하며, 썰모라이신(Thermolysin) 5g을 첨가한 후 4시간 동안 150rpm으로 교반하여 홍해삼의 단백질들을 가수분해하여 펩타이드화 한 후, 펩타이드화에 사용된 효소를 비활성화 하기 위해 80℃에서 15분간 효소를 비활성화 한다.

단계 5: 효소에 의해 가수분해(발효)가 완료된 가수분해물은 3,000rpm으로 원심분리하여 정제수에 용해되지 않는 홍해삼 조직 및 이물질들을 제거한다. 회수된 상등액은 감압농축 및 동결건조를 통해 분말화 하여 홍해삼 자숙분말을 제조하였다.

<비교예 1>

상기 실시예 1의 단계 3의 자숙과정을 제외한 나머지는 동일하게 하여 비교예 1을 제조하였다.

<실험예 1> 자숙온도 및 자숙 시간에 따른 용액 내 단백질 함량 비교

자숙 공정은 정제수와 홍해삼 분말이 혼합되어 있는 용액 내 단백질 함량을 높여 이후의 발효 공정의 효율을 높이고자 실시하는 공정이다. 이러한 자숙공정의 조건을 위해 온도별, 시간별 자숙조건에 따른 용액내 단백질 함량을 비교하였다.

단백질 함량은 Lowry assay를 이용하여 분석하였으며, Lowry assay는 구리이온이 단백질 or 펩타이드의 peptide bond에 결합하는 원리를 이용하였다. 각 시료들은 온도 및 시간별로 자숙공정을 거친 뒤 3,000rpm에서 20분간 원심분리를 실시하였으며, 상등액을 취하여 시험에 이용하였다. Lowry 시약과 30초간 혼합한 후 실온에서 10분간 반응을 유도하였다. 이후 Folin-Ciocalteu 용액을 첨가하여 30초간 교반한 후 30분간 실온에서 발색을 유도한후 750nm에서 흡광도를 측정하였다.

측정결과는 자숙공정을 수행하지 않은 홍해삼 자숙 분말과 정제수 혼합액을 3,000rpm에서 20분간 원심분리한 후 회수한 상등액에 함유되어 있는 단백질 함량을 대조군(Control)로 하였다.

온도에 따른 자숙조건 비교는 100℃ 에서 145℃까지 5℃의 온도 차이를 두고 10분간 자숙을 실시하였다.

자숙 온도에 따른 단백질 함량

자숙조건	단백질 함량(%)
Control (비교예 1)	100
100℃	112.3
105℃	112.4
110℃	112.4
115℃	125.9
120℃	126.8
125℃	126.6
130℃	126.3
135℃	125.7
140℃	121.6
145℃	110.5

그 결과 상기 표 1에서와 같이 120℃에서 가장 높은 단백질 함량이 측정되었으며, 이에 따라 하기에서는 120℃에서 자숙시간에 따른 단백질 함량을 비교 하였다.

자숙 시간에 따른 단백질 함량

자숙시간	단백질 함량 (%)
Control (비교예 1)	100
5 min	114.4
8 min	115.6
9 min	116.1
12 min	128.4
15 min	129.2
18 min	129.1
21 min	128.9
24 min	127.9
27 min	127.4
30 min	125.1
33 min	108.6

자숙시간에 따른 단백질 함량의 경우 15분에서 가장 높은 단백질 함유량을 나타내였으며, 이에 따라 자숙조건을 120℃, 15분으로 결정하였다.

<실험예 2> 자숙 공정에 따른 최종 산물 비교

앞서 자숙공정 조건 설정이 최종 가수분해에 영향을 미치는지 확인하기 위해 실시예 1에 따른 공정을 실시하였으며, 상기 실험예 1에서 진행한 결과와의 유의성을 확인하기 위한 목적으로 진행되었다. 펩타이드 전환율 비교는 최종 공정 이후 분말화된 시료내 펩타이드함량/단백질 함량으로 계산하였다. 이중 단백질 함량은 시료 1mg을 1ml의 용액에 용해시켜 측정하였으며, 펩타이드 함량은 시료 1mg을 1ml의 10%의 TCA(Trichloracetic acid)용액을 이용하여 용해된 펩타이드 함량을 측정하였다. 측정방법은 Lowry assay를 이용하여 측정하였다. 이 결과를 바탕으로 최종시료 내의 펩타이드 함유량을 확인 하였다.

수득율은 최초 사용된 홍해삼 분말을 기준으로 하여 홍해삼 자숙 분말재의 무게비로 비교하였다.

펩타이드 함유량 확인

시료	Control(비교예 1)	100℃	120℃	140℃
펩타이드전환율	54%	84%	97%	78%
최종 시료내 총 펩타이드 함량	32%	35%	40%	27%
수득율	36.85%	37.54%	41.2%	38.14%

상기 표 3에서와 같이, 자숙 조건을 120℃로 할 경우 펩타이드 전환율, 최종 시료내 펩타이드 함량 및 수득율이 가장 높은 것을 알수 있다.

<실험예 3> 자숙유무에 따른 미백활성 비교

상기 실험예 1을 통한 자숙조건의 최적화 이후 자숙의 유무에 따른 미백활성을 검토하고자 본 실험을 실시하였다. 멜라닌은 피부내 멜라닌형성세포에서 자외선 및 다양한 자극에 의해 생성되며, 피부를 검게하는 원인이 된다. 미백활성을 확인하기 위해 상기 실시예 1에 따라 만들어진 홍해삼 자숙 분말의 멜라닌 형성세포(B16F10)에 처리하여 멜라닌 형성세포내,외의 멜라닌 생성양을 측정하는 방법을 이용하였다.

비교 방법은 B16F10 세포를 96 well plate에 적정량의 농도로 분주한 후 24시간 배양하였다. 200nM α-MSH를 72시간 처리하여 멜라닌 형성을 유도한 후 배지에 녹인 시료와 배양 후 세포 외 멜라닌을 측정하기 위해 배지를 새로운 96 well plate로 옮긴 후 490nm에서 흡광도를 확인하였다. 그리고 배양액이 제거된 세포에 1N NaOH를 150ul를 첨가해 세포를 용해시킨 뒤 원심분리 후 1N NaOH에 용해된 멜라닌의 함량을 490nm에서 흡광도를 통해 확인하였다. 활성은 아래의 공식을 이용하여 계산하였다.

멜라닌 활성(%)=(시료를 첨가한 것의 흡광도 / 시료를 첨가하지 않은 것의 흡광도) x 100

a-MSH만을 처리한 대조군(Control)의 생성량을 100%로 하여 비교하였다.

자숙 유무에 따른 멜라닌 활성

실시예 1	Control	100ppm	200ppm	400ppm	800ppm
세포외	100%	59.7%	56.7%	54.6%	50.0
세포내	100%	94.0%	92.0%	90.0%	87.7%

자숙 유무에 따른 멜라닌 활성

비교예 1	Control	100ppm	200ppm	400ppm	800ppm
세포외	100%	76.2%	62.0%	57.1%	53.0%
세포내	100%	97.0%	98.1%	96.5%	98.2%

<실험예 4> 자숙유무에 따른 세포독성 비교

활성을 가지는 농도에서 독성의 유무를 확인하기 위해 살아있는 세포내 미토콘드리아의 탈수소효소에 의해 Formazan을 형성하는 MTT(3-(4,5-dimethyl-thoazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)를 처리하여 세포 생존율을 비교하였다. 본 발명의 홍해삼 자숙 분말의 자숙 조건에 따른 세포생존율을 비교하였다. 자숙공정을 제외한 나머지과정은 동일하게 제조한 홍해삼 분말을 대조군으로 사용하였다.

실험방법은 B16F10 세포를 96 well plate에 적정량의 농도로 분주한 후 24시간 배양하였다. 24시간 후 배지를 제거하고 배지로 녹인 시료를 24시간 처리하였다. 배양 후 5mg/mL MTT용액을 100ul 처리한 후 배양조건에서 2시간 반응하였다. 2시간 후 배양액를 제거하고 세포 내 활성 미토콘드리아의 탈수소효소에 의해 형성된 formazan을 DMSO로 녹여 570nm에서 흡광도 값을 바탕으로 세포생존율을 확인하였다. 세포 생존율은 아래의 공식에 따라 계산하였다.

세포생존율(%)=(시료를 첨가한 것의 흡광도 / 시료를 첨가하지 않은 것의 흡광도) x 100.

그 결과, 하기 표 5에서와 같이 자숙 유무에 따라 세포생존율이 90%이상으로 독성이 없는 것으로 판단되는 농도가 자숙하지 않은 군에서는 200ppm 이나, 자숙공정이 포함되었을 경우 800ppm이 된다. 이는 동일농도 800ppm에서 세포생존율이 약 15%증가되는 것으로 확인된다.

자숙 유무에 따른 세포 생존율

	800ppm	400ppm	200ppm	100ppm
비교예 1	85.7	88.6	91.5	95.3
실시예 1	100.3	112.8	112.3	118.3

화장료의 제조예

본 발명에 따른 상기 홍해삼 자숙분말은 목적에 따라 여러 형태의 화장료로 제조 가능하다. 하기는 본 발명에 따른 홍해삼 자숙분말을 활성성분으로 함유시킨 몇몇 화장료의 제조방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

<화장료 제조예 1> 유연 화장수의 제조

홍해삼 자숙분말 10.0 중량부

1,3-부틸렌글리콜 1.00 중량부

디소듐이디티에이 0.05 중량부

알란토인 0.10 중량부

디포타슘글리시리제이트 0.05 중량부

시트르산 0.01 중량부

소듐시트레이트 0.02 중량부

글리세레스-26 1.00 중량부

알부틴 2.00 중량부

하이드로제네이티드캐스터오일 1.00 중량부

에탄올 30.0 중량부

보존제 미량

착색제 미량

착향제 미량

정제수 잔량

<화장료 제조예 2> 영양 크림의 제조

홍해삼 자숙분말 10.0 중량부

1,3-부틸렌글리콜 7.00 중량부

글리세린 1.00 중량부

D-판테놀 0.10 중량부

식물 추출물 3.20 중량부

마그네슘알루미늄실리케이트 0.30 중량부

PEG-40 스테아레이트 1.20 중량부

스테아르산 2.00 중량부

폴리소르베이트 60 1.50 중량부

친유형글리세릴스테아레이트 2.00 중량부

소르비탄세스퀴올리에이트 1.50 중량부

세테아릴알코올 3.00 중량부

미네랄오일 4.00 중량부

스쿠알란 3.80 중량부

카르릴릭/카프릭트리글리세라이드 2.80 중량부

식물성오일 1.80 중량부

디메치콘 0.40 중량부

디포슘글리시리제이트 미량

알란토인 미량

소듐 히아루로네이트 미량

토코페릴아세테이트 적량

트리에탄올아민 적량

보존제 적량

착향제 적량

정제수 잔량

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특히 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (11)

1. 홍해삼을 40℃ 내지 80℃에서 12 내지 72시간 건조하는 단계(단계 1);
   상기 단계 1의 건조된 홍해삼을 20 내지 100 mesh로 분쇄하는 단계(단계 2);
   상기 단계 2의 홍해삼 100중량부에 정제수를 800 내지 1000 중량부로 혼합 후 115 내지 135℃, 1.3 내지 1.7 atm에서 12 내지 27분간 자숙하는 단계(단계 3);
   상기 단계 3의 홍해삼 자숙물 1000중량부에 단백질 가수분해 효소를 1 내지 10 중량부로 혼합하여 3 내지 24시간 동안, 25 내지 45℃에서 발효 후, 50 내지 80℃에서 10 내지 20분간 단백질 가수분해 효소를 비활성화 하는 단계 (단계 4); 및
   상기 단계 4의 발효 후 2,500 내지 3,500rpm으로 원심분리 한 후 농축 및 동결건조하여 분말로 제조하는 단계(단계 5);
   를 포함하는 홍해삼 유래 펩타이드 분말의 제조방법.
   
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7. 제 1항에 있어서,
   상기 단백질 가수분해 효소는 썰모라이신(Thermolysin: EC 3.4.24.27. Bacillus thermoproteolyticus가 생산하는 미생물유래 단백질 분해효소)인 것을 특징으로 하는 제조방법.
   
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