KR101554999B1

KR101554999B1 - 피부 미백용 조성물

Info

Publication number: KR101554999B1
Application number: KR1020130115733A
Authority: KR
Inventors: 강희철; 홍소영; 박가람; 임동현; 주세진
Original assignee: (주)지에프씨
Priority date: 2013-09-27
Filing date: 2013-09-27
Publication date: 2015-09-23
Also published as: KR20150035659A

Abstract

본 발명은 피부 미백용 조성물에 관한 것이다. 한 구체예에서 상기 피부 미백용 조성물은 상기 옥수수 추출물은 옥수수의 잎(leaf), 껍질(husk), 줄기(stalk), 뿌리(root), 배아(embryo) 및 수염(silk) 부위를 1:0.1~3:0.5~3:0.5~3:0.5~3:0.5~3의 중량비로 포함하는 혼합물을 발효 추출한 것이며, 상기 발효 추출은 유기용매, 열수 또는 초음파에 의해 추출된 추출물에 균주를 접종하여 20~40℃에서 1~10일 간 배양한 것을 특징으로 한다.

Description

피부 미백용 조성물 {A COMPOSITION FOR WHITENING SKIN}

본 발명은 피부 미백용 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 옥수수를 열수, 유기용매 또는 발효 추출을 이용하여 수득한 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물에 관한 것이다.

태양에 노출된 멜라닌 세포는 멜라닌 합성이 촉진되며, 합성된 멜라닌은 자외선을 차단하여 피부를 보호하는 이로운 작용을 하지만 과도한 멜라닌의 생성이나 분포 이상은 기미, 주근깨 및 피부반점을 형성하고 피부노화 및 피부암을 유발하는 것으로 알려져 있다.

멜라닌은 표피의 기저층에 위치한 피부세포의 한 종류인 멜라닌 세포에 의해 합성되어 다른 피부세포인 각질형성세포로 이동되어 이 세포가 각질형성과정을 통해 피부 밖으로 나와 피부로부터 분리될 때까지 지속적으로 존재하여 피부색을 결정하게 되는 요인이 된다. 멜라닌 세포는 성숙되면서 돌기를 형성하게 되고 이 돌기를 통해 주변의 각질형성세포에 멜라닌을 전달하게 되며 피부색뿐만 아니라 머리카락 등의 색깔도 결정하게 된다.

피부 내 멜라닌의 생성기전은 tyrosinase, TRP-1(tyrosinase related protein)-1, TRP-2 등의 일련의 효소반응에 의하여 생성되며, 멜라닌 생성에 가장 중요한 역할을 하는 효소는 tyrosinase이다. 멜라닌 생합성에서 초기단계를 촉매 하는 속도 조절인자로서, 이 효소에 의해 tyrosine이 DOPA, DOPA quinone으로 변환되어 붉은 계열의 eumelanin과 갈색계열의 pheomelanin이 합성된다.

따라서, tyrosinase의 활성을 저해하거나, tyrosinse의 생성을 억제하는 것이 멜라닌 생성 속도를 줄여서 피부를 밝게 할 수 있다고 알려져 있다.

지금까지 여러 가지 멜라닌 생성 억제제가 합성되고 있지만 합성물질은 자연계에 존재하지 않는 전혀 새로운 물질인 경우가 많아서 생분해가 되지 않거나 암의 발생 등 악영향을 미칠 가능성이 크므로, 천연물에서 지금까지 알려지지 않은 미백 효과가 우수한 새로운 물질을 찾고자 하는 요구가 증대되고 있다.

한편, 옥수수(corn, Zea mays L.)는 외떡잎식물 벼목 화본과의 한해살이풀로 높이는 1~3m이다. 꽃은 단성화로 웅화수는 줄기 끝에 달리고, 자화수는 줄기 중앙의 잎 겨드랑이에 달린다. 옥수수는 멕시코에서 남아메리카 북부에 걸친 지역이 원산지로 전 세계에서 재배된다.

도 1은 일반적인 옥수수를 나타낸 것이다. 상기 도 1을 참조하면, 옥수수(1000)는 연장된 줄기(120)의 하부에는 뿌리(130)가 위치하고, 상기 연장된 줄기(120)의 둘레를 따라 열매(100) 및 잎(110)이 위치하며, 상기 열매(100)는 상기 줄기(120)으로부터 연장된 뼈대 둘레에 종자(24)가 성장되어 있고, 그 위에 수염(10)이 위치하며, 상기 종자(24)의 주변은 껍질(표엽, 22)이 감싸고 있다. 또한, 상기 옥수수의 종자(24)는 다시 배유(endosperm), 배아(germ 또는 embryo), 외피(bran layer) 등으로 구분할 수 있다.

상기 옥수수의 수염(corn silk)은 체내에 있는 노폐물을 배출시켜 주기 때문에 피부가 매끄러워지고 여드름과 같은 잡티제거 효과, COX-2 저해효과(Kim et al., 2005) 및 당뇨억제 효과(Rau et al., 2006) 등의 효능이 알려져 있으며, 대한민국 공개특허번호 2007-0118423호에는 옥수수 수염 추출물을 함유하는 숙취해소제와 관련하여 개시하고 있다. 또한, 옥수수의 씨눈(corn embryo)의 효능으로는 토코페롤이라는 비타민 E 성분이 풍부하게 들어있기 때문에 피부의 노화와 건조를 막아주고 습진에 대한 저항력을 높여주며, 성인병 예방에 효과가 있다고 알려져 있다.

하지만, 상기 옥수수의 멜라닌 생성 억제 및 미백 효과에 대해서는 지금까지 보고된 바가 없었다.

본 발명의 목적은 기존에 사용되는 미백제품보다 인체안정성 및 미백효과가 우수한 피부 미백용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 세포독성이 없고 인체에 무해하며, 피부자극이 적은 피부 미백용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 경제성이 우수한 피부 미백용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 화장품, 의약품 및 의약부외품의 피부외용제 등의 분야에서 사용될 수 있는 피부 미백용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 하나의 관점은 피부 미백용 조성물에 관한 것이다. 상기 피부 미백 조성물은 옥수수 추출물을 유효성분으로 포함하고, 상기 옥수수 추출물은 옥수수의 잎(leaf), 껍질(husk), 줄기(stalk), 뿌리(root), 배아(embryo) 및 수염(silk) 부위를 1:0.1~3:0.5~3:0.5~3:0.5~3:0.5~3의 중량비로 포함하는 혼합물을 발효 추출한 것이며, 상기 발효 추출은 유기용매, 열수 또는 초음파에 의해 추출된 추출물에 균주를 접종하여 20~40℃에서 1~10일 간 배양한 것을 특징으로 한다.

한 구체예에서 상기 옥수수 추출물은 상기 조성물 총 중량에 대하여 0.01 중량% 내지 20 중량%로 포함되는 것을 특징으로 한다.

한 구체예에서 상기 균주는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 코아귤란스(Bacillus coagulans), 바실러스 퓨지포미스(Bacillus fusiformis), 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 불가리스(Bacillus vulgaris) 및 바실러스 웨이헨스테판넨시스(Bacillus weihenstephanenesis) 중에서 1종 이상 포함하는 것을 특징으로 한다.

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한 구체예에서 상기 피부 미백용 조성물은 화장품, 의약품 또는 의약부외품 용도로 사용될 수 있다.

본 발명의 피부 미백용 조성물은 기존에 사용되는 미백 제품보다 tyrosinase의 활성 억제효과가 우수하여 특히 단백질 수준에서도 tyrosinase의 활성 억제효과가 뿐만 아니라, 세포에 대한 독성이 없어 인체에 무해하고, 피부자극이 적고, 낮은 생산단가 및 높은 생산성을 가져 경제성이 우수하며, 화장품, 의약품 및 의약부외품의 피부외용제 등의 분야에서 사용될 수 있다.

도 1은 일반적인 옥수수를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 실시예 및 본 발명에 따른 비교예의 세포독성정도를 비교한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 실시예 및 본 발명에 따른 비교예의 멜라닌 세포에서의 멜라닌 생성 저해활성을 측정하여 비교한 그래프 및 사진이다.
도 4는 본 발명의 실시예 및 본 발명에 따른 비교예의 세포 내 tyrosinase의 활성 억제 효과를 비교한 그래프 및 사진이다.
도 5는 본 발명의 실시예 및 본 발명에 따른 비교예의 세포 내 tyrosinase 단백질 발현 억제 효능을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 실시예의 농도변화 및 본 발명에 따른 비교예의 western blotting 결과를 나타낸 그래프 및 사진이다.

본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략할 것이다.

그리고 후술되는 용어들은 본 발명에서의 기능을 고려하여 정의된 용어들로써 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 관례 등에 따라 달라질 수 있으므로 그 정의는 본 발명을 설명하는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다.

한편, 본 명세서에서 사용되는 “피부 미백”은 멜라닌 색소의 합성을 저해함으로써 피부 톤을 밝게 할 뿐만 아니라, 자외선, 호르몬 또는 유전에 기인한 기미나 주근깨 등의 피부 과색소 침착의 개선을 의미하는 것으로 정의하도록 한다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 “옥수수”는 옥수수의 잎, 껍질, 줄기, 뿌리, 종자, 배아 또는 수염 등의 특정한 일부를 의미하거나, 또는 옥수수의 모든 부위를 의미하는 것으로 정의하도록 한다.

본 발명의 하나의 관점은 옥수수 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백 조성물에 관한 것이다. 한 구체예에서 상기 옥수수 추출물은 옥수수의 잎(leaf), 껍질(husk), 줄기(stalk), 뿌리(root), 배아(embryo) 및 수염(silk) 중 하나 이상의 부위를 사용하여 추출할 수 있다.

또한, 본 발명에서는 추출 효율을 높이기 위해, 상기 옥수수의 잎, 껍질, 줄기, 뿌리, 배아 및 수염 부위를 분절 또는 분쇄한 다음 추출을 실시할 수 있다.

한 구체예에서 상기 옥수수의 줄기 부위를 포함하여 열수, 유기용매 또는 발효를 이용하여 추출할 수 있다. 상기 방법으로 추출시 상기 옥수수에 포함된 유용성분이 용이하게 추출되어 본 발명의 미백효과가 우수할 수 있다.

다른 구체예에서 상기 옥수수는 잎, 껍질, 줄기, 뿌리, 배아 및 수염 중에서 하나 이상의 부위를 포함하여 열수, 유기용매, 초음파 또는 발효를 이용하여 추출할 수 있다. 상기 방법으로 추출시 상기 옥수수에 포함된 유용성분이 용이하게 추출되어 본 발명의 미백효과가 우수할 수 있다.

상기 옥수수 추출물은 상기 옥수수의 잎, 껍질, 줄기, 뿌리, 배아 및 수염 부위를 1: 0.1~5: 0.1~5: 0.1~5: 0.1~5: 0.1~5의 중량비로 포함하여 추출될 수 있다. 바람직하게는 1:0.1~3:0.5~3:0.5~3:0.5~3:0.5~3의 중량비로 포함될 수 있다. 더욱 바람직하게는 1:1:1:1:1:1의 중량비로 포함될 수 있다. 상기와 같이 중량비로 포함하여 추출시 상기 각 추출물에 포함된 유용 성분의 상승효과가 우수하여 멜라닌 생성 억제 활성이 증진되고, 멜라닌 생성에 직접적으로 작용하는 세포 내 tyrosinase의 활성 억제 효과를 증진시킬 수 있으며, 피부 미백 효과를 더욱 효과적으로 증진시킬 수 있다.

상기 열수 추출은 상기 옥수수의 잎, 껍질, 줄기, 뿌리, 배아 및 수염 중에서 선택되는 하나 이상의 부위와 물을 포함하는 혼합물을 가열하여 추출할 수 있다.

상기 열수 추출시 상기 옥수수 100 중량부에 대하여 물 100~500 중량부를 포함하여 추출될 수 있다. 바람직하게는 물 200~400 중량부를 포함할 수 있다. 한 구체예에서 상기 열수추출은 30℃~100℃에서 1~10 시간 동안 가열하여 추출할 수 있다. 바람직하게는 60℃~90℃에서 3~8 시간 동안 가열하여 추출할 수 있다. 상기 조건에서 상기 옥수수에 포함된 유용성분이 손상되지 않으면서 용이하게 추출될 수 있다.

상기 열수추출 이후, 교반추출, 환류 냉각 추출, 냉침 추출, 초음파 추출 또는 초임계 추출 등의 통상적인 추출방법을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 환류 냉각 추출한 후 수득한 추출액을 여과, 감압농축 또는 건조하여 상기 옥수수 추출물을 수득할 수 있다.

상기 유기용매 추출은 여과액 100 중량부에 물 10~100 중량부 및 유기용매 100~350 중량부를 첨가하여 추출될 수 있다. 바람직하게는 상기 여과액 100 중량부에 물 30~80 중량부 및 유기용매 150~300 중량부를 첨가하여 추출될 수 있다. 상기 조건에서 상기 옥수수의 잎, 껍질, 줄기, 뿌리, 배아 및 수염에 포함된 유용성분이 손상되지 않으면서 용이하게 추출될 수 있다.

이 때 상기 여과액은 상기 옥수수 100 중량부에 유기용매 50~200 중량부를 첨가하고 5~7일 동안 숙성한 다음 여과된 것일 수 있다. 상기 방법으로 여과 시 옥수수의 잎, 껍질, 줄기, 뿌리, 배아 및 수염에 포함된 유효 성분을 더욱 효과적으로 추출할 수 있다. 상기 여과는 통상적인 방법으로 실시하며, 예를 들면 여과지를 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 여과된 여과액은 통상적인 방법으로 더 농축할 수 있다. 예를 들면, 회전진공농축장치에 투입하여 상기 여과액을 농축할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 여과액 제조 및 상기 유기용매 추출에서 사용될 수 있는 유기용매로는 아세톤, 에틸아세테이트, 디에틸에테르, 벤젠, 클로로포름, 헥산 및 탄소수 1~10의 알코올 등이 사용될 수 있다. 이들은 단독 또는 2종 이상 혼합하여 사용될 수 있다. 상기와 같은 유기용매를 사용시 상기 옥수수의 잎, 껍질, 줄기, 뿌리, 배아 및 수염에 포함된 유용성분이 손상되지 않으면서 용이하게 추출될 수 있다.

또한, 상기 유기용매에 사용되는 알코올로는 예를 들면, 메탄올, 에탄올, 부탄올, 펜탄올, 헥사놀 등의 저급 1가 알코올, 1,2-펜탄디올, 1,5-펜탄디올, 헥산디올, 헵탄디올, 옥탄디올, 데칸디올 등의 중급 2가 알코올, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린 등 저급 3가 알코올 등이 사용될 수 있다. 이들은 단독 또는 2종 이상 혼합하여 사용될 수 있다.

한 구체예에서 상기 유기용매는 헥산, 부탄올 및 에틸 아세테이트를 1:0.1~5:0.1~5의 부피비로 혼합하여 사용할 수 있다. 상기 혼합비율의 유기용매를 사용하여 상기 옥수수의 잎, 껍질, 줄기, 뿌리, 배아 및 수염의 유용성분을 추출하여 분획(分劃)한 다음 감압농축 또는 건조하여 본 발명의 옥수수 추출물을 수득할 수 있다.

상기 초음파 추출은 상기 옥수수 100 중량부에 물 100~500 중량부를 포함하는 혼합물을 15℃~30℃에서 20~50 kHz의 초음파를 이용하여 0.5~5 시간 동안 추출하여 추출액을 수득할 수 있다. 이때, 상기 수득한 추출액을 여과, 감압농축 또는 건조하여 상기 옥수수 추출물을 수득할 수 있다. 상기 방법으로 여과 시 옥수수의 잎, 껍질, 줄기, 뿌리, 배아 및 수염에 포함된 유효 성분이 손상되지 않으면서 효과적으로 추출될 수 있다.

상기 발효 추출은 균주가 배양된 배지에 전술한 유기용매, 열수 또는 초음파에 의해 추출된 추출물을 접종하고 배양하여 발효 추출물을 수득할 수 있다.

한 구체예에서 멸균한 배지에 균주를 접종한 다음, 20℃~40℃에서 20~50시간 동안 배양하고, 상기 옥수수의 잎, 껍질, 줄기, 뿌리, 배아 및 수염 중 하나 이상의 부위를 전술한 유기용매 또는 열수로 추출된 추출물을 접종하여 20℃~40℃에서 1~10일 간 배양하여 얻을 수 있다. 상기 조건으로 발효 추출시 옥수수의 잎, 껍질, 줄기, 뿌리, 배아 및 수염을 이용한 발효물을 효과적으로 추출할 수 있다.

상기 배지는 균주의 발효에 통상적으로 사용되고 있는 배지가 있다면, 제한없이 사용 가능하다. 예를 들면, 천연배지, 합성 배지 및 반합성 배지 등을 사용할 수 있다. 더욱 구체적으로, 효모 추출물 배지, 무아미노산 효모 질소원 배지, 맥아추출물 배지, 펩톤 배지, 폴리펩톤 배지, 트립톤 배지, 탈지분유 배지, 카사미노산 배지, 소이톤 배지, 밀기울 배지, 탈염간장 배지, 콘스팁리쿼 배지, 육즙 추출물 배지, 메주가루 배지, 청국장가루 배지, 고춧가루 배지, 영양 배지, 감자 배지, 사브로드포도당 배지, 트립틱콩 배지, 크자펙-독스(Czapek-Dox) 배지, TSA(Trypticase Soy Agar) 배지, TSB(Tryptic Soy Broth) 배지, BHI(Brain heart infusion) 배지, LB(Luria-Bertani) 배지, TBS(Tris-Buffered Saline) 배지, SD(Sabouraud Dextrose) 배지 및 MRS(de Man, Rogosa and Sharpe) 배지 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

한 구체예에서는 멸균수를 TBS(Tryptic soy broth)에 15~35 g/L를 첨가하여, pH 6.0~7.5, 온도 30℃~40℃로 유지시켜 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

한 구체예에서 상기 발효에 사용되는 균주로는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 코아귤란스(Bacillus coagulans), 바실러스 퓨지포미스(Bacillus fusiformis), 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 불가리스(Bacillus vulgaris), 및 바실러스 웨이헨스테판넨시스(Bacillus weihenstephanenesis) 등을 사용할 수 있다. 이들은 단독 또는 2종 이상 혼합하여 사용할 수 있다. 상기 종류의 균주를 사용시 상기 옥수수의 잎, 껍질, 줄기, 뿌리, 배아 및 수염에 포함된 유용성분을 효과적으로 추출할 수 있다.

상기 옥수수 추출물은 멜라닌 생성 억제 활성이 증진되고, 멜라닌 생성에 직접적으로 작용하는 세포 내 tyrosinase의 활성 억제 효과를 증진시킬 수 있으며, 단백질(protein) 수준에서도 tyrosinase의 양을 억제시키는 효과가 우수하고, 특히 일정한 중량비율로 포함할 때, 이러한 효능을 더욱 월등하게 증진시킬 수 있다. 또한, 상기 피부 미백 조성물은 유사한 효과를 갖는 다른 제품과 비교할 때 낮은 생산단가 및 높은 생산성을 가질 수 있어 경제성이 우수할 수 있다.

한 구체예에서 본 발명에 따른 피부 미백 조성물은 화장품, 의약품 또는 의약부외품(醫藥部外品) 용도로 사용될 수 있다. 상기 피부 미백 조성물은 상기 화장품, 의약품 또는 의약부외품 용도로 사용되어 피부 미백에 이용할 수 있다.

이때, 상기 옥수수 추출물은 상기 피부 미백 조성물 전체 중량에 대하여 0.01~20 중량% 포함할 수 있다. 바람직하게는 0.1~15 중량% 포함할 수 있다. 더욱 바람직하게는 0.5~10 중량% 포함할 수 있다. 상기 범위에서 피부자극, 세포독성이 없으면서 멜라닌 생성 억제 효과와 tyrosinase의 활성 억제, tyrosinase의 단백질 수준에서의 발현 억제를 통하여 피부 미백 효과가 우수할 수 있다.

본 발명의 피부 미백 조성물은 화장품 용도로 사용시, 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있다. 상기 화장품의 제형으로는 예를 들면, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스터로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클린저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더, 아이새도우 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 피부 미백 조성물을 상기 화장품에 사용시 포함되는 성분으로는 담체, 부형제 또는 희석제로 정제수, 오일, 왁스, 지방산, 지방산 알코올, 지방산 에스테르, 계면활성제, 흡습제(humectant), 증점제(thickening agent), 항산화제, 점도 안정화제(viscosity stabilizer), 킬레이팅제, 완충제 및 저급 알코올 등을 포함할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 피부 미백 조성물은 상기 의약품 용도로 사용시 고형제, 반고형제, 용액제, 유제, 분산제, 미셀, 리포좀 등의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 피부 미백 조성물을 의약품 용도로 사용시 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 일반 의약품 제제의 형태로 투여될 수 있다. 상기와 같이 제제화될 경우 통상적인 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제 또는 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 이때, 상기 의약품은 약학적으로 허용되는 성분을 추가로 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용되는 성분으로는 완충액, 주사용 멸균수, 일반 식염수 또는 인산염 완충 식염수, 슈크로오스, 히스티딘 또는 폴리솔베이트 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 피부 미백 조성물을 의약부외품 용도로 사용시 유액, 연고, 크림, 로션 또는 팩의 제형으로 제조될 수 있다. 상기 제형으로 사용시 본 발명의 피부 미백 조성물이 피부 내에 용이하게 침투하여 미백 작용, 멜라닌 생성 억제 작용이 우수하고, 피부에 장기간 체류하기 적합한 형태일 수 있다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 통해 본 발명의 구성 및 작용을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되지는 않는다. 여기에 기재되지 않은 내용은 이 기술 분야에서 숙련된 자이면 충분히 기술적으로 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략하기로 한다.

실시예 1: 옥수수 열수추출

옥수수의 줄기를 세척하여 이물질을 제거하고, 음지에서 건조시킨 다음, 분쇄기를 사용하여 약 30초간 분쇄하여 분쇄물을 제조하였다.

상기 제조된 분쇄물 2kg와 증류수 4.5kg를 혼합하고 70℃에서 3시간 동안 가열한 혼합물을 회전진공 농축장치(rotary vacuum evaporator)(Eyela, Japan)를 사용하여 농축하고 동결 건조하여 분말 상태의 추출물을 수득하였다.

실시예 2: 옥수수 유기용매추출

상기 실시예 1과 동일한 방법으로 제조된 분쇄물 2kg을 70% 에탄올 2kg에 첨가하고 1주일 동안 상온에서 숙성한 다음, 여과지로 여과하여 여과액을 수득하였다. 상기 여과액을 회전진공 농축장치(rotary vacuum evaporator)(Eyela, 일본)를 사용하여 농축하였다.

상기 농축된 여과액 1kg과 물 0.5kg 및 유기용매 2kg을 혼합하였다. 이때 상기 유기용매로는 헥산, 에틸아세테이트 및 부탄올을 1:1:2의 부피비로 혼합하여 사용하였다. 상기 혼합된 여과액을 감압 농축하여 추출물을 수득하였다.

실시예 3: 옥수수 발효추출

TBS(DIFCO, U.S.A) 배지에 균주(바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens))를 접종하고 pH를 5.7로 조절하여 배양실 온도를 23℃~27℃로 유지하고 일장은 16day/8night으로 조절되는 환경 하에서 48시간 동안 배양하였다.

상기 실시예 2와 동일한 방법으로 수득된 추출물을 상기 배양된 균주가 포함된 배지에 접종하여 36℃에서 7일 동안 배양하여 발효물을 수득하였다. 상기 발효물을 면필터로 여과한 뒤, 상기 면필터 상에 있는 여과물을 원심분리하고 상층액을 취하여 추출물을 수득하였다.

실험예

실험예 1: 세포활성 실험

WST 분석법은 살아있는 세포를 측정하는 방법으로 세포 내의 mitochondrial dehydrogenase 활성을 측정한다. WST는 수용성의 tetrazolium salt로서 살아있는 세포와 반응하여 오렌지색 수용성의 formazan을 생성한다. 이 formazan을 측정하여 시료에 대한 세포 독성을 확인한다.

상기 실시예 1~4의 옥수수 추출물이 세포에 자극적이지 않으며 미백 활성 효과를 나타낼 수 있는지를 확인하기 위해 멜라닌 세포(B16-F10 melanoma)에 대한 독성을 측정하였다. 대식세포를 96-well 플레이트에 1×10⁴cells/well 씩 동일하게 hemacytometer를 이용하여 계수한 후, 분주하였다. 24시간 동안 배양한 대식세포에 상기 실시예 1~3을 30 ㎍/㎖의 농도로 각 well에 넣고, DMEM 배지 100 ㎕에서 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 상등액을 제거하고 DMEM 배지와 WST solution(EZ-cytox)을 9:1의 중량 비율로 혼합한 뒤, 2시간 동안 37℃, 5% CO₂ incubator에서 반응시키고, 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 독성 정도(cell viability)는 실시예 1~3과 같은 용매를 사용한 대조군의 흡광 강도를 기준으로 백분율(%)로 표시하여, 상기 실시예 1~3의 세포 활성 정도(%)를 하기 표 1 및 도 2에 나타내었다. 상기 표 1 및 도 2를 참조하면, 본 발명의 실시예 1~3에서는 대조군과 유사한 세포 활성도를 나타내며 세포 독성을 보이지 않음을 알 수 있었다.

구분	세포 활성 정도(%)
대조군	100
실시예 1	103.3
실시예 2	97.2
실시예 3	105.4

실험예 2: 멜라닌 생성 저해 효과

멜라닌 세포를 α-MSH로 자극시키면 여러 pathway를 활성화시키고, tyrosinase의 발현이 증가하게 되어 멜라닌이 생성된다. 생성된 멜라닌은 세포배양액과 세포 내에 존재하게 되며 배양액과 세포의 pellet은 멜라닌에 의하여 검은색을 띄게 된다.

상기 실시예 1~3 및 뛰어난 미백 물질로 알려진 알부틴(α-arbutin)(비교예 1)의 멜라닌 생성 저해 효과를 비교하기 위해, 멜라닌 생성 유도 물질인 α-MSH(Melanocyte-Stimulating Hormone)를 처리한 멜라닌 세포에서 생성된 멜라닌을 측정하는 실험을 실시하였다.

세포 외로 분비되는(extra-cellular) 멜라닌의 측정은 α-MSH를 처리하지 않은 멜라닌 세포를 양성대조군으로, α-MSH를 처리한 대식세포를 음성대조군으로 하여, 상기 실시예 1~3 및 비교에 1을 각각 30 ㎍/㎖ 농도로 처리한 후 배양액을 채취하여 96 well plate에 분주한 후 450nm의 흡광도로 microplate reader를 이용하여 측정하여 멜라닌 생성량을 하기 표 2 및 도 3에 나타내었다.

구분	세포 외 멜라닌 생성 정도(%)
양성 대조군	100
음성 대조군	250.7
실시예 1	128.3
실시예 2	123.5
실시예 3	111.4
비교예 1	140.7

또한, 세포 내로 분비되는(intra-cellular) 멜라닌은 배양액이 제거된 배양 접시에서 부착된 대식세포를 탈부착시킨 후 tube에 모아 1N NaOH를 이용하여 용해시킨 후 상층액을 96 well plate에 분주하여 상기 세포 외로 분비되는 멜라닌과 동일한 방법으로 측정하였다. α-MSH를 처리하지 않은 대식세포를 양성대조군으로, α-MSH를 처리한 대식세포를 음성대조군으로 하여, 상기와 같이 실시예 1~3 및 비교에 1을 각각 30 ㎍/㎖ 농도로 처리한 멜라닌 생성량을 하기 표 3 및 도 4에 나타내었다.

구분	세포 내 멜라닌 생성 정도(%)
양성 대조군	100
음성 대조군	183.1
실시예 1	134.5
실시예 2	121.5
실시예 3	112.8
비교예 1	138.7

상기 표 2, 표 3, 도 3 및 도 4를 참조하면, 실시예 1~3에 따른 옥수수 추출물은 뛰어난 미백 물질로 알려진 알부틴(비교예 1)보다 멜라닌 생성 저해 효과가 상대적으로 우수한 것을 알 수 있었다.

실험예 3: 세포 내 tyrosinase 활성 억제 효과

상기 실시예 1~3 및 뛰어난 미백 물질로 알려진 알부틴(α-arbutin)(비교예 1)의 멜라닌 생성 저해 효과를 측정하기 위해, 멜라닌 생성 유도 물질인 α-MSH를 처리한 멜라닌 세포에서의 생성된 멜라닌을 측정하는 실험을 실시하였다. 세포 내 tyrosinase의 활성을 측정하기 위해 세포 내 단백질을 추출하였고 방법은 하기와 같다.

B16 멜라노마 세포(ATCC사 CRL6745)를 10% 소혈청과 1%의 항생제를 첨가한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's Medium)에 1×10⁵ 세포의 밀도로 접종하고 5% CO₂ 및 37℃의 incubator에서 24시간 동안 배양시켰다. 그 후 α-MSH가 처리된 DMEM 10% 배지로 갈아준 후 상기 실시예 1~3 및 비교예 1을 30 ㎍/㎖의 농도로 well에 처리하여 3일간 배양하였다.

상기에서 각각 처리된 세포를 탈부착시킨 후 tube에 따 대식세포만 모아서 단백질 분해 억제 효소가 첨가된 cell lysis를 이용하여 세포를 용혈시켰다. 원심분리기를 이용하여 단백질이 함유되어 있는 상층액만 취한 후 BCA 정량법으로 단백질 정량을 실시하여 총 단백질 양을 측정하였다. 총 단백질 100㎍과 L-DOPA를 혼합한 후 37℃에서 1시간 incubation을 시킨 후 450nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 하기 표 4 및 도 5에 나타내었다.

구분	세포 내 tyrosinase 활성 억제 정도(%)
양성 대조군	100
음성 대조군	241.2
실시예 1	160.5
실시예 2	153.6
실시예 3	128.9
비교예 1	176.9

상기 표 4 및 도 5를 참조하면, 상기 실시예 1~3은 뛰어난 미백 물질로 알려진 알부틴(비교예 1)보다 세포 내 tyrosinase 활성 억제 효과가 상대적으로 우수한 것을 알 수 있었다.

실혐예 4: Tyrosinase 발현 억제 효과

α-MSH를 처리하지 않은 멜라닌 세포를 양성대조군으로, α-MSH를 처리한 멜라닌 세포를 음성대조군으로 하여, 상기 실시예 3 및 비교예 1에 대하여 멜라닌 세포에서 단백질을 수득하여 tyrosinase의 발현양을 알아보기 위하여 western blot을 실시하였다. 멜라닌 세포를 PBS로 세척한 다음, cell lysis buffer(750mM NaCl, 250mM Tris, 5% Igepal, 1M DTT, Protase inhibitor)를 이용하여 용혈시키고, 원심 분리하여 단백질 용액을 얻었다. BCA 정량법을 이용하여 단백질 용액을 정량한 다음, 30㎍을 취하여 sample buffer(NuPAGE LDS Sample buffer(X4), invitrogen, U.S.A.)와 혼합하였다. 100℃에서 5분간 가열하여 단백질 변성을 유도하였다. 변성된 단백질을 10% acrylamide gel에서 전기영동을 수행한 다음 nitrocellulose membrane으로 전위시키고 5% BSA/TBS-T로 상온에서 1시간 동안 반응시켜 비 특이적인 항체 반응을 억제시켰다. tyrosinase 및 β-actin에 대한 1차 항체를 1% BSA/TBS-T에서 1:2,000으로 희석하여 membrane과 4℃에서 overnight하여 반응시키고 TBS-T buffer로 세척한 다음 Anti-mouse, rabbit 혹은 goat IgG conjugated Horseradish peroxidase 2차 항체를 1% BSA/TBS-T에서 1:10,000으로 희석하여 membrane과 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. TBS-T로 세척한 다음 ECL reagent kit로 발색시키고 chemi-doc XRS+에서 감광시키는 방법으로 분석하여, 상기 실시예 3의 농도 변화 및 비교예(30 ㎍/㎖)에 따른 western bloting 결과를 하기 표 5 및 도 6에 각각 나타내었다.

구분		tyrosinase 발현 정도(ratio)
대조군		1
실시예 3의 농도(㎍/㎖)	3.75	0.807
	7.5	0.684
	15	0.567
	30	0.489
비교예 1((30 ㎍/㎖)		0.803

상기 표 5 및 도 6에 나타낸 것과 같이 상기 양성대조군, 음성대조군, 옥수수 추출물, 알부틴과 비교하였을 때, 실시예 1~3의 경우 tyrosinase의 발현을 감소하는 효과가 비교예 1보다 우수한 것을 확인할 수 있었고, 이를 통하여 본 발명의 옥수수 추출물은 상기 알부틴(비교예 1)보다 단백질 수준에서도 피부 미백 효과를 확인할 수 있었다.

상기 실험예 1~4의 결과를 종합해보면, 상기 실시예 1~3은 우수한 미백물질로 알려진 알부틴(비교예 1)보다 세포 독성 시험, 멜라닌 생성 저해 실험, 세포 내 tyrosinase 활성 저해실험 및 멜라닌의 생합성에 가장 큰 요인으로 작용하는 tyrosinase의 발현 억제 효과까지의 전반전인 생리활성 연구에서 효과가 우수하였으며, protein 수준에서도 피부 미백 효과를 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명에 따른 피부 미백 조성물의 제제예를 하기에 설명하고자 하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 하기 제제예에 한정되지는 않는다.

제제예 1: 의약부외품(국소 투여용 약제( 패취제 ))의 제조

하기 표 6의 조성과 같이, 상기 실시예 3의 추출물을 유효성분으로 포함하는 국소 투여용 약제(패취제)를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

구분	성분	함량 (단위:중량%)
1	실시예 3의 옥수수 추출물	0.5
2	β-1,3 글루칸	3.0
3	헥실렌글리콜	5.0
4	디에틸아민	0.2
5	폴리아크릴산	0.2
6	아황산나트륨	0.1
7	폴리옥시에틸렌라우릴에테르(E.O=9)	2.0
8	폴리히드록시에틸렌세틸스테아릴에테르(Cetomacrogol 1000)	1.0
9	파라핀 오일	5.0
10	카프릴산에스테르	3.0
11	폴리에틸렌글리콜	2.0
12	정제수	22.0
합계		100

제제예 2: 화장품(팩)의 제조

하기 표 7의 조성과 같이, 상기 실시예 3의 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장품(크림)을 제조하였다. 우선 정제수, 부틸렌글라이콜, 글리세린, 카보머, 트리에탄올아민 및 방부제를 표 2의 함량으로 78℃에서 교반하면서 가열하였다. 그 다음에 글리세릴스테아레이트에스이, 소르비탄세스퀴올리에이트, 글리세릴스테아레이트, 세틸알코올, 스테아릭애씨드, 비즈왁스, 미리스틸알코올, 스쿠알렌 및 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드를 표 2의 함량으로 78℃에서 교반하며 가열하여 상기 교반된 혼합물에 투입한 다음 유화하였다. 상기 유화된 혼합물을 교반하여 50℃로 냉각한 다음, 상기 실시예 3의 추출물을 하기 표 7의 함량으로 상기 유화된 혼합물에 투입하여 35℃로 냉각하여 제조하였다.

구분	성분명	함량(%)
1	실시예 3의 옥수수 추출물	0.5
2	부틸렌글라이콜	4.0
3	글리세린	4.0
4	카보머	0.2
5	트리에탄올아민	0.2
6	방부제	0.2
7	글리세릴스테아레이트에스이	1.0
8	소르비탄세스퀴올리에이트	0.5
9	글리세릴스테아레이트	2.0
10	세틸알코올	1.5
11	스테아릭애씨드	2.0
12	비즈왁스	1.5
13	미리스틸알코올	1.5
14	스쿠알렌	4.0
15	카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	4.0
16	정제수	72.9
합계		100

제제예 3: 화장품(로션)의 제조

하기 표 8의 조성과 같이, 상기 실시예 3의 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장품(로션)을 제조하였다. 우선 정제수, 부틸렌글라이콜, 글리세린, 카보머, 트리에탄올아민 및 방부제를 하기 표 8의 함량으로 78℃에서 교반하면서 가열하였다. 그 다음에 글리세릴스테아레이트에스이, 소르비탄세스퀴올리에이트, 폴리소르베이트60, 글리세릴스테아레이트, 세틸알코올, 스테아릭애씨드 및 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드를 하기 표 8의 함량으로 78℃에서 교반하며 가열하여 상기 교반된 혼합물에 투입한 다음 유화하였다. 상기 유화된 혼합물을 교반하여 50℃로 냉각한 다음, 옥수수 추출물을 표의 함량으로 상기 유화된 혼합물에 투입하여 35℃로 냉각하여 제조하였다.

구분	성분명	함량(%)
1	실시예 3의 옥수수 추출물	0.5
2	부틸렌글라이콜	3.0
3	글리세린	2.0
4	카보머	0.2
5	트리에탄올아민	0.2
6	방부제	0.2
7	글리세릴스테아레이트에스이	2.0
8	소르비탄세스퀴올리에이트	0.5
9	폴리소르베이트 60	0.5
10	글리세릴스테아레이트	0.5
11	세틸알코올	1.0
12	스테아릭애씨드	1.0
13	카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	4.0
14	정제수	84.4
합계		100

Claims

옥수수 추출물을 유효성분으로 포함하고,
상기 옥수수 추출물은 옥수수의 잎(leaf), 껍질(husk), 줄기(stalk), 뿌리(root), 배아(embryo) 및 수염(silk) 부위를 1:0.1~3:0.5~3:0.5~3:0.5~3:0.5~3의 중량비로 포함하는 혼합물을 발효 추출한 것이며,
상기 발효 추출은 유기용매, 열수 또는 초음파에 의해 추출된 추출물에 균주를 접종하여 20~40℃에서 1~10일 간 배양한 것을 특징으로 하는 피부 미백 조성물.
제1항에 있어서, 상기 옥수수 추출물은 상기 조성물 총 중량에 대하여 0.01 중량% 내지 20 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물.
삭제
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삭제
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삭제
제1항에 있어서, 상기 균주는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 코아귤란스(Bacillus coagulans), 바실러스 퓨지포미스(Bacillus fusiformis), 바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 불가리스(Bacillus vulgaris) 및 바실러스 웨이헨스테판넨시스(Bacillus weihenstephanenesis) 중에서 1종 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물.
제1항, 제2항, 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피부 미백용 조성물은 화장품, 의약품 또는 의약부외품 용도로 사용되는 피부 미백용 조성물.