KR20090115394A - 고효율 분화에 의한 검증을 수반하는 식물 줄기세포의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 식물 생체 시료를 이용하여, 캘러스 줄기세포를 유도하여, 안정적으로 배양하는 방법 및 전기 방법에 의하여 생산된 식물 줄기세포에 관한 것이다. 본 발명에서는 제조된 줄기세포가 분화능력을 가지고 있는지 여부를 효율적으로 판별할 수 있는 옥신 결핍 쇼크 검증법을 제시하여, 분화능력을 보유하는 줄기세포 만을 제공할 수 있게 되어, 본 발명을 통하여 생산되는 식물 줄기세포는 의약용, 식품용 및 화장품 원료로 널리 이용될 수 있을 것이다.

식물 줄기세포, 분화, 배발생

Description

고효율 분화에 의한 검증을 수반하는 식물 줄기세포의 제조방법 {Methods for Preparing Plant Stem Cells Assured by High Efficiency Differentiation}

본 발명은 식물 줄기세포의 제조 방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 분화되지 않은 식물세포 중에서 분화 능력을 가진 줄기세포를 선별하는 방법 및 전기 방법으로 제조된 식물 줄기세포에 관한 것이다.

식물은 씨로부터 발아-분화하여 조직 및 기관을 형성하여 식물 개체가 완성되면, 식물조직의 체세포들은 일정 기간이 지나면 노화하여 죽게 된다. 하지만 분열 능력이 없는 분화조직일지라도 이것을 적절한 식물호르몬 (phytohormone)을 첨가한 배지에서 배양하면, 그 조직의 체세포들은 다시 분화능력을 갖게 되고 계속 분열하여 캘러스를 형성한다. 이와 같이 한번 분열되었던 체세포가 분열능을 획득하여 분열능이 왕성한 원시세포로 되는 것을 탈분화(de-differentiation)라 하며, 이때 생성된 원시세포를 식물 줄기세포라 한다.

식물 줄기세포는 다시 기관이나 조직으로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있으며, 이러한 능력을 재분화(re-differentiation)능이라 한다. 식물 줄기세포는 고체 배지 위에서 캘러스(callus) 배양이나, 액체배지 속에서 현탁세포(suspended cell) 배양법 등으로 유지 또는 증식될 수 있다. 따라서 식물 줄기세포는 적절한 배양 조건에서, 계속적인 계대 배양(passage)을 통하여 무한히 유지될 수 있는 것으로 알려져 있다.

[문헌 1] S.S. Bhojwani and M.K. Razdan, Plant Tissue Culture: Theory and Practice, 1983, Elsevier Publishers, 107-108쪽

탈분화 과정을 거쳐서 유도된 줄기세포는 여러 계대배양을 지나면서 분화능력이 약화되거나, 또는 분화능력을 잃어버리는 것으로 보고되고 있다. 이러한 식물 줄기세포의 분화능력 상실은 여러 원인으로 설명되나, 대표적으로 유전적 가설 (genetic hypothesis), 생리적 가설 (physiological hypothesis) 및 경쟁적 가설 (competitive hypothesis) 등이 적용될 수 있다.

하지만 정확하게 언제 줄기세포가 분화능력을 상실하는 지는 식물마다, 그리고 배양 환경마다 다르기 때문에, 정확하게 분화능력을 가진 줄기세포를 파악하는 것은 쉬운 일이 아니었다. 하지만 배양하고 있는 미분화된 식물세포가 줄기세포의 능력을 보유하는지 아닌지에 대한 판단은 식물 줄기세포의 활용 측면에서 가장 중요한 일이라 할 수 있다.

따라서, 미분화된 배양 세포가 분화능을 보유하고 있는지 여부를 알 수 있는, 식물 줄기세포 판별 또는 검증법을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.

이에, 본 발명자들은 식물 생체 시료를 이용하여, 캘러스 줄기세포를 유도하여, 안정적으로 배양하고, 분화능력을 가지고 있는지 여부를 효율이 높은 분화법을 이용하여 확인하여, 분화능력을 보유하는 줄기세포를 제조하는 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 분화능력을 보유하는 줄기세포를 검증을 통하여 제조하는 방법 및 이를 통하여 제조된 줄기세포를 제공하는 것이다.

본 발명을 통하여 식물로부터 캘러스를 유도하여, 고체배지 또는 액체배지에서 안정적으로 배양하여, 식물 줄기세포를 제조하고, 분화능력을 검증하여 진정한 의미의 식물 줄기세포를 제공할 수 있게 되었다.

식물로부터 탈분화하여 캘러스로 유도된 세포들은 고체배지나 액체배지에서 수월하게 배양이 되며, 단기간 또는 장기간 계대배양을 통하여 유지된다. 이렇게 유지되는 세포들이 분화 능력을 보유하고 있는 지 여부가, 줄기세포 진위를 판단하는 기준이기에, 본 발명의 배발생 분화 방법인 확인된 갑작스럽게 농도를 크게 감소시키는 ‘옥신 결핍 쇼크’ 방법을 통하여 줄기세포의 진위를 효과적으로 판별 또는 검증할 수 있게 되었다.

본 발명에서는 다양한 식물로부터 캘러스 줄기세포를 유도하는 방법을 제시하고, 안정적으로 배양하여, 줄기세포를 제조한다. 또한 이들 줄기세포의 진위를 파악할 수 있는 기준이 되는 분화능력을 판별 또는 검증하기 위하여 효율이 우수한 분화법을 개발하였다. 이러한 방법을 통하여 다양한 식물로부터 유도한 줄기세포가 분화능을 갖춘 줄기세포임을 확인하였다. 이렇게 검증을 수반하는 줄기세포 제조법을 위하여 이하 설명하는 발명을 각각 실시하였다.

본 발명에서 이용하는 줄기세포 유도 방법은 공지의 고체배양법이다. 고체 배양은 고체배지위에 캘러스세포를 배양하는 것으로, 다양한 식물 중에서 우선 인삼으로부터 캘러스 줄기세포를 다음과 같이 유도하였다. 차아염소산 나트륨과 에틸알코올로 표면 살균처리한 잎과 줄기를 적당한 크기로 자르고 고체 배양용 배지 위에 무균적으로 배양한다. 배양 수주 후에 뿌리와 잎의 절단면에서 캘러스 세포가 형성되어 자라기 시작하면, 캘러스를 연속적으로 계대배양 하여 안정된 줄기세포를 확립한다.

캘러스 세포 유도에 사용되는 배지는 MS (Murashige & Skoogs) 배지가 가장 적합하였다. 이 MS배지에 한천을 0.5-1.0%첨가하여 고체 배지로 이용한다. 생장조절제로서 2,4-D와 키네틴(kinetin)을 사용함이 바람직하다. 또한 배지내에 자당(sucrose)의 농도를 30 g/L또는 그 이하로 유지할 때 세포의 성장이 좋아 바람직하였다.

유도된 줄기세포는 각각 고체배지 및 액체배지에서 안정적으로 배양되었으며, 계대 배양을 통하여 장기간 유지 보존이 가능하다. 하지만 계대배양으로 장기간 유지하면 줄기세포의 분화능력이 감소하게 되어, 더 이상 줄기세포로 인정받을 수 없게 된다. 따라서 줄기세포를 분화시켜보아 배발생 (embryogenesis) 여부를 판단하여 줄기세포의 진위를 판단하게 되었다.

줄기세포의 검증에는 갑작스럽게 농도를 크게 감소시키는 옥신 결핍 쇼크 (auxin deficiency shock)법이 효과적이었다. 갑자기 옥신의 농도를 1.0 ppm 이상 감소시키며 옥신 불포함 배지에서 분화를 유도하면, 줄기세포가 분화능력을 보유하고 있는 한 배발생이 효율적으로 이루어지어, 줄기세포의 검증에 효과적이었다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 1> : 캘러스 유도 및 줄기 세포 확립

식물 개체의 한번 분열되었던 조직의 체세포가 분열능을 획득하여 분열능이 왕성한 원시세포로 탈분화 (de-differentiation) 시키면, 이때 생성된 원시세포는 계속 분열하여 세포 덩어리 형태의 캘러스를 형성한다. 캘러스는 주로 고체배지 위에서 형성되고 성장하며, 액체배지를 사용하면 현탁세포 (suspended cell)가 형성된다. 이들은 모두 미분화된 원시세포로서 분열하여 식물 개체를 형성할 수 있는 능력이 있으면 줄기세포라 한다.

식물로부터 캘러스 및 줄기세포를 얻기 위하여, 생체시료를 이용하여 캘러스를 유도하였고 안정적 배양을 통하여 줄기세포를 확립하였다. 생체시료는 충남 금산에서 채취한 3년생 인삼을 대표적인 예로서 선택하여 줄기세포를 유도하였다.

채집한 인삼의 학명은 Panax 이고, 3년생으로 생장상태가 좋은 뿌리와 잎을 캘러스 유도에 이용하였다. 생체시료를 약 10cm 길이로 자른 다음 세척한 후 트윈-20 0.1%를 함유한 0.5% sodium hypochloride 용액에 넣고 교반하며 20분간 표면살균 하였다. 이 기간 중에 30초 동안 초음파 파쇄 (sonication)를 병행하여 생체시료 표면의 미세 기포를 제거하였다. 여기에 멸균수로 1회 세척한 후 70% 에탄올 용 액에 넣어 1분간 재차 표면 살균한 다음, 살균 및 세척된 생체시료를 약 0.5 cm 정도의 크기로 자른 뒤, 식물세포배양용 MS (Murashige & Skoogs) 배지에 2,4-D 및 kinetin을 각각 1.0, 0.1 mg/L 첨가하고 한천을 혼합한 고체배양용 배지위에 옮겨 배양을 시작하였다. MS 배지의 조성은, NH₄NO₃(1650 mg/L), KNO₃(1900 mg/L), CaCl₂2H₂O(440 mg/L), MgSO₄7H₂O(370 mg/L), KH₂PO₄(170 mg/L), KI(0.83 mg/L), H₃BO₃(6.2 mg/L), MnSO₄4H₂O(22.3 mg/L), ZnSO₄7H₂O(8.6 mg/L), Na₂MoO₄2H₂O(0.25 mg/L), CuSO₄5H₂O(0.025 mg/L), CoCl₂6H₂O(0.025 mg/L), FeSO₄7H₂O(27.8 mg/L), Na₂EDTA2H₂O(37.3 mg/L), Inositol(100 mg/L), Nicotinic acid(0.5 mg/L), Pyridoxine HCl(0.5 mg/L), Thiamine HCl(0.1 mg/L), Glycine(2 mg/L), Sucrose(3%) 이었다.

모든 조작은 무균 조작대에서 무균 적으로 실시하였고, 25℃ 암 조건에서 배양 시작 후 2-3주 후부터 캘러스가 유도되어 자랐다. 여러 생체시료로부터 캘러스가 잘 유도되었으며, 이중 우수한 것을 매 1개월마다 새로운 배지에 옮겨 계대배양을 실시하여 줄기세포 (stem cell)를 확립하였다.

< 실시예 2> : 줄기세포 배양에서 생장조절제의 영향

인삼 줄기세포 배양에서 생장조절제 (growth regulator)인 식물호르몬 (phytohormone)의 영향을 연구하였다. 생장조절제로서 옥신(auxin)과 사이토키 닌(cytokinin)을 실험하였다. 옥신으로는 2,4-D, NAA, IAA를, 사이토키닌으로는 키네틴(kinetin)을 실험하였다.

상기 유도된 캘러스 줄기세포를 배양하는 고체 배지에 첨가하는 생장 조절제의 성분을 변화시키면서 캘러스 생장에 미치는 영향을 관찰하였다. 좀 더 구체적으로 생장조절제의 종류에 따른 1개월 동안 캘러스 세포중량 증가량을 측정하여 생장조절제의 영향을 판단하였다. 사용한 생장 조절제의 각각의 농도는 2,4-D의 경우 1 mg/L, NAA의 경우 1 mg/L, IAA의 경우 5 mg/L, 키네틴의 경우 0.5 mg/L 로 하였다. 표 1에서 보듯이 가로의 옥신과와 세로의 키네틴의 조합으로 생장조절제를 첨가하여 영향을 관찰하였다.

표 1의 결과에서 보듯이 2,4-D 와 NAA가 세포 생장에 우수한 결과를 나타내었다. 키네틴의 영향은 그리 크지 않지만 세포 생장에 긍정적이었다. 옥신과 사이토키닌을 첨가하지 않는 경우 세포 생장에 큰 저해를 받음을 알 수 있었다.

성장조절제에 따른 1개월 동안 캘러스 줄기세포 중량 증가량 (건조중량 그램)

옥신 사이토키닌	2,4-D 1 mg/L	NAA 1 mg/L	IAA 5 mg/L	0
kinetin 0.5 mg/L	1.7 g	1.5	1.2	0.7
0	1.5	1.4	1.0	0.4

< 실시예 3> : 줄기세포의 분화

전기 실시예의 배양 세포를 이용하여 줄기세포의 분화를 유도하였다. 분화 능력은 줄기세포의 가장 중요한 특징이다. 옥신과 키네틴이 포함된 배지에서 배양하던 상기 인삼 세포를 갑자기 옥신과 키네틴이 전무한 배지로 옮겨, 식물호르몬 결핍 쇼크를 가하고, 분화 여부를 조사하였다. 이때 옮기기 전후의 배지는 식물호르몬 외에는 동일한 배지이다.

분화 유도 후 약 1주일 이후부터 배발생 (embryogenesis)을 관찰할 수 있었다. 도 1에서 보듯이. 초기에는 대부분 둥근 배 (globular embryo)가 관찰되었으나, 시간이 지날수록 하트모양 배 (heart type embryo) 및 성숙 배 (torpedo stage embryo)도 관찰되었다. 성숙 배는 발아시켜 뿌리 및 줄기를 얻을 수 있었다.

< 실시예 4> : 줄기세포 분화에서 식물호르몬의 영향

줄기세포의 분화에서 식물호르몬의 영향은 절대적이다. 식물호르몬의 변화를 통하여 분화가 유도되기 때문에, 식물호르몬을 변화시키는 다양한 방법을 적용하여 줄기세포 분화에 미치는 영향을 연구하였다. 줄기세포의 분화는 식물호르몬이 감소할 때 발생되기 때문에, 다양한 식물호르몬 감소 방법을 구상하였다. 좀 더 구체적으로, 얼마나 빨리 식물호르몬을 감소시키는 식물호르몬 감소속도와 감소폭의 영향을 연구하였다.

감소속도는 갑자기 식물호르몬이 전무한 배지로 옮기는 방법과, 서서히 감소시키는 방법을 각각 적용하여 조사하였다. 서서히 감소시키는 방법은 상기 배양되고 있는 인삼세포에 5일 간격으로 옥신인 2,4-D를 초기 2.0 ppm에서 1.0 ppm, 다시 0.5 ppm, 그리고 0.0 ppm으로 감소시키고 분화 결과를 관찰하였다. 상기 모든 방법에서 사이코카인인 키네틴은 0.0 ppm으로 유지하였다.

또한 감소폭의 영향을 관찰하기 위하여, 각각 2,4-D 2.0 ppm, 1.0 ppm, 0.5 ppm, 0.2 ppm에서 배양되던 상기 인삼세포를 갑자기 2,4-D가 전무한 배지로 옮겨 배양 시켜 분화 효율을 조사하였다.

표 2의 결과와 같이, 인삼세포의 분화는 갑자기 식물호르몬을 감소시킬 때 분화효율이 좋았다. 2,4-D 농도를 갑자기 감소시키면 분화가 유도되는 것을 관찰할 수 있었으나, 서서히 감소시키면 세포가 적응하여 미분화 상태로 계속 유지됨을 알 수 있었다. 분화감소폭의 경우, 옥신의 농도 감소폭이 1.0 ppm 이상에서 분화 효율이 좋았다. 즉, 갑자기 큰 농도 폭으로 2,4-D를 감소시키면 줄기세포의 분화에 의한 배 발생이 촉진됨을 알 수 있었다. 이렇게 갑자기 1.0 ppm 이상의 옥신 농도를 감소시키는 것은, 세포에게 갑작스런 옥신 결핍 쇼크 (auxin deficiency shock)를 가하는 것이며, 이때 줄기세포는 효율적으로 분화되어 배를 발생시키는 것을 확인할 수 있었다.

옥신 감소 속도와 감소폭이 줄기세포 분화에 미치는 영향

구분		결과(1 cm2당 배 발생 수)	조건
감소 속도	갑자기	18 개	갑자기 2,4-D 농도 2.0→0.0 ppm로 감소
	서서히	0 개	5일 간격으로 2,4-D 농도 2.0→1.0→0.5→0.0 ppm로 감소
감소폭	0.2 ppm	1 개	갑자기 2,4-D 농도 0.2→0.0 ppm로 감소
	0.5 ppm	3 개	갑자기 2,4-D 농도 0.5→0.0 ppm로 감소
	1.0 ppm	19 개	갑자기 2,4-D 농도 1.0→0.0 ppm로 감소
	2.0 ppm	18 개	갑자기 2,4-D 농도 2.0→0.0 ppm로 감소

< 실시예 5> : 옥신 결핍 쇼크에 의한 세포의 분화 능력 검증

상기 실시예에서 확인된 갑작스럽게 농도를 크게 감소시키는 옥신 결핍 쇼크법을 이용하여, 다양한 배양 세포의 분화 능력을 검증하였다. 다양한 세포로는 캘러스 유도 후 1개월, 1년, 2년, 5년 간 계대 배양되어 유지되고 있는 인삼 세포를 대상으로 하였으며, 갑자기 2,4-D 농도를 2.0 ppm 감소시키는 옥신 결핍 쇼크를 가하였다.

표 3에서 보듯이, 캘러스 유도 후 시간이 지날수록 분화 능력이 약화되거나 잃어버리는 결과를 얻을 수 있었다. 따라서 배양하고 있는 식물 세포가 분화능력이 있는 줄기세포 여부를 확인하기 위하여 확인된 갑작스럽게 농도를 크게 감소시키는 옥신 결핍 쇼크를 검증 방법으로 배발생을 확인하는 검증법이 유용하게 활용될 수 있다.

옥신 결핍 쇼크에 의한 계대 배양 세포의 분화능력 판별

배양 세포 종류 (캘러스 유도 후 계대배양 기간)	옥신결핍쇼크 분화 결과 (1 cm2당 배 발생 수)	줄기세포 여부
1 개월	16	o
1 년	15	o
2 년	5	x
5 년	0	x

< 실시예 6> : 다양한 식물로부터 줄기세포 유도 및 검증

상기 실시예와 같은 방법으로 다양한 식물로부터 캘러스를 유도하고, 고체배지 및 액체배지에서 안정적으로 배양하여 줄기세포를 유도하였다. 적용한 식물로서, 담배, 당근과 같은 초본류 2종과, 은행나무, 희수, 산뽕나무와 같은 목본류 3종을 선택하여 줄기세포를 유도하였다.

상기 실시예와 같이, 유도된 5종의 줄기세포로부터 배발생을 유도하기 위하여, 갑자기 2,4-D 농도를 2.0 ppm 감소시키는 옥신 결핍 쇼크를 가하였다. 2주 후 발생한 배의 수를 세어서 표 5에 나타내었다.

서로 다른 5종의 식물로부터 유도한 줄기세포의 배발생 능력 검증

줄기세포 종류	옥신결핍쇼크 분화 결과 (1 cm2당 배 발생 수)	배발생 능력
담배 (Nicotiana tabacum)	21	o
당근 (Daucus carota)	19	o
은행나무 (Ginkgo biloba)	10	o
희수 (Camptotheca acuminata)	8	o
산뽕나무 (Morus bombycis)	11	o

표 4에서 보듯이 5종 줄기세포 모두로부터 배 발생이 관찰되었다. 목본류보다 초본류에서 많이 발생한 것처럼, 줄기세포 종류에 따라 발생한 배의 수에 차이는 있지만, 확인된 갑작스럽게 농도를 크게 감소시키는 옥신 결핍 쇼크 방법에 의한 줄기세포 분화능력 검증에 모두 성공하였다.

갑작스런 옥신 결핍 쇼크 (auxin deficiency shock)에 의한 배발생 (embryogenesis) 과정. (1) 발생전(pre-embryo), (2) 초기 둥근 배(globular embryo), (3) 성숙 배(torpedo stage embryo).

Claims (6)

1. 식물의 살아있는 조직으로부터 캘러스 유도용 배지에서 캘러스를 유도하여, 고체배지 또는 액체배지에서 배양하고, 분화능력 보유 여부를 검증하여, 식물 줄기세포를 제조하는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 캘러스 유도용 배지로 Murashige & Skoogs 배지를 사용하고, 생장조절제 식물호르몬을 2,4-D 1 mg/L, kinetin 0.1 mg/L로 사용함을 특징으로 하는 식물 줄기세포의 제조방법.
3. 제 1항에 있어서, 배양 세포에 식물호르몬 쇼크 (shock)를 가한 뒤, 배 (embryo) 발생 여부를 판단하여, 분화능력을 검증함을 특징으로 하는 식물 줄기세포의 제조방법.
4. 제 3항에 있어서, 식물호르몬은 옥신 (auxin) 임을 특징으로 하는 식물 줄기세포의 제조방법.
5. 제 4항에 있어서, 옥신은 2,4-D 및 1-나프탈렌아세트산 (NAA) 임을 특징으로 하는 식물 줄기세포의 제조방법.
6. 제 3항에 있어서, 식물호르몬 쇼크를 가함에 있어서, 세포를 옥신 1 에서 10 ppm 사이의 농도의 배지에서 배양하다, 옥신이 전무한 배지로 갑자기 옮겨, 확인된 갑작스럽게 농도를 크게 감소시키는 옥신 결핍 쇼크 (auxin deficiency shock)를 가함을 특징으로 하는 식물 줄기세포의 제조방법.

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