CN109479723B - 一种提高百子莲体胚苗诱导效果的方法 - Google Patents

一种提高百子莲体胚苗诱导效果的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种提高百子莲体胚苗诱导效果的方法，包括外植体的取材、愈伤组织的诱导、愈伤组织的继代培养、胚性愈伤组织的诱导、胚性细胞的成熟胚诱导以及体胚苗的诱导等步骤。本发明根据百子莲胚性启动与维持的激素合成代谢、信号转导特点，利用小花梗作为外植体诱导愈伤组织，通过愈伤组织继代和诱导，获得胚性愈伤组织，在体胚诱导期改变糖和激素配比，调控细胞极性，以诱导数量较多、发育同步的体细胞胚胎，并在已诱导的体细胞胚胎发育过程中，通过优化诱导培养基方案，调节激素的合成与信号，以获得形态完整，长势良好，数量较多的体胚苗。解决了百子莲胚性细胞在频繁继代过程中产生的成熟胚诱导数量少、胚胎败育、体胚苗数量低的问题。

Description

一种提高百子莲体胚苗诱导效果的方法
技术领域
本发明属于植物良种快繁技术领域，具体涉及一种提高百子莲体胚苗诱导效果的方法。
背景技术
百子莲(Agapanthus praecox ssp.orientalis)又名“蓝百合”、“非洲百合”，原产非洲南部的南非地区及莱索托王国，为单子叶多年生草本花卉，具有较强的观赏性。近半个世纪以来，百子莲在国际花卉业发展中脱颖而出，成为风靡全球的鲜切花、盆栽及地被花卉，并体现出极佳的观赏价值。百子莲抗热、抗旱，并具有较强的抗寒性，在道路绿化、土壤修复领域具有巨大的发展空间，目前市场上种苗供不应求。
百子莲在原产地常用种子或分株繁殖，但引种国内后存在发芽率低，繁殖周期长，繁殖系数低以及后代易分化等缺点。体细胞胚胎发生途径具有数量多、繁殖快、结构完整、植株再生率高以及不受季节影响等特点，可保持百子莲优良性状、获得大量体胚苗，因此被认为是百子莲无性扩繁和种质保存的较佳途径。体胚苗是指利用植物细胞全能性和植物组织培养技术平台，通过胚性细胞诱导出植物成熟胚胎，再生成的小植株，该植株具有植物种子发育成实生苗的极性结构和基本特征。
目前国内的上海交通大学、上房园艺公司等单位多用小花梗诱导愈伤组织，进而通过胚性细胞途径得到再生植株，但小花梗的取材有较大局限性，每年仅5～6月份百子莲蕾期方可取材，而且胚性细胞的诱导周期较长，达9个月之久。初期诱导的胚性细胞，在没有生长素类物质毒莠锭(Picloram，PIC)的培养基上可以很快萌发为体细胞胚胎，进而发育为完整的体胚苗，但初期发生的胚性细胞多为单细胞起源，且数量较少，因此，为了维持胚性细胞的数量，通常在胚性细胞阶段进行继代培养。而频繁继代会导致材料的同步化程度降低，畸形胚频发，最终严重削弱了体胚发生体系的高效性，导致体胚苗数量的减少。
为解决频繁继代培养造成的体胚数量减少，以及继代造成工作量增加的问题，相关研究人员做了胚性细胞的超低温保存研究，旨在减少继代频次，同时能够很好维持胚性愈伤组织的胚性，从而利于后期的体胚苗诱导。但超低温保存技术要求相对较高，同时也会导致材料损失。因此，在百子莲胚性愈伤组织继代增殖的过程中，通过调控体胚发生过程，增加胚性细胞数量，以及调控体胚萌发质量是解决体胚萌发及成苗数量减少的有效途径。而百子莲以往的研究中，对于体胚诱导效果调控的相关研究并未见报道。
发明内容
本发明的目的是解决百子莲胚性细胞在频繁继代过程中产生的成熟胚诱导数量较少，胚胎败育、体胚苗诱导数量较低的问题，提供一种提高百子莲体胚苗诱导效果的方法。
技术方案
百子莲在国内的体细胞胚胎途径快繁中，一般通过调控生长素信号获取体细胞胚胎，并诱导成苗。本发明根据百子莲胚性启动与维持的激素合成代谢、信号转导特点，利用小花梗作为外植体诱导愈伤组织，通过愈伤组织继代和诱导，获得胚性愈伤组织，在体胚诱导期加入外源生长调节物质，调控细胞极性，以诱导数量较多、发育同步的体细胞胚胎，同时，在已诱导的体细胞胚胎发育过程中，通过优化诱导培养基方案，调节激素的合成与信号，以获得形态完整，长势良好，数量较多的体胚苗。本发明利用激素合成和代谢的特性，以及植物糖代谢的特点，提高了成熟体胚诱导效率、体胚苗的数量，优化百子莲体胚再生途径。具体方案如下：
一种提高百子莲体胚苗诱导效果的方法，包括如下步骤：
(1)外植体的取材：5～6月份，取4～5年生百子莲未开裂的小花苞，在无菌操作台上进行消毒处理，然后用ddH2O冲洗3～5次，用无菌滤纸吸干小花苞表面的水分，然后切取小花梗外植体，将小花梗外植体切成0.7～1.0cm的小段；
(2)愈伤组织的诱导：取0.7～1.0cm的小花梗外植体小段，平放状态接种于愈伤组织诱导培养基中，22～28℃暗培养12～18d，可见白色半透明的愈伤组织生成，30d天后进行愈伤组织的继代培养；
(3)愈伤组织的继代培养：取带有残留小花梗组织的愈伤组织细胞团，放置在愈伤组织继代培养基上，22～28℃暗培养，以60d为一个继代周期，继代培养2次，愈伤组织逐渐转变为微黄色；
(4)胚性愈伤组织的诱导：取不含残留小花梗组织的愈伤组织，放置在胚性愈伤组织诱导培养基上，22～28℃暗培养，60d后，微黄色愈伤组织表面出现单细胞起源的胚性愈伤组织；
(5)胚性细胞的成熟胚诱导：取0.5g胚性愈伤组织，放置在成熟胚诱导培养基上，22～28℃光照培养，得到成熟胚；
(6)体胚苗的诱导：取0.25g成熟胚组织，放置在体胚苗诱导培养基上，22～28℃光照培养，30d后得到带有根系的体胚苗。
进一步，步骤(1)中，所述消毒处理的方法是：先在75％(v/v)的乙醇溶液里浸渍1min，接着用ddH2O冲洗3-5次，然后在2％的次氯酸钠溶液里浸渍5min。
进一步，步骤(2)中，所述愈伤组织诱导培养基组分为：MS+2.0mg·L-1PIC+3％蔗糖+1％琼脂，pH5.8。制备方法：每升ddH2O中加入4.43g MS干粉培养基，2.0mg PIC(毒莠锭)，30g蔗糖，10g琼脂，混合均匀后，调pH5.8。
进一步，步骤(3)中，所述愈伤组织继代培养基组分为：MS+1.5mg·L-1PIC+3％蔗糖+1％琼脂，pH5.8。
进一步，步骤(4)中，所述胚性愈伤组织诱导培养基组分为：MS+1.5mg·L-1PIC+3％蔗糖+1％琼脂，pH5.8。
进一步，步骤(5)中，所述成熟胚诱导培养基的组分为：MS+2％蔗糖+1％麦芽糖+1％琼脂，pH5.8。
进一步，步骤(5)中，所述光照培养的光照强度为2500lx。
进一步，步骤(6)中，所述体胚苗诱导培养基的组成为：MS+2％蔗糖+多效唑0.5mg·L-1+0.6％琼脂，pH5.8。
进一步，步骤(6)中，所述光照培养的光照强度为3500lx。
本发明的有益效果：本发明利用蔗糖以及麦芽糖作为碳源，通过种类和浓度配比的调控，提高了体细胞胚胎的诱导率，提高了成熟胚数量；本发明在成苗培养基中添加合理浓度的植物生长调节剂多效唑，通过调控赤霉素信号途径，间接调控了生长素的极性转运，减少了胚胎败育，使成苗数量显著增加，此外由于激素调控的优化，本发明进行胚性细胞诱导成苗较快，减少了畸形苗的发生。
附图说明
图1为小花梗外植体小段在愈伤组织诱导培养基中培养15d后的解剖镜观察图；
图2为不含残留小花梗组织的愈伤组织在胚性愈伤组织诱导培养基上培养60d后的解剖镜观察图；
图3为不含残留小花梗组织的愈伤组织诱导后的非胚性与胚性细胞显微形态观察图；
图4为成熟胚的解剖镜观察图；
图5为体胚苗的解剖镜观察图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
实施例1
一种提高百子莲体胚苗诱导效果的方法，包括如下步骤：
(1)外植体的取材：5～6月份花期，取4～5年生百子莲未开裂的小花苞，在无菌操作台上进行消毒处理(先用75％(v/v)乙醇处理1min，接着用ddH2O冲洗4次，然后用2％次氯酸钠消毒处理5min)，然后用ddH2O冲洗4次，用无菌滤纸吸干小花苞表面的水分，然后切取小花梗外植体，将小花梗外植体切成0.7～1.0cm的小段；
(2)愈伤组织的诱导：取0.7～1.0cm的小花梗外植体小段，平放状态接种于愈伤组织诱导培养基中，25℃暗培养15d，可见白色半透明的愈伤组织生成(图1为小花梗外植体小段在愈伤组织诱导培养基中培养15d后的解剖镜观察图)，愈伤组织诱导率为100％，30d天后进行愈伤组织的继代培养；
所述愈伤组织诱导培养基组分为：MS+2.0mg·L-1PIC+3％蔗糖+1％琼脂，pH5.8。制备方法：每升ddH2O中加入4.43g MS干粉培养基，2.0mg PIC(毒莠锭)溶液，30g蔗糖，10g琼脂，pH5.8。培养基在121℃高压灭菌锅中灭菌处理25min后拿到超净工作台内分装，培养皿规格为：90mm×16mm，每皿分装培养基25mL，冷却凝固后，进行外植体的接种，每皿接种10～15个小花梗外植体小段。
(3)愈伤组织的继代培养：取带有残留小花梗组织的愈伤组织细胞团，放置在愈伤组织继代培养基上，25℃暗培养，以60d为一个继代周期，继代培养2次，愈伤组织逐渐转变为微黄色，部分细胞团现不透明状，表面粗糙；
所述愈伤组织继代培养基组分为：MS+1.5mg·L-1PIC+3％蔗糖+1％琼脂，pH5.8。培养皿规格为：90mm×16mm。
(4)胚性愈伤组织的诱导：取不含残留小花梗组织的愈伤组织，放置在胚性愈伤组织诱导培养基(培养基组分为：MS+1.5mg·L-1PIC+3％蔗糖+1％琼脂，pH5.8)上，25℃暗培养，60d后，多数细胞团现不透明状，微黄色愈伤组织表面出现单细胞起源的胚性愈伤组织(图2为不含残留小花梗组织的愈伤组织在胚性愈伤组织诱导培养基上培养60d后的解剖镜观察图)；
胚性细胞的细胞染色验证：取3mm大小的细胞团，放入1.5mL的离心管中，加入500μL的醋酸洋红染色液，在室温下静置30min，用移液器吸取染色液，弃去染色液；然后加入超纯水，不断吹打细胞团，用移液器吸取溶液，再次加入超纯水，本步骤重复3次，取载玻片一枚，用1mL吸头剪去顶端2mm处，吸取直径1mm大小的细胞团，放在载玻片上，放置盖玻片，避免产生气泡，然后轻轻压平，放在Leica DM2500显微镜下观察并拍照(见图3，图3为不含残留小花梗组织的愈伤组织诱导后的非胚性与胚性细胞显微形态观察图)，可观察到细胞核较大，细胞质浓密的胚性细胞。
(5)胚性细胞的成熟胚诱导：取0.5g胚性愈伤组织，放置在成熟胚诱导培养基(MS+2％蔗糖+1％麦芽糖+1％琼脂，pH5.8)上，25℃光照培养，光照强度2500lx，15d后，多数细胞团表面出现胚状颗粒物，呈白色不透明状，30d后，胚状颗粒物生长为成熟胚(图4为成熟胚的解剖镜观察图)，为棒状结构，上部转绿色，下部依然为白色，呈独立分布状；
以上述诱导方法作为实施例1处理组，同时设置对照组，对照组中成熟胚诱导培养基组分为：MS+3％蔗糖+1％琼脂，pH5.8，其余与实施例1处理组相同。经统计，光照培养30d后，实施例1处理组1g胚性细胞诱导成熟胚的数量达232.66个，比对照组显著增加了31.20％。
(6)体胚苗的诱导：取0.25g成熟胚组织，放置在体胚苗诱导培养基(培养基组分为：MS+2％蔗糖+多效唑0.5mg·L-1+0.6％琼脂，pH5.8)上，25℃光照培养，光照强度3500lx，30d后得到带有根系的体胚苗(图5为体胚苗的解剖镜观察图)。实施例1中，1g成熟胚组织形成的体胚苗数量达258.64。
对比例1
将实施例1的步骤(6)中体胚苗诱导培养基中的多效唑去掉，即将体胚苗诱导培养基改为：MS+2％蔗糖+0.6％琼脂，pH5.8，其余与实施例1相同。
经统计，光照培养30d后，对比例1组1g成熟胚组织形成的体胚苗数量达107.32，而实施例1组1g成熟胚组织形成的体胚苗数量达258.64，比对比例1组显著增加了141.99％。

Claims (4)

1.一种提高百子莲体胚苗诱导效果的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）外植体的取材：5~6月份，取4~5年生百子莲未开裂的小花苞，在无菌操作台上进行消毒处理，然后用ddH2O冲洗3~5次，用无菌滤纸吸干小花苞表面的水分，然后切取小花梗外植体，将小花梗外植体切成0.7~1.0 cm的小段；
（2）愈伤组织的诱导：取0.7~1.0 cm的小花梗外植体小段，平放状态接种于愈伤组织诱导培养基中，22~28℃暗培养12~18 d，可见白色半透明的愈伤组织生成，30d天后进行愈伤组织的继代培养；
（3）愈伤组织的继代培养：取带有残留小花梗组织的愈伤组织细胞团，放置在愈伤组织继代培养基上，22~28℃暗培养，以60 d为一个继代周期，继代培养2次，愈伤组织逐渐转变为微黄色；
（4）胚性愈伤组织的诱导：取不含残留小花梗组织的愈伤组织，放置在胚性愈伤组织诱导培养基上，22~28℃暗培养，60 d后，微黄色愈伤组织表面出现单细胞起源的胚性愈伤组织；
（5）胚性细胞的成熟胚诱导：取0.5 g胚性愈伤组织，放置在成熟胚诱导培养基上，22~28℃光照培养，得到成熟胚；
（6）体胚苗的诱导：取0.25 g成熟胚组织，放置在体胚苗诱导培养基上，22~28℃光照培养，30 d后得到带有根系的体胚苗；
步骤（2）中，所述愈伤组织诱导培养基组分为：MS + 2.0 mg∙L-1 PIC + 3%蔗糖 + 1%琼脂，pH5.8；
步骤（3）中，所述愈伤组织继代培养基组分为：MS + 1.5 mg∙L-1 PIC + 3%蔗糖 + 1%琼脂，pH5.8；
步骤（4）中，所述胚性愈伤组织诱导培养基组分为：MS + 1.5 mg∙L-1 PIC + 3%蔗糖 +1%琼脂，pH5.8；
步骤（5）中，所述成熟胚诱导培养基的组分为：MS + 2%蔗糖 + 1%麦芽糖 + 1%琼脂，pH5.8；
步骤（6）中，所述体胚苗诱导培养基的组成为：MS + 2%蔗糖 + 多效唑0.5 mg·L-1 +0.6 %琼脂，pH5.8。
2.如权利要求1所述提高百子莲体胚苗诱导效果的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述消毒处理的方法是：先在75%的乙醇溶液里浸渍1 min，接着用ddH2O冲洗3~5次，然后在2%的次氯酸钠溶液里浸渍5 min。
3.如权利要求1所述提高百子莲体胚苗诱导效果的方法，其特征在于，步骤（5）中，所述光照培养的光照强度为2500 lx。
4.如权利要求1至3任一项所述提高百子莲体胚苗诱导效果的方法，其特征在于，步骤（6）中，所述光照培养的光照强度为3500 lx。
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Inventor after: Zhang Yan

Inventor after: Li Meng

Inventor after: Xia Weili

Inventor after: Shi Qinchuan

Inventor after: Wang Miao

Inventor before: Yue Jianhua

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GR01 Patent grant
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