KR101140572B1 - 피부세포의 성장과 주름살 개선 및 미백에 효능을 갖는 발효흑마늘 나노 분획물 - Google Patents
피부세포의 성장과 주름살 개선 및 미백에 효능을 갖는 발효흑마늘 나노 분획물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 흑마늘 추출물을 포함하는 항산화 및 미백용 조성물에 대한 것이다. 본 발명의 조성물은 식품 및 화장료로 이용될 수 있으며, 피부 세포의 성장, 주름살개선 및 미백에 효능을 갖는다.
Description
본 발명은 흑마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 미백용 조성물에 대한 것이다.
최근 생활 수준이 높아지면서 피부 미용 및 동안에 대한 관심이 증가하고, 이와 관련하여 미용 시장이 급격히 커지고 있다.
한편, 인간의 피부는 해부학적으로 표피(epidermis)와 진피(dermis)로 구분되며, 이중 표피는 각질형성세포(keratinocytes), 멜라닌형성세포(melanocytes), 랑게르한스세포(Langerhans cells), 머켈세포(Merkel cells)로 이루어져 있다. 이중 각질형성세포는 내의 장기들을 보호하는 피부의 최외각층인 표피를 구성하는 다중 층의 주요 세포 형태로서 장벽의 역할을 담당하며, 멜라닌형성세포는 피부에 침착된 색소를 생산하는 역할을 담당하는 세포이다. 표피아래의 진피조직은 주로 콜라겐(collagen)과 엘레스틴(elestin)으로 구성된 세포외 기질과 연결조직으로 구성되어 있다.
표피의 각 층은 각질형성세포의 연속적인 분화의 결과로서 형성되며, 바닥층의 각질형성세포는 세포분열에 의해 그 수가 늘어나고 바닥층으로부터 가시층, 과립층, 각화층의 수직방향으로 이동하면서 최종 분화과정을 거쳐 죽음에 이르게 된다. 이러한 분화과정에서 각질형성세포는 세포의 크기가 커지는 형태학적인 변화 뿐만 아니라 여러 가지 생화학적 변화들로 인해 궁극적으로 핵이 상실되고 편형화 된 죽은 세포가 되어 피부의 표피로부터 떨어져 나가며, 안쪽 층으로부터 연속적으로 분화하는 세포들에 의해 대체되게 된다.
또한 각질형성세포는 세포의 분화 정도에 따라 발현되는 케라틴의 종류가 특이적인데, 바닥층의 각질형성세포에서는 주로 K5와 K14이 발현되며, 각질형성세포가 바닥층을 이탈하여 상부의 가시층으로 이동하면서 K5와 K14 케라틴 쌍 대신에 K1와 K10의 다른 케라틴쌍이 발현되기 시작한다. 인볼루크린(involucrin)과 로리크린(loricrin)은 최종 분화를 거치는 동안 발현되는데, 이들은 상부 과립층에서 세포막과 서로 결합하여 단백질로 완성되므로, 각질형성세포의 최종 분화 과정을 추적하는 데에 있어서 표지자로 사용된다.
사람의 피부색은 표피에 존재하는 멜라닌형성세포에서 합성된 멜라닌을 함유하는 멜라노좀의 크기, 종류, 숫자에 의해 다르게 나타날 수 있다. 멜라닌은 표피에서 생성되는 색소로서 멜라닌형성세포에서 아미노산의 일종인 타이로신(tyrosine)이 타이로시네즈(tyrosinase)라는 효소에 의해 도파(DOPA), 도파퀴논(DOPAquinone)으로 전환된 후, 여러 가지 산화 과정을 거쳐 만들어진다. 멜라닌은 자외선을 흡수하여 표피 안쪽에 존재하는 여러 세포조직들을 자외선에 의한 손상으로부터 보호하는 역할을 하는데, 이러한 멜라닌의 합성이 비정상적으로 적을 경우에는 백반증 등의 피부병변이 발생되지만, 멜라닌 합성이 과도할 경우 기미, 주근깨 등을 발생시킬 뿐만 아니라, 전반적인 피부색을 어둡게 한다. 따라서 과도한 멜라닌 색소 합성을 저해시킬 경우 피부색을 밝게 할 뿐만 아니라, 기미, 주근깨의 피부 과색소 침착증상을 완화 시킬 수 있다.
피부의 노화는 나이에 따른 자연노화와 환경조건에 따른 외인성 노화현상으로 나눌 수 있는데 외인성 노화 현상의 가장 큰 원인은 태양광선속의 자외선이다. 자연노화 현상에 의한 주름 생성은 진피 조직 내의 섬유아세포(fibroblasts)의 기능과 세포수의 감소에 따라 콜라겐, 엘라스틴 등의 세포외 기질 단백질의(extracellular matrix) 합성양이 줄어들고 구조가 느슨해짐에 따라 탄력이 감소하고 표피층의 구조의 변화에 따라 잔주름이 발생하게 된다. 외인성 노화는 태양광선의 자외선에 대한 자극이 반복되면서 활성산소종(ROS, reactive oxygen species) 을 발생시키고 여러 가지 세포 신호전달 체계를 활성시킴에 의해 피부를 구성하는 단백질, 핵산, 지질 등의 손상으로 인한 노화가 진행되기도 하고, 자외선의 조사량이 증가할수록 진피조직의 콜라겐과 엘라스틴을 포함하는 세포외 결합조직 성분을 분해시키는 작용을 담당하는 matrix metalloproteinase(MMPs)의 활성이 증가함으로 콜라겐을 비롯한 결합조직 성분의 손상으로 인한 피부 주름형성이 촉진된다 할 수 있다.
한편, 흑마늘은 최근 건강에 좋다고 알려져 건강식품으로 섭취하는 경우가 상당히 증가하였으며, 흑마늘의 숙성가공방법 개선, 숙성가공방법 개선에 따른 유효성분함량 및 효능 증가, 그리고 식음료 조성물로서의 가능성에 대한 연구가 주로 이루어졌다. 그러나 미생물 발효를 통해 흑마늘의 유효성분 및 항산화성을을 증강시키거나 미생물을 통해 생산된 흑마늘 발효액의 분자량별 성분을 피부세포의 증식, 미백, 노화방지의 화장품 소재로서 개발한 연구는 미비한 실정이다.
이에 본 발명자들은 흑마늘 추출물이 각질형성세포, 멜라닌형성세포 등에 미치는 영향을 연구하던 중, 흑마늘 추출물이 항산화 효과 및 피부 미백 기능을 갖는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 항산화 및 미백용 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 항산화 및 미백용 조성물의 제조 방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 항산화 및 미백 효능을 갖는 미용 방법에 대한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 흑마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 미백용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 흑마늘을 추출하는 단계를 포함하는 항산화 및 미백용 조성물의 제조 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 흑마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 미백용 조성물을 피부에 도포하거나 먹는 단계를 포함하는, 항산화 및 미백 효능을 갖는 미용 방법을 제공한다.
본 발명의 흑마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물 및 이를 이용한 미용 방법은 항산화, 미백, 주름 개선 및 완화, 피부 탄력 증가, 피부 세포의 성장, 보습, 피부 자극 완화, 피부톤의 균일화 및 다크서클 개선능을 갖는다.
도 1은 실시예 1 내지 12의 흑마늘 추출물의 제조방법을 나타내는 모식도이다.
도 2는 흑마늘 추출물의 총 폴리페놀 함량(a) 및 총 항산화능(b)을 나타낸다.
도 3은 흑마늘 추출물이 각질형성세포의 성장에 미치는 영향을 나타낸다.
도 4는 실시예 1, 실시예 4-6를 각각 포함하는 배양액에서 각질형성세포를 배양 시 인볼루크린(a), 케라틴 1(b) 및 케라틴14(c)의 mRNA 발현량을 나타낸다.
도 5는 실시예 2, 실시예 7-9를 각각 포함하는 배양액에서 각질형성세포를 배양 시 인볼루크린(a), 케라틴 1(b) 및 케라틴14(c)의 mRNA 발현량을 나타낸다.
도 6는 실시예 3, 실시예 10-12를 각각 포함하는 배양액에서 각질형성세포를 배양 시 인볼루크린(a), 케라틴 1(b) 및 케라틴14(c)의 mRNA 발현량을 나타낸다.
도 7은 실시예 1 내지 3, 실시예 4, 실시예 7 및 실시예 10의 멜라닌 합성 억제능을 나타낸다.
도 8은 실시예 7 및 실시예 10의 농도별 프로콜라겐 합성능을 나타낸다.
도 9는 각질형성세포에 대한 흑마늘 추출물의 농도별 세포 독성을 나타낸다.
도 10은 섬유아세포에 대한 흑마늘 추출물의 농도별 세포 독성을 나타낸다.
도 11은 멜라닌형성세포에 대한 실시예 1 내지 3, 실시예 4, 실시예 7 및 실시예 10의 농도별 세포 독성을 나타낸다.
도 2는 흑마늘 추출물의 총 폴리페놀 함량(a) 및 총 항산화능(b)을 나타낸다.
도 3은 흑마늘 추출물이 각질형성세포의 성장에 미치는 영향을 나타낸다.
도 4는 실시예 1, 실시예 4-6를 각각 포함하는 배양액에서 각질형성세포를 배양 시 인볼루크린(a), 케라틴 1(b) 및 케라틴14(c)의 mRNA 발현량을 나타낸다.
도 5는 실시예 2, 실시예 7-9를 각각 포함하는 배양액에서 각질형성세포를 배양 시 인볼루크린(a), 케라틴 1(b) 및 케라틴14(c)의 mRNA 발현량을 나타낸다.
도 6는 실시예 3, 실시예 10-12를 각각 포함하는 배양액에서 각질형성세포를 배양 시 인볼루크린(a), 케라틴 1(b) 및 케라틴14(c)의 mRNA 발현량을 나타낸다.
도 7은 실시예 1 내지 3, 실시예 4, 실시예 7 및 실시예 10의 멜라닌 합성 억제능을 나타낸다.
도 8은 실시예 7 및 실시예 10의 농도별 프로콜라겐 합성능을 나타낸다.
도 9는 각질형성세포에 대한 흑마늘 추출물의 농도별 세포 독성을 나타낸다.
도 10은 섬유아세포에 대한 흑마늘 추출물의 농도별 세포 독성을 나타낸다.
도 11은 멜라닌형성세포에 대한 실시예 1 내지 3, 실시예 4, 실시예 7 및 실시예 10의 농도별 세포 독성을 나타낸다.
본 발명은 흑마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 미백용 조성물에 대한 것이다.
또한 본 발명은 흑마늘을 추출하는 단계를 포함하는 항산화 및 미백용 조성물의 제조 방법에 대한 것이다.
또한 본 발명은 흑마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 미백용 조성물을 피부에 도포하거나 먹는 단계를 포함하는, 항산화 및 미백 효능을 갖는 미용 방법에 대한 것이다.
이하, 본 발명을 자세히 설명한다.
본 발명의 흑마늘은 구입하거나 일반 마늘로부터 직접 제조하여 사용할 수 있다. 흑마늘의 제조 방법은 널리 알려져 있으며, 이 중 적절한 방법을 선택하여 흑마늘을 제조할 수 있으며, 그 제조 방법은 제한되지 않는다.
본 발명의 흑마늘 추출물은 흑마늘의 조추출물, 흑마늘의 발효물, 흑마늘의 분획물 등을 모두 포함한다. 예컨대, 본 발명의 흑마늘 추출물은 흑마늘의 조추출물일 수 있고, 상기 조추출물을 발효시킨 발효물일 수 있으며, 상기 발효물을 분획한 분획물일 수도 있다. 예컨대, 본 발명의 실시예 1 내지 12를 참조하여, 본 발명의 흑마늘 추출물의 구체적인 제조예를 알 수 있을 것이다(도 1).
본 발명의 흑마늘 조추출물은 흑마늘을 물, 탄소수 4 이하의 저급 알코올, 에틸 아세테이트, 클로로포름 등으로 추출하여 제조할 수 있으며, 바람직하게는 물, 탄소수 4 이하의 저급 알코올을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 본 발명의 흑마늘 발효물은 흑마늘 조추출물을 균을 이용하여 발효하여 제조할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 흑마늘 발효물은 흑마늘을 추출한 후, 이를 유산균 또는 국균을 이용하여 발효시켜 제조할 수 있다.
이때, 유산균으로는 락토바실러스(Lactobacillus), 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 락토코커스(Lactococcus), 류코노스톡(Leuconostoc) 또는 페디오코쿠스(Pediococcus) 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 락토바실러스균을 사용할 수 있다. 본 발명의 락토바실러스균은 Lactobacillus brevis , Lactobacillus kefir , Lactobacillus paracasei subsp . paracasei, Lactobacillus plantarum , Lactobacillus acidophilus , Lactobacillus delbrueckii subsp . bulgaricus , Lactobacillus kefiranofaciens 등 일 수 있으며, 바람직하게는 락토바실러스 브레비스이나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예에서는 락토바실러스 브레비스(Latcobacillus brevis) KCTC 11520BP를 사용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 일반적인 락토바실러스균 또는 유산균을 사용하여 본 발명을 실시할 수 있다.
한편, 국균으로는 황국(Aspergillus oryzae), 흑국(Aspergillus niger), 백국(Aspergillus Kawachii) 또는 홍국(Monascus spp.)을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 홍국균을 사용한다. 또한, 본 발명의 국균으로는 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae), 아스퍼질러스 카와치(Aspergillus kawachii), 아스퍼질러스 우사미(Aspergillus usamii), 아스퍼질러스 시로우사미(Aspergillus shirousamii), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 모나스커스 필로서스(Monascus pilosus) 및 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 사용할 수도 있으며, 바람직하게는 모나스커스 필로서스를 사용하나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예에서는 모나스커스 필로서스(Monascus pilosus) KCCM 60029(ATCC 22080)를 사용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 일반적인 모나스커스균 또는 국균을 사용하여 본 발명을 실시할 수 있다.
한편 본 발명의 흑마늘 분획물은 흑마늘 조추출물을 발효하거나 발효하지 않고 분획하여 제조할 수 있으며, 이때 한외여과법을 사용할 수 있다. 예컨대 본 발명의 흑마늘 분획물은 1만 달톤 미만의 분자량, 1만 달톤 이상 3만 달톤 미만의 분자량 또는 3만 달톤 이상의 분자량을 갖는 획분일 수 있다.
본 발명의 흑마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 항산화, 미백, 주름 개선 및 완화, 피부 탄력 증가, 피부 세포의 성장, 보습, 피부 자극 완화, 피부톤의 균일화 및 다크서클 개선능을 갖는다.
본 발명의 흑마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 식품 조성물 또는 화장료 조성물일 수 있다.
본 발명의 식품은 항산화용 건강보조식품, 건강기능식품, 기능성 식품 등이 될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 천연식품, 가공식품, 일반적인 식자재 등에 본 발명의 흑마늘 추출물을 첨가하는 것도 포함된다.
본 발명의 식품 조성물은, 본 발명의 흑마늘 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 조성물과 함께 사용될 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 개선 등)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 흑마늘 추출물은 식품 또는 음료의 제조 시에 식품 또는 음료의 원료 100 중량부에 대하여 0.1 내지 70 중량부, 바람직하게는 2 내지 50 중량부 첨가될 수 있다. 그러나 상기 흑마늘 추출물은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 식품 조성물은 정제, 경질 또는 연질 캅셀제, 액제, 현탁제 등과 같은 경구투여용 제제의 형태로 이용될 수 있으며, 이들 제제는 허용 가능한 통상의 담체, 예를 들어 경구투여용 제제의 경우에는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 가용화제, 현탁화제, 보존제 또는 증량제 등을 사용하여 조제할 수 있다.
상기 흑마늘 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제, 기타 영양제 등을 들 수 있으나 이들 종류의 식품으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 화장료 조성물은, 당업계의 통상적으로 제조되는 어떠한 제형에도 제조될 수 있으며 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 본 발명의 화장료 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 스프레이 또는 파우더 제형으로 제조될 수도 있다.
한편 본 발명의 미용 방법은 흑마늘 추출물 또는 이를 포함하는 조성물을 피부에 도포함으로써, 항산화, 미백, 주름 개선 및 완화, 피부 탄력 증가, 피부 세포의 성장, 보습, 피부 자극 완화, 피부톤의 균일화 또는 다크서클 개선능을 갖는다.
이하, 본 발명을 다음의 실시예 및 실험예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 발명의 범위가 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<재료 및 방법>
흑마늘의
제조
마늘 10kg을 흑마늘 숙성장치에 넣고, 80~100℃의 온도 조건에서 습도 100% RH의 스팀과 열을 3시간 가하여 스팀 처리하였다. 상기 스팀 처리된 마늘을 숙성장치 내에서 72~77℃의 온도를 유지하면서 198시간 동안 열을 가하여 주숙성시키고, 그 후 60~69℃ 온도를 유지하면서 스팀과 열을 35시간 동안 가하여 후숙성시켰다. 그리고 상기 후숙성 공정을 거친 마늘을 50~58 ℃의 온도를 유지하면서 51시간 동안 건조시킨 후, 0~5℃ 조건 하 168시간 동안 냉각시켜 저온숙성시켜 반건조 흑마늘을 제조하였다.
실험기기
본 발명에서는 세포실험을 위하여 CO2 배양기, 무균실험대(Clean bench), 역상현미경(Inverted microscope, olympus, 일본), 원심분리기(한일원심분리기), 헤모싸이토미터(Hematocytometer), 반응수조(Water bath), 펌프(Pump) 등을 사용하였다. 또한 한외여과막(Centricon？Plus Filter units, nominal molecular weight limits of 10,000, and 3,000 Da , Millipore Co., 미국), 동결건조기(DRC-1000, EYELA), 제균여과막(0.2 μm Durapore filter, Millipore, 미국)을 사용하였다.
항산화능의
측정
FRAP법을 이용하여 총 항산화능을 측정하였다. FRAP법은 낮은 pH에서 환원제에 의해 ferric tripyridytriazine (Fe3+-TPTZ) 복합체가 ferrous tripyridytriazine (Fe2+-TPTZ)로 환원되는 것을 이용하는 것으로, Fe2+-TPTZ은 강한 파란색을 가지므로 595nm에서 감지될 수 있다.
FRAP 시약은 300mM acetate buffer (pH 3.6)와 40Mm의 염산에 녹인 10mM TPTZ (2,4,6-Tripyridyl-S-Triazine, C18H12N6), 그리고20mM Iron(Ⅲ) chloride hexahydrate (FeCl3?6H2O)을 10:1:1의 비율로 섞어 만들고, 사용 전까지 4℃에서 보관하였다.
각질형성세포의 배양
인간각질형성세포(keratinocytes)는 10-15세 어린아이의 포경수술 후 얻어진 음경 포피로부터 분리하여 사용하였다. 분리된 포피는 10배 농도의 안티바이오틱-안티마이오틱(Invitrogen, CA, USA)이 첨가된 인산 완충액에 넣어 운반하였으며, 포피는 안티바이오틱-안티마이오틱 용액이 첨가된 인산 완충액으로 3회 세척한 후, 포피의 조직에서 진피층 아래에 위치한 피하지방을 제거한 후, 잘게 잘라서 0.05% 트립신-0.53mM EDTA용액(Welgene, Daegu, Korea)에 담아 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 반응 후 다시 2시간 동안 37℃에서 반응 시키고 반응액과 피부 조직 조각을 피펫을 이용하여 15ml 튜브로 옮긴 후, 우태 혈청을 넣어서 트립신의 활성을 불활성화시켰다. 상기 튜브를 격렬히 진탕 시켜 진피 바로 위쪽에 붙어 있는 각질형성세포를 분리하였다. 분리 후 3분간 상온에서 튜브를 정치시켜 조직 절편을 침전시키고, 각질형성세포 부유액인 상등액을 수득하여 1000rpm 이하에서 5분간 원심 분리하여 상등액은 버리고 인산완충용액으로 2회 세척 후에 배양액에 부유하여 37℃, 5% CO2배양기에서 배양하였다.
상기 증식 배양액은 에피라이프(EpiLife, Cascade, Portland, USA)의 기본 배지에 표피성장인자(epidermal growth factor, EGF) 0.2 ng/ml, 인슐린 (insulin) 5μg/ml, 트랜스페린(transferrin) 5μg/ml, 하이드로콜티손 (hydrocortisone) 0.18μg/ml, 0.2%(v/v) 소 뇌하수체 추출불(bovine pituitary extract, BPE)을 첨가한 배양액을 사용하여 배양하였다.
멜라닌 형성세포의 배양
Melan-a 세포는 C57BL/6J(black, a/a) 마우스로부터 유래한 불멸화된 세포주로, Dr. Dorothy C Benette (St George’s Hospital, London, UK)로부터 제공받아 사용하였다. 상기 세포는 RPMI 1640 기본 배지에 우태혈청(fetal bovine serum, FBS) 10%와 50 U/ml penicillin, 50μg/ml streptomycin, 200 nM phobol 12-myristate 13-아세테이트(PMA)를 첨가한 배지로 37℃, 10 % CO2조건 하에서 배양하였다.
섬유아세포의 배양
상기 각질형성세포를 얻는 과정과 비슷하게 정상 피부조직의 지방층을 제거하고, 잘게 자른 후 콜라게네이즈(collagenase)로 진피와 표피를 분리 시킨 후, 조직을 0.25% 트립신 용액에 넣고 37℃에서 10분간 유지시켰다. 이후 격렬히 진탕하여 섬유아세포를 유리시키고, 인산완충용액으로 세척 후 10% 우태 혈청(fetal bovine serum, FBS)이 포함된 DMEM 배지에 넣고 배양 하였다.
케라틴,
인볼루클린
, β-
액틴
및 프로콜라겐의 발현 측정
시료를 포함하는 배양 배지에서 배양한 각각의 각질형성세포로부터 케라틴과 인볼루클린의 mRNA발현 수준을 측정하기 위해 역전사중합효소연쇄반응을 실시하였다. 이때, 전체 RNA는 알앤이지 미니 키트(RNeasy mini kit, Qiagen, USA)를 이용하여 제조사에서 제공한 방법에 따라 추출하였고, 추출된 전체 RNA의 농도는 260nm에서의 흡광도를 측정하여 결정하였으며, RNA의 순도는 260/280nm의 흡광도 비율이 >1.9 임을 통하여 확인하였다. 첫 번째 상보적 DNA의 가닥은 리버스 트랜스크립션 시스템(Reverse transcription system, Promega, USA)을 이용하여 합성하였다. 1μg의 전체 RNA, oligo(dT)15 프라이머, 그리고 AMV역전사 효소등을 포함한 최종 부피 20μl의 혼합물은 70℃에서 10분, 42℃에서 60분, 90℃에서 5분을 반응하여 상보적 DNA를 합성하였다. 생성된 상보적 DNA는 1U Taq중합효소, 0.2mM dNTP, 0.2 μM의 특이적인 프라이머(표 1, 케라틴, 인볼루크린, 프로콜라겐 및 베타 액틴의 발현을 확인하기 위한 PCR 프라이머)와 혼합되어, 95℃에서 30초 변성, 55~62℃에서 30초 어닐링(annealing), 72℃에서 1분간 신장과정을 30-32 사이클 반복하여 증폭되었다. 실시예 1-12가 각각 포함된 배양 배지들에서 48시간 배양된 각질형성세포의 케라틴10, 케라틴 14, 인볼루크린 mRNA의 발현 수준은 하우스키핑 유전자(housekeeping gene)인 베타 액틴을 통해 표준화되었고, 반응 후, 역전사중합효소연 쇄반응물은 2% 한천을 통해 전기 영동하였고, 각각의 밴드는 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)로 염색하여 자외선의 조사를 통해 확인하였다.
<실시예 1의 제조>
반건조된 숙성 흑마늘을 200g/L(20%)가 되도록 물(1L)에 첨가하여 교반기에 10분씩 3번 분쇄하여 액체화하였다. 분쇄된 고농도의 흑마늘액을 60-80℃의 온도를 유지하면서 마그네틱바로 교반하여 유효성분을 추출하고, 3,000 rpm에서 30분씩 3번 원심분리하여 상등액을 수득하였다. 상기 상등액을 3 내지 5 ㎛ 크기의 전처리 여과막으로 여과하여 잔류물을 제거한 후 여과액을 수득하였다(실시예 1).
<실시예 2의 제조>
실시예 1의 흑마늘 추출물을 당도를 6-8 Brix가 될 때까지 정제수로 희석하고 pH를 5.0 ~ 7.0으로 조정한 후, 100℃에서 5분간 살균하였다. 그 후, 중량대비 2%의 락토바실러스 브레비스(Latcobacillus brevis) KCTC 11520BP를 접종하고, 38℃에서 18시간~24시간 동안 pH3~5를 유지하며 배양하였다. 배양 후 배양액을 3000rpm에서 30분간 원심분리하여 일차적으로 배양균을 제거한 후, 규조토를 통과시키고, 0.22μm 여과지를 이용해서 최종 여과하여 흑마늘 추출물의 유산균 발효액을 제조하였다(실시예 2).
<실시예 3의 제조>
실시예 1의 흑마늘 추출물을 당도를 6-8 Brix가 될 때까지 정제수로 희석하고 pH를 5.0 ~ 7.0으로 조정한 후, 100℃에서 5분간 살균하였다. 그 후, 여기에 중량대비 2%의 모나스커스 필로서스(Monascus pilosus) KCCM 60029(ATCC 22080)를 접종하고, 25℃에서 1주일 동안 pH3~5를 유지하며 배양하였다. 배양 후 배양액을 3000rpm에서 30분간 3회 원심분리하여 일차적으로 배양균을 제거한 후, 규조토를 통과시키고, 0.22μm 여과지를 이용해서 최종 여과하여 홍국균 발효액을 제조하였다(실시예 3).
<실시예 4 내지 6의 제조>
3만 달톤(30k Dalton) 크기의 한외여과막을 이용하여 실시예 1의 흑마늘 추출물을 3만 달톤 이상의 상층액과 3만 달톤 미만의 여과액으로 분획하였다.
상기 분획된 3만 달톤 이상의 상층액을 0.22㎛의 여과막을 이용하여 제균여과하고, -80℃에서 72시간 동결건조 (DRC-1000, EYELA)하고, 200 g/L(20% w/v)의 농도로 PBS에 액체화하여 분획하여, 3만 달톤 이상의 분자량을 갖는 획분을 수득하였다(실시예 4).
한편, 상기 3만 달톤 미만의 여과액은 다시 1만 달톤(10k Dalton) 크기의 한외여과막으로 여과하여 3만 달톤 미만 1만 달톤 이상의 상층액과 1만 달톤 미만의 여과액으로 분획하였다. 상기 분획된 3만 달톤 미만 1만 달톤 이상의 상층액을 0.22㎛의 여과막을 이용하여 제균여과하였고, -80℃에서 48시간 동결건조 (DRC-1000, EYELA)한 후, 200 g/L(20% w/v)의 농도로 PBS에 액체화하여 분획하였다(실시예 5).
또한 상기 분획된 1만 달톤 미만의 여과액을 0.22㎛의 여과막을 이용하여 제균여과하였고, -80℃에서 48시간 동결건조 (DRC-1000, EYELA)한 후, 200 g/L(20% w/v)의 농도로 PBS에 액체화하여 분획하였다(실시예 6).
<실시예 7 내지 9의 제조>
3만 달톤(30k Dalton) 크기의 한외여과막을 이용하여 실시예 2의 흑마늘의 유산균 발효추출물을 3만 달톤 이상의 상층액과 3만 달톤 미만의 여과액으로 분획하였다.
상기 분획된 3만 달톤 이상의 상층액을 0.22㎛의 여과막을 이용하여 제균여과하고, -80℃에서 72시간 동결건조 (DRC-1000, EYELA)하였고, 200 g/L(20% w/v)의 농도로 PBS에 액체화하여 분획하였다(실시예 7).
한편, 상기 3만 달톤 미만의 여과액은 다시 1만 달톤(10k Dalton) 크기의 한외여과막으로 여과하여 3만 달톤 미만 1만 달톤 이상의 상층액과 1만 달톤 미만의 여과액으로 분획하였다. 상기 분획된 3만 달톤 미만 1만 달톤 이상의 상층액을 0.22㎛의 여과막을 이용하여 제균여과하고, -80℃에서 48시간 동결건조 (DRC-1000, EYELA)한 후, 200 g/L(20% w/v)의 농도로 PBS에 액체화하여 분획하였다(실시예8).
또한 상기 분획된 1만 달톤 미만의 여과액을 0.22㎛의 여과막을 이용하여 제균여과 하였고, -80℃에서 48시간 동결건조 (DRC-1000, EYELA)한 후, 200 g/L(20% w/v)의 농도로 PBS에 액체화하여 분획하였다(실시예 9).
<실시예 10 내지 12의 제조>
3만 달톤(30k Dalton) 크기의 한외여과막을 이용하여 실시예 3의 흑마늘의 홍국균 발효추출물을 3만 달톤 이상의 상층액과 3만 달톤 미만의 여과액으로 분획하였다.
상기 분획된 3만 달톤 이상의 상층액을 0.22㎛의 여과막을 이용하여 제균여과하였고, -80℃에서 72시간 동결건조 (DRC-1000, EYELA)하였고, 200 g/L(20% w/v)의 농도로 PBS에 액체화하여 분획하였다(실시예 10).
한편, 상기 3만 달톤 미만의 여과액은 다시 1만 달톤(10k Dalton) 크기의 한외여과막으로 여과하여 3만 달톤 미만 1만 달톤 이상의 상층액과 1만 달톤 미만의 여과액으로 분획하였다. 상기 분획된 3만 달톤 미만 1만 달톤 이상의 상층액을 0.22㎛의 여과막을 이용하여 제균여과 하였고, -80℃에서 48시간 동결건조 (DRC-1000, EYELA)한 후, 200 g/L(20% w/v)의 농도로 PBS에 액체화하여 분획하였다(실시예 11).
또한 상기 분획된 1만 달톤 미만의 여과액을 0.22㎛의 여과막을 이용하여 제균여과 하였고, -80℃에서 48시간 동결건조 (DRC-1000, EYELA)한 후, 200 g/L(20% w/v)의 농도로 PBS에 액체화하여 분획하였다(실시예 12).
<실험예 1> 흑마늘 추출물의 항산화능
<1-1> 총 폴리페놀 함량
실시예 1 내지 12를 정제수에 5배 희석 (시료 0.1ml 당 정제수 0.4ml)시킨 후, 0.25ml folin-ciocalteu reagent를 첨가 하고 격렬히 반응시켰다. 다시 1.25ml 20% sodium carbonate solution(Na2CO3)용액을 첨가하여 격렬히 반응시킨 후 상온의 암소에서 40분 동안 정치시켰다. 반응 후 725nm에서 흡광도를 측정하였으며, 표준곡선을 작성하기 위해 galic acid를 0 ~ 100㎍/㎖ 농도로 제조한 후 4~5 농도지점의 흡광도를 측정하여 표준곡선을 작성하였다.
그 결과, 분자량에 관계없이 홍국균 발효나노분획 > 유산균발효나노분획 > 무발효 흑마늘 추출물의 나노분획의 순으로 높은 폴리페놀 함량을 나타내었다. 한편, 분자량 별로는 발효방법과 관계없이 30kDa 이상의 분획 > 무분획 조추출물 > 10-30kDa 분획 > 10kDa이상의 분획의 순으로 폴리페놀 함량이 높았다.
특히 실시예 10 내지 12는 실시예 4 내지 6에 비하여 최소 약 185%, 최대 약 340%까지 폴리페놀 함량이 높았으며, 실시예 7 내지 9에 비하여는 최소 약 140%에서 최대 약 270%까지 폴리페놀 함량이 높았다(도 2(a)).
<1-2> 총 항산화능
시료(실시예 1 내지 12)를 정제수에 희석 시킨 후, 각각의 시료 0.1ml와 FRAP 시약 3.0ml을 혼합 후 격렬히 섞은 후 25oC에서 5분 동안 반응시키고, 593nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡선은 Iron(Ⅱ)sulfate heptahydrate (FeSO4?7H2O)를 0.01 ~ 1.0 mM의 농도로 제조한 후 4~5 농도지점의 흡광도를 측정하여 작성하였다.
그 결과, FRAP법에 의해 나타난 총 항산화 능력은 상기 <1-1>의 총 폴리페놀 함량과 유사한 양식을 나타내었다.
이를 구체적으로 살펴보면, 분자량에 관계없이 홍국균 발효나노분획 >유산균발효나노분획 > 무발효 흑마늘 나노분획의 순으로 항산화능이 우수하였다. 한편, 분자량별로는 발효방법에 관계없이 30kDa 이상의 분획 > 무분획 조추출물 > 10-30kDa 분획 > 10kDa이상의 분획의 순으로 항산화능이 우수하였다.
특히 실시예 10 내지 12는 실시예 4 내지 6에 비하여 최소 약 170%, 최대 약 550%까지 항산화능이 높았으며, 실시예 7내지 9에 비하여는 최소 약 120%에서 최대 약 330%까지 항산화능이 높았다(도 2(b)).
<실험예 2> 흑마늘 추출물이 각질형성세포의 성장에 미치는 영향
발효흑마늘 나노분획이 피부표피의 80%이상을 차지하고 있는 각질형성세포의 성장을 증진 시킬 수 있는가를 평가하기 위하여 피부로부터 분리된 인간 각질형성세포를 6well plate(SPL, Korea)에 초기 세포농도를 well당 5×104개로 접종하여 37℃에서 4시간 정도 배양한 후, 부착 상태를 확인하고, 실시예 1 내지 12를 0.25, 0.5, 1, 2mg/ml의 농도로 포함한 배지로 조심스럽게 교체하여 계속 증식시켰다. 세포 배양 24시간 후 0.05% 트립신-0.53mM EDTA용액을 이용하여 세포를 구분하여 떼어낸 후, 살아있는 세포의 수를 헤모싸이토미터 및 트립판블루(Trypan blue)를 이용한 색소 배제 방법을 이용하여 평가하였다. 흑마늘 추출물이 포함되지 않은 배양배지로만 각질형성세포을 배양하여 이를 대조군으로 사용하였으며, 모든 세포 수의 평가는 세 번 반복으로 행해졌고, 그 결과는 모든 값의 평균으로 나타내었다.
그 결과, 실시예1 내지 12가 0.25, 0.5, 1mg/ml의 농도로 포함한 배지에서 배양된 모든 각질형성세포는 흑마늘 추출물이 포함되지 않은 대조군보다 최소로는 108%, 최대로는 152%의 높은 총 생존세포수를 나타내고 있음을 알 수 있었다. 그러나 실시예1 내지 12가 2mg/ml의 농도로 포함한 배지에서 배양된 각질형성세포는 대조군과 비슷하거나 오히려 낮은 총 생존세포수를 나타내고 있음을 알 수 있었다. 그러므로, 흑마늘 추출물의 조성농도에 따라 각질형성세포의 세포성장이 제한될 수 있는 것으로 생각되었다.
구체적으로는 실시예 9 내지 10이 0.25mg/ml의 농도로 포함되거나, 실시예 9가 0.5mg/ml의 농도로 포함된 배양액에서의 총 생존 세포수는 대조군에 비하여 140%~150%정도를 나타내었으며, 농도가 높아질수록 10kDa 이하의 분자량을 갖는 실시예 6, 실시예 9 및 실시예 12는 세포의 성장을 저해시키는 것을 알 수 있었다(도 3).
<실험예 3> 흑마늘 추출물이 각질형성세포의 분화에 미치는 영향
실험예 1 내지 12이 포함된 배양액에서 한 각질형성세포의 배양을 실험군, 흑마늘 추출물이 포함되지 않은 배양액에서의 각질세포 배양을 대조군으로 하며, 농도는 1mg/ml로 한정하였다. 각각의 시료가 포함된 배양 배지에서 배양한 각각의 각질형성세포로부터 질형성세포의 분화표지자인 케라틴과 인볼루클린의 mRNA발현 수준을 측정하기 위해 역전사중합효소연쇄반응을 실시하였다. 그리고 흑마늘 추출물이 포함된 배양액에서 배양된 각질형성세포의 분화상태는 피부 표피의 바닥층에서 계속 유사분열하는 각질형성세포에서 발현되는 케라틴 14, 각질형성세포의 분화가 시작되면서 발현되는 케라틴10과 각질형성세포가 분화 후기에 발현하는 인볼루크린 mRNA의 발현을 상대 비교하여 관찰하였다.
그 결과, 실시예 1, 실시예 4 내지 6은 흑마늘 추출물이 포함되지 않은 대조군에 비하여 분화 후기에 발현하는 인볼루크린의 발현이 7~ 15% 정도 적게 발현된 것으로 확인되었는바, 이는 각질을 형성하는 최종분화가 덜 된 것을 의미하며, 각질층의 구조를 견고하지 못하게 할 수 있는 가능성을 보여준다(도 4).
한편 흑마늘 유산균 발효분획의 경우 실시예 8은 분화가 시작되면서 발현되는 케라틴 10과 최종 분화시 발현되는 인볼루크린의 발현이 대조군에 비해 5~ 12% 정도 적게 발현되는 것이 확인되었는바, 전체적인 피부세포의 분화의 속도를 지연시킴으로서 각질층의 구조를 견고하지 못하게 할 것으로 판단된다(도 5).
한편, 흑마늘 홍국균 발효분획의 경우 케라틴 10을 실시예 12에서 20% 정도 억제하는 경우를 제외하고는 전체적으로 케라틴10 및 인볼루크린의 발현양상이 대조군과 비슷하여, 전체적인 피부세포의 적절한 분화가 일어나는 것으로 확인되었다(도 6).
<실험예 4> 흑마늘 추출물의 멜라닌 합성 억제능
Melan-a 세포를 3 x 104 cells/well이 되도록 24 well plate에 깐 후, 24시간 동안 세포가 plate에 잘 붙도록 세포배양기에 방치한 뒤, 각 well당 다양한 농도로 희석된 시험물질이 들어있는 배지를 넣어주었다. 이때 실험 시료(실시예 1 내지 3, 실시예 4, 실시예 7, 및 실시예 10)는 원하는 농도대로 녹여 사용하였다. 위와 같은 방법으로 실험 시료를 3일에 한번씩, 6일 동안 처리하였으며, 세포내의 멜라닌은 광학 현미경(Inverted microscope, olympus, JAPAN)으로 확인하였다. 이후 세포용해용액으로 세포를 녹인 후 원심분리를 통해 상층액을 분리하여 단백질을 정량하였다. 한편, 멜라닌은 1 N NaOH를 첨가하여 405 nm에서 흡광도를 측정하여 측정한 단백질양에 대한 멜라닌 양으로 환산하였으며, 단백질양의 측정법은 다음과 같다:
-단백질양 측정법
단백질 측정법 중 Lowry method를 기본으로 한 Bio-rad DC protein kit를 사용하여 측정하였다.
(1) 세포가수분해물(상층액)을 각각 5 ml를 96-well plate에 넣는다.
(2) 단백질 표준액 제조 : 1.45 mg/ml 농도의 BSA(Albumin standard, Pierce, #23209)를 DW에 8가지 농도로 희석하여 5 ml 씩 96-well plate에 넣는다.
(3) Kit에 포함된 시약 A와 시약 S를 40:1의 비율로 섞어서 각 well에 25 ml씩 넣는다.
(4) Kit에 포함된 시약 B를 각각 200 ml씩 넣는다.
(5) 상온에서 15분 반응시킨 뒤 750 nm에서 흡광도를 측정한다.
그 결과, 실시예 1 및 실시예 4를 0.25, 0.5, 1.0, 2.0 mg/ml의 농도로 처리하였을 때 농도가 증가함에 따라 실시예 1은 약6~20%, 실시예 4는 약 0~27% 정도 멜라닌 합성을 억제시키는 것으로 확인되었다(도 7(a)).
한편, 실시예 2 및 실시예 7을 0.25, 0.5, 1.0, 2.0 mg/ml의 농도로 처리하였을 때는 농도가 증가함에 따라 실시예 2는 약5~24%, 실시예 7는 약 8~30% 정도 멜라닌 합성을 억제시키는 것으로 확인되었다(도 7(b)).
또한 실시예 3 및 실시예 10을 0.25, 0.5, 1.0, 2.0 mg/ml의 농도로 처리하였을 때는 농도가 증가함에 따라 실시예 3은 약 9~43%, 실시예 10은 약 10~48% 정도 멜라닌 합성을 억제시키는 것으로 확인되었다(도 7(c)). 특히 실시예 10의 조성물을 2mg/ml의 농도로 처리한 경우, 미백제로 사용되고 있는 PTU의 100uM의 효능과 유사한 결과를 보였는바, 미백 용도가 뛰어난 것으로 판단되었다.
<실험예 5> 흑마늘 추출물의 프로콜라겐 합성 촉진능
T-25 flask에서 70~80% 정도 성장할 때까지 섬유아세포를 배양하고, 실시예 7 및 실시예 10을 각각 1, 2mg/ml의 농도로 처리하여 배양한 실험군과, 흑마늘 추출물을 포함하지 않는 배양배지에서 배양한 대조군의 프로콜라겐의 mRNA합성 정도를 비교하였다.
그 결과, 실시예 7의 1, 2mg/ml 농도 조성물 및 실시예 10의 1, 2mg/ml 농도 조성물은 대조군에 비하여 각각 107, 112, 140, 120% 프로콜라겐 합성이 증가한 것으로 확인되었으며, 특히 실시예 10이 우수한 프로콜라겐 합성능을 갖는 것으로 나타났다(도 8).
<실험예 6> 흑마늘 추출물의 세포 독성
WST-1 cell proliferation assay를 이용하여, 각질형성세포, 멜라닌 형성세포 및 섬유아세포에 대한 실시예 1-12의 흑마늘 추출물의 세포 독성을 측정하였다.
각질형성세포, 멜라닌형성세포, 섬유아세포를 96-well plate에 well별로 1 x 104개씩 넣어준 후, 하루 동안 세포배양기에 방치하여 완전히 부착시켰다. 그리고 실시예 1 내지 12를 다양한 농도로 각각 포함하는 배지로 well당 100 μl 로 교체한 후, 48시간 동안 배양시켰다. 세포배양배지에 WST-1 용액을 well 당 10 ml씩 첨가하고 2시간 동안 세포배양기에 넣고 반응을 시킨 후, plate채로 450nm에서 formazan의 생성 정도를 측정하였다.
그 결과, 각질형성세포의 경우, 발효 종류와 관계없이 0.5mg/ml의 농도로 처리한 흑마늘 추출물은 대조군에 비해 독성을 거의 나타내지 않았다. 그러나 무발효 흑마늘 추출물이 1mg/ml의 이상의 농도로 처리된 경우 약간의 세포독성이 나타나기 시작하였으며, 특히 실시예 6의 경우 그 정도가 대조군에 비해 24%이상 증가된 세포독성을 나타내었다(도 9).
섬유아세포의 경우, 발효 종류와 관계없이 흑마늘 추출물은 2mg/ml의 농도에서도 대조군에 비하여 독성을 거의 나타내지 않았다(도 10).
한편, 멜라닌형성세포의 경우, 실시예 1-3, 실시예 4, 실시예 7 및 실시예 19의 흑마늘 추출물은 발효 종류에 관계없이 2mg/ml의 농도에서도 대조군에 비해 독성을 거의 나타내지 않았다(도 11).
상기 세 종류의 세포들은 피부의 표피를 구성하는 주요 세포들로서 특정 농도로 처리된 흑마늘 추출물은 특정 세포에만 영향을 미치는 것이 아니라, 피부를 구성하는 모든 세포에게 영향을 미칠 수 있기 때문에 본 세포독성평가는 매우 중요한 의미를 갖는 것으로 판단된다.
Claims (12)
- 흑마늘을 추출하는 단계;및
상기 흑마늘 추출물을 모나스커스 필로서스(Monascus pilosus)를 이용하여 발효시키는 단계를 포함하는 항산화 및 미백용 화장 조성물의 제조 방법으로,
상기 모나스커스 필로서스의 발효에 의하여 흑마늘 추출물 내 폴리페놀 함량이 증가하는 것을 특징으로 하는 항산화 및 미백용 화장료 조성물의 제조 방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 흑마늘 추출은 흑마늘을 열수추출하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 모나스커스 필로서스는 모나스커스 필로서스 KCCM 60029인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 주름개선 및 완화, 피부 탄력 증가, 피부 세포의 성장, 보습 또는 피부 자극 완화 효능을 추가로 갖는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 흑마늘 추출물을 발효시킨 후 흑마늘 발효물을 한외여과하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 삭제
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 방법으로 제조한 항산화 및 미백용 화장료 조성물.
- 흑마늘을 추출하는 단계;및
상기 흑마늘 추출물을 모나스커스 필로서스(Monascus pilosus)를 이용하여 발효시키는 단계를 포함하는 항산화 식품 조성물의 제조 방법으로,
상기 모나스커스 필로서스의 발효에 의하여 흑마늘 추출물 내 폴리페놀 함량이 증가하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제 8항에 있어서,
상기 흑마늘 추출은 흑마늘을 열수추출하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제 8항에 있어서,
상기 모나스커스 필로서스는 모나스커스 필로서스 KCCM 60029인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제 8항에 있어서,
상기 흑마늘 추출물을 발효시킨 후 흑마늘 발효물을 한외여과하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
- 제 8항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 방법으로 제조한 폴리페놀 함량이 높은 항산화 식품 조성물.
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