CN112673960A - 利用糖源配比优化百子莲胚性愈伤继代周期及频次的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用糖源配比优化百子莲胚性愈伤继代周期及频次的方法，包括以下步骤：A、外植体取材与消毒；B、愈伤组织的诱导；C、愈伤组织的继代培养；D、胚性愈伤组织的诱导；E、胚性愈伤组织的继代；F、成熟胚的诱导。本发明通过利用糖配比调控生长，利用麦芽糖分解利用较慢的特性，优化了百子莲体胚发生体系胚性愈伤组织的继代周期，减少继代频次，得到状态较好的百子莲胚性愈伤组织。且本发明方法获得了较高的胚性愈伤组织增殖系数及成胚数量。

Description

利用糖源配比优化百子莲胚性愈伤继代周期及频次的方法

技术领域

本发明属于组织培养技术领域，具体涉及一种利用糖源配比优化百子莲胚性愈伤继代周期及频次的方法。

背景技术

百子莲(Agapanthus praecox)原产非洲南部，为单子叶多年生草本花卉，具有较强的观赏性和极强的抗性，在园林中的应用逐渐增加，目前市场上种苗供不应求。

百子莲在原产地常用种子或分株繁殖，但引种国内后存在发芽率低，繁殖周期长，繁殖系数低等缺点。体细胞胚胎发生途径具有数量多、繁殖快、结构完整、植株再生率高以及不受季节影响等优势，被认为是百子莲无性扩繁和种质保存的较佳途径。

国内百子莲体胚发生体系的一般流程为：选择外植体诱导出愈伤组织(Callus，Ca)，通过继代培养诱导出(Embryogenic callus，EC)，EC经过继代增殖得到大量的细胞群体，在需要体胚诱导时，将培养基中的外源生长素类物质毒莠定(Picloram，PIC)去除，继续培养，以利于诱导成熟胚胎并发育为种苗。在百子莲的体胚体系中，EC继代周期一般为30d，日本学者报道的继代周期一般为4周(Suzuki，2002)。

体胚体系快繁的核心在于：利用植物体细胞全能性发育成完整的植株，而EC可以通过不断继代培养得以扩增，在具有快速繁殖能力及较高的再生能力的前提下，理论上可以得到无限数量的胚性细胞。但频繁继代会发生基因变异、代谢紊乱，导致材料的同步化程度降低，增殖系数减少，细胞团形态参差不齐，再生能力下降，最终诱导形成畸形胚或胚胎败育。同时，频繁继代会较大程度增加人员工作量及物品的消耗，对产业化生产形成巨大挑战。因此，胚性愈伤组织保存、扩繁的过程中如何保证质量、增加数量十分重要，决定整个体胚发生体系的效率。

为解决频繁继代培养造成的材料状态不佳，以及工作量增加的问题，相关研究人员做了百子莲EC的超低温保存研究，旨在减少继代频次，同时能够维持胚性愈伤组织的胚性，从而利于后期的体胚苗诱导。但超低温保存技术要求相对较高，同时也会导致材料损失。

因此，在百子莲EC继代增殖的过程中，通过优化继代周期，减少继代培养的频次，得到状态良好、数量较多、体胚萌发率高的EC是百子莲体胚快繁的一个关键环节，而相关研究并未见报道。

关于植物离体培养继代频次和继代周期的研究，其他植物有少量报道。一般认为，培养时间越久，愈伤组织容易分化或褐化，最终导致再生能力降低(刘苗苗，2016)。金晓玲(2014)发现继代次数对愈伤组织增殖及不定芽诱导有显著影响。Peng(2015)研究认为三叶崖爬藤的愈伤组织继代次数在6～8次时可以更好的保持其品质的优良性。禾本科植物适宜的继代周期为20～40d，龙眼为20d左右，山茱萸为20～25d，石蒜愈伤组织为24～27d。综上，一般植物离体培养的继代周期为20～30d。因此，继代周期越短，继代频次越频繁，不利于离体细胞，尤其是胚性愈伤组织的离体保存。

在2020年新冠肺炎疫情的影响下，组织培养相关的生产企业及科研院所离体培养的植物材料遭受重创，由于生产工人、科研人员不能及时到岗，大量的离体培养材料由于不能及时得到继代培养或转接至新的培养基而活性下降、甚至死亡，生产及科研材料遭受重大损失，尤其是胚性愈伤组织，相对于愈伤组织和组培苗，其要求的继代周期较短，条件更加苛刻，然而关于胚性愈伤组织组织继代保存的相关报道较少。因次，延长胚性愈伤组织的继代培养周期可有效降低一些不可控因素造成的损失，保证体胚体系的再生效率；同时，减少继代频次可保证材料再生能力，减少胚性愈伤组织损耗、人力及物力的支出。

基于此，提出本发明。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种利用糖源配比优化百子莲胚性愈伤继代周期及频次的方法。通过优化EC的继代保存周期，以减少继代频次，获得数量更多、状态一致的体胚，更大限度地发挥百子莲体胚体系在种苗快繁领域的优越性。

本发明所述的愈伤组织(Callus，Ca)是指植物体局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的组织。它由活的薄壁细胞组成，可起源于植物体多种组织的活细胞。

本发明所述的胚性愈伤组织(Embryogenic callus，EC)即胚性细胞团，颜色有乳白色或黄色，表面具球形颗粒，其生长缓慢；从细胞学来看，胚性愈伤组织由等直径细胞组成，细胞较小，原生质浓厚，无液泡，常富含淀粉粒，核大，分裂活性强，具有分化成为体细胞胚胎的能力。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种利用糖源配比优化百子莲胚性愈伤组织继代周期及频次的方法，包括以下步骤：

A、外植体取材与消毒：取百子莲未开裂的小花苞，进行消毒处理后，切取其小花梗外植体，并切成小段；

B、愈伤组织的诱导：将小段的小花梗外植体接种于愈伤组织诱导培养基中，暗培养一段时间，生成带有残留小花梗组织的愈伤组织；

C、愈伤组织的继代培养：将带有残留小花梗组织的愈伤组织放置在愈伤组织继代培养基上，暗培养，得不含残留小花梗组织的愈伤组织；

D、胚性愈伤组织的诱导：将不含残留小花梗组织的愈伤组织放置在胚性愈伤组织诱导培养基中暗培养，生成胚性愈伤组织；

E、胚性愈伤组织的继代：将胚性愈伤组织放置在继代保存培养基中暗培养；

F、成熟胚的诱导：将步骤E培养后得到的胚性愈伤组织放置在成熟胚诱导培养基中，暗培养一段时间后，转至光下培养，生成成熟胚。

优选地，步骤A中，所述消毒处理的具体步骤为：先用75％(v/v)乙醇处理50～70s后，用ddH₂O冲洗3～5次，然后用5％次氯酸钠消毒处理5～7min，之后ddH₂O冲洗3～5次，再用75％乙醇处理50～70s后，用ddH₂O冲洗3～5次。

优选地，步骤A中，所述小花梗外植体切成0.7～1.0cm的小段。

优选地，步骤B中，所述愈伤组织诱导培养基组分为：MS+1.5～2.0mg·L^-1PIC+2.5～3.5％蔗糖+0.6～1.0％琼脂，pH 5.8。

优选地，步骤C中，所述愈伤组织继代培养基组分为：MS+1.5～2.0mg·L^-1PIC+1.0～1.5％蔗糖+1.5～2.0％麦芽糖+0.6～1.0％琼脂，pH5.8。本发明在愈伤组织继代培养中，加入麦芽糖的效果为促进细胞糖的积累，为胚性诱导做准备，促进胚性愈伤组织的诱导。从糖对愈伤继代效果的影响来看，愈伤组织没有胚性愈伤组织敏感。

优选地，步骤D中，所述胚性愈伤组织诱导培养基组分为：MS+1.0～1.5mg·L^-1PIC+2.5～3.5％蔗糖+0.6～1.0％琼脂，pH5.8。

优选地，步骤E中，所述胚性愈伤组织继代保存培养基组分为：MS+1.0～1.5mg·L^{- 1}PIC+1.5％蔗糖+1.5％麦芽糖+0.6～1.0％琼脂，pH5.8。增加蔗糖含量、降低麦芽糖含量的目的为保证继代培养效果。

优选地，步骤F中，所述成熟胚诱导培养基组分为：MS+3％蔗糖+0.6～1.0％琼脂，pH5.8。

优选地，步骤B中，所述暗培养温度为25℃、培养55～65d；

步骤C中，所述暗培养温度为22～28℃，以55～65d为一个继代周期，继代培养2次；

步骤D中，所述暗培养温度为22～28℃，每30d继代一次，培养50～70d；

步骤E中，所述暗培养温度为22～28℃，以55～65d为一个继代培养周期；

步骤F中，所述暗培养温度为22～28℃，培养7d；所述光下培养采用光/暗时间比为14h/10h，光照强度为50μmoL·m^-2·s^-1，培养30d。

本发明主要通过利用糖配比调控生长，利用麦芽糖分解利用较慢的特性，优化了百子莲体胚发生体系胚性愈伤组织的继代周期，减少继代频次，得到状态较好的百子莲胚性愈伤组织。

现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1、本发明通过糖源种类及浓度的调试，找到了百子莲胚性愈伤组织继代保存的较佳继代糖源配方及培养周期，与仅用蔗糖作为糖源(对比例1)做比较，可将培养周期延长一倍，继代频次减少一半以上(图7为各处理较佳的继代周期和继代频次的比较)，较大程度节省了胚性愈伤组织保存、增殖过程中的耗材、人力资源的投入。在总投入固定的情况下，本发明实施例的胚性愈伤组织增殖系数及成胚数量远远高于各对比例。

2、本发明进一步明确了合适的蔗糖和麦芽糖配比，减少了加入IAA和进行低温预处理等环节，操作性更强，权衡了细胞活性及状态与继代保存周期的关系，进一步明确了继代周期的具体时间，比较了不同继代周期情况下，体细胞胚胎的再生效率。

3、本发明技术处理简单，操作性强，有效改善了胚性愈伤组织的长期继代过程中细胞状态不佳、生产效率偏低、操作成本较高的问题。

4、本发明相对于超低温保存等方法，该方法操作简单，可行性强，成本低廉。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为实施例1切取的小花梗外植体；

图2为实施例1的愈伤组织的诱导效果；

图3为实施例1中获得的新诱导的胚性愈伤组织；

图4为实施例1中获得的继代后胚性愈伤组织；

图5为实施例1与各对比例的胚性愈伤组织的增殖系数对比图；

图6为实施例1与各对比例的成胚数量对比图；

图7为实施例1与各对比例的继代周期和继代频次对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

以下实施例提供了一种利用糖源配比优化百子莲胚性愈伤组织继代周期及频次的方法，包括以下步骤：

A、外植体取材与消毒：取百子莲未开裂的小花苞，进行消毒处理后，切取其小花梗外植体，并切成小段；

B、愈伤组织的诱导：将小段的小花梗外植体接种于愈伤组织诱导培养基中，暗培养一段时间，生成带有残留小花梗组织的愈伤组织；

C、愈伤组织的继代培养：将带有残留小花梗组织的愈伤组织放置在愈伤组织继代培养基上，暗培养，得不含残留小花梗组织的愈伤组织；

D、胚性愈伤组织的诱导：将不含残留小花梗组织的愈伤组织放置在胚性愈伤组织诱导培养基中暗培养，生成胚性愈伤组织；

E、胚性愈伤组织的继代：将胚性愈伤组织放置在继代保存培养基中暗培养；

F、成熟胚的诱导：将步骤E培养后得到的胚性愈伤组织放置在成熟胚诱导培养基中，暗培养一段时间后，转至光下培养，生成成熟胚。

步骤A中，所述消毒处理的具体步骤为：先用75％(v/v)乙醇处理50～70s后，用ddH₂O冲洗3～5次，然后用5％次氯酸钠消毒处理5～7min，之后ddH₂O冲洗3～5次，再用75％乙醇处理50～70s后，用ddH₂O冲洗3～5次。

步骤A中，所述小花梗外植体切成0.7～1.0cm的小段。

步骤B中，所述愈伤组织诱导培养基组分为：MS+1.5～2.0mg·L^-1PIC+2.5～3.5％蔗糖+0.6～1.0％琼脂，pH 5.8。

步骤C中，所述愈伤组织继代培养基组分为：MS+1.5～2.0mg·L^-1PIC+1.0～1.5％蔗糖+1.5～2.0％麦芽糖+0.6～1.0％琼脂，pH5.8。本发明在愈伤组织继代培养中，加入麦芽糖的效果为促进细胞糖的积累，为胚性诱导做准备，促进胚性愈伤组织的诱导。从糖对愈伤继代效果的影响来看，愈伤组织没有胚性愈伤组织敏感。

步骤D中，所述胚性愈伤组织诱导培养基组分为：MS+1.0～1.5mg·L^-1PIC+2.5～3.5％蔗糖+0.6～1.0％琼脂，pH5.8。

步骤E中，所述胚性愈伤组织继代保存培养基组分为：MS+1.0～1.5mg·L^-1PIC+1.5％蔗糖+1.5％麦芽糖+0.6～1.0％琼脂，pH5.8。增加蔗糖含量、降低麦芽糖含量的目的为保证继代培养效果。

步骤F中，所述成熟胚诱导培养基组分为：MS+3％蔗糖+0.6～1.0％琼脂，pH5.8。

步骤B中，所述暗培养温度为25℃、培养55～65d；

步骤C中，所述暗培养温度为22～28℃，以55～65d为一个继代周期，继代培养2次；

步骤D中，所述暗培养温度为22～28℃，每30d继代一次，培养50～70d；

步骤E中，所述暗培养温度为22～28℃，以55～65d为一个继代培养周期；

步骤F中，所述暗培养温度为22～28℃，培养7d；所述光下培养采用光/暗时间比为14h/10h，光照强度为50μmoL·m^-2·s^-1，培养30d。

通过在以上步骤A-E的条件下进行处理都能优化百子莲体胚发生体系胚性愈伤组织的继代周期，减少继代频次，得到状态较好的百子莲胚性愈伤组织。

实施例1

本实施例提供了一种利用糖源配比优化百子莲胚性愈伤继代周期及频次的方法具体步骤如下：

(1)外植体的取材与消毒：5～6月份，取4～5年生百子莲未开裂的小花苞，在无菌操作台上进行消毒处理。先用75％(v/v)乙醇处理50～70s，用ddH₂O冲洗3～5次，然后用5％次氯酸钠消毒处理5～7min，之后ddH₂O冲洗3～5次，再用75％乙醇处理50～70s，用ddH₂O冲洗3～5次。用无菌滤纸吸干小花苞表面的水分，然后切取小花梗外植体，将小花梗外植体切成0.7～1.0cm的小段(图1为小花梗外植体)；

(2)愈伤组织的诱导：取0.7～1.0cm的小花梗外植体小段，平放状态接种于愈伤组织诱导培养基中，25℃暗培养15d，可见白色半透明的愈伤组织生成(图2为愈伤组织的诱导效果)，60d天后进行愈伤组织的继代培养；

所述愈伤组织诱导培养基组分为：MS+2.0mg·L^-1PIC+3.0％蔗糖+0.7％琼脂，pH5.8。制备方法：每升ddH₂O中加入4.43g MS干粉培养基，2.0mg PIC，30g蔗糖，7.0g琼脂，pH5.8。培养基在121℃高压灭菌锅中灭菌处理20min后拿到超净工作台内分装，培养皿规格为：90mm×16mm，每皿分装培养基25mL，冷却凝固后，进行外植体的接种，每皿接种10～15个小花梗外植体小段。

(3)愈伤组织的继代培养：取带有残留小花梗组织的愈伤组织细胞团，放置在愈伤组织继代培养基上，25℃暗培养，以60d为一个继代周期，继代培养2次，愈伤组织逐渐转变为微黄色，部分细胞团现不透明状，表面粗糙；

所述愈伤组织继代培养基组分为：MS+1.5mg·L^-1PIC+1.5％蔗糖+1.5％麦芽糖+0.7％琼脂，pH5.8。培养皿规格为：90mm×16mm。

(4)胚性愈伤组织的诱导：取不含残留小花梗组织的愈伤组织，放置在胚性愈伤组织诱导培养基(培养基组分为：MS+1.5mg·L^-1PIC+3.0％蔗糖+0.7％琼脂，pH5.8)上，25℃暗培养，每30d继代一次，60d后，多数细胞团现不透明状，微黄色愈伤组织表面出现单细胞起源的胚性愈伤组织(图3为新诱导的胚性愈伤组织)。

(5)胚性愈伤组织的继代：取1.0g微黄色、状态良好的胚性愈伤组织，放置在继代保存培养基(MS+1.5mg·L^-1PIC+1.5％蔗糖+1.5％麦芽糖+0.7％琼脂，pH5.8)上，25℃黑暗培养。60d为一个继代培养周期。结果表明：胚性愈伤组织形态一致，色泽为鲜黄色(图4为继代后胚性愈伤组织)，培养60d后，本发明继代保存方法中胚性愈伤组织的增殖系数可以达到3.298倍(图5为胚性愈伤组织的增殖系数对比图)，在胚性愈伤组织继代糖源配比中，该系数处于中等水平。

(6)成熟胚的诱导：取1.0g微黄色、状态良好的胚性愈伤组织，放置在成熟胚诱导培养基(MS+3％蔗糖+0.7％琼脂，pH5.8)上，25℃暗培养7d后，转至光下培养(14h/10h，光/暗)，光照强度为50μmoL·m^-2·s^-1。30d后统计成熟胚的数量(图6为成胚数量对比图)，实施例显著高于对比例。

对比例1

本对比例与实施例1的继代保存方法与步骤基本相同，不同之处仅在于：将实施例的步骤(5)中胚性愈伤组织继代保存的糖源比例进行更改，仅以蔗糖作为糖源，其余与实施例1相同。培养基为：MS+1.5mg·L^-1PIC+3.0％蔗糖+0.7％琼脂，pH5.8。采用本对比例的方法，在不含麦芽糖的培养基上，胚性愈伤组织增殖较快，但同步化较差，部分材料由微黄色转为白色，继代增殖系数为4.461。经实验观察及测算，该对比例的较佳继代周期为30d左右。

对比例2

本对比例与实施例1的继代保存方法与步骤基本相同，不同之处仅在于：将实施例的步骤(5)中胚性愈伤组织继代保存的糖源比例进行更改，增加麦芽糖的比例，其余与实施例1相同，蔗糖和麦芽糖比例为1：2。培养基为：MS+1.5mg·L^-1PIC+1.0％蔗糖+2.0％麦芽糖+0.7％琼脂，pH5.8。采用本对比例的方法，在含有麦芽糖比例较高的培养基上，胚性愈伤组织增殖较慢，同步化较好，材料为深黄色，继代增殖系数为2.589。经实验观察及测算，该对比例的较佳继代周期为75d左右。

对比例3

本对比例与实施例1的继代保存方法与步骤基本相同，不同之处仅在于：将实施例的步骤(5)中胚性愈伤组织继代保存的糖源比例进行更改，仅用麦芽糖作为糖源，其余与实施例1相同。培养基为：MS+1.5mg·L^-1PIC+3.0％麦芽糖+0.7％琼脂，pH5.8。采用本对比例的方法，在不含蔗糖的培养基上，胚性愈伤组织增殖极慢，材料为深黄色，部分融合为组织，继代增殖系数为1.852。经实验观察及测算，该对比例的较佳继代周期为90d左右。

对比例4

本对比例与实施例1的诱导方法与步骤基本相同，不同之处仅在于：将实施例的步骤(5)中胚性愈伤组织继代培养基中糖源总量降低，蔗糖和麦芽糖比例为1：1，培养基为：MS+1.5mg·L^-1PIC+1.0％蔗糖+1.0％麦芽糖+0.7％琼脂，pH5.8，其余与实施例1相同。采用本对比例的方法，胚性愈伤组织同步化程度较好，颜色为微黄，部分变白或褐化，部分细胞团出现衰败，继代增殖系数为2.980。经实验观察及测算，该对比例的较佳继代周期为45d左右。

本发明通过糖源种类及浓度的调试，找到了百子莲胚性愈伤组织继代保存的较佳继代糖源配方及培养周期，与仅用蔗糖作为糖源(对比例1)做比较，可将培养周期延长一倍，继代频次减少一半以上(图7为各处理较佳的继代周期和继代频次的比较)，较大程度节省了胚性愈伤组织保存、增殖过程中的耗材、人力资源的投入。在总投入固定的情况下，该实施例的胚性愈伤组织增殖系数及成胚数量远远高于各对比例。本发明中，通过加入的麦芽糖比例较高，增殖较慢，却可以保持较好的细胞状态。

本发明实施例1与对比例1相比，胚性愈伤组织状态更好，培养周期增加100％，投入的人力、物力成本降低50％，材料不容易退化，成胚效率提高45.47％。

本发明实施例1与对比例2相比，增殖系数提高27.39％，成胚效率提高22.95％。

本发明实施例1与对比例3相比，增殖系数提高78.08％，成胚效率提高277.60％。

本发明实施例1与对比例4相比，增殖系数提高10.67％，成胚效率提高57.05％。

本发明具体应用途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式。应当指出，以上实施例仅用于说明本发明，而并不用于限制本发明的保护范围。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种利用糖源配比优化百子莲胚性愈伤继代周期及频次的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、外植体取材与消毒：取百子莲未开裂的小花苞，进行消毒处理后，切取其小花梗外植体，并切成小段；

B、愈伤组织的诱导：将小段的小花梗外植体接种于愈伤组织诱导培养基中，暗培养一段时间，生成带有残留小花梗组织的愈伤组织；

C、愈伤组织的继代培养：将带有残留小花梗组织的愈伤组织放置在愈伤组织继代培养基上，暗培养，得不含残留小花梗组织的愈伤组织；

D、胚性愈伤组织的诱导：将不含残留小花梗组织的愈伤组织放置在胚性愈伤组织诱导培养基中暗培养，生成胚性愈伤组织；

E、胚性愈伤组织的继代：将胚性愈伤组织放置在继代保存培养基中暗培养；

F、成熟胚的诱导：将步骤E培养后得到的胚性愈伤组织放置在成熟胚诱导培养基中，暗培养一段时间后，转至光下培养，生成成熟胚。

2.根据权利要求1所述的利用糖源配比优化百子莲胚性愈伤继代周期及频次的方法，其特征在于，步骤A中，所述消毒处理的具体步骤为：先用75％(v/v)乙醇处理50～70s后，用ddH₂O冲洗3～5次，然后用5％次氯酸钠消毒处理5～7min，之后ddH₂O冲洗3～5次，再用75％乙醇处理50～70s后，用ddH₂O冲洗3～5次。

3.根据权利要求1所述的利用糖源配比优化百子莲胚性愈伤继代周期及频次的方法，其特征在于，步骤A中，所述小花梗外植体切成0.7～1.0cm的小段。

4.根据权利要求1所述的利用糖源配比优化百子莲胚性愈伤继代周期及频次的方法，其特征在于，步骤B中，所述愈伤组织诱导培养基组分为：MS+1.5～2.0mg·L^-1PIC+2.5～3.5％蔗糖+0.6～1.0％琼脂，pH 5.8。

5.根据权利要求1所述的利用糖源配比优化百子莲胚性愈伤继代周期及频次的方法，其特征在于，步骤C中，所述愈伤组织继代培养基组分为：MS+1.5～2.0mg·L^-1PIC+1.0～1.5％蔗糖+1.5～2.0％麦芽糖+0.6～1.0％琼脂，pH5.8。

6.根据权利要求1所述的利用糖源配比优化百子莲胚性愈伤继代周期及频次的方法，其特征在于，步骤D中，所述胚性愈伤组织诱导培养基组分为：MS+1.0～1.5mg·L^-1PIC+2.5～3.5％蔗糖+0.6～1.0％琼脂，pH5.8。

7.根据权利要求1所述的利用糖源配比优化百子莲胚性愈伤继代周期及频次的方法，其特征在于，步骤E中，所述继代保存培养基组分为：MS+1.0～1.5mg·L^-1PIC+1.5％蔗糖+1.5％麦芽糖+0.6～1.0％琼脂，pH5.8。

8.根据权利要求1所述的利用糖源配比优化百子莲胚性愈伤继代周期及频次的方法，其特征在于，步骤F中，所述成熟胚诱导培养基组分为：MS+3％蔗糖+0.6～1.0％琼脂，pH5.8。

9.根据权利要求1所述的利用糖源配比优化百子莲胚性愈伤继代周期及频次的方法，其特征在于，步骤B中，所述暗培养温度为25℃、培养55～65d；

步骤C中，所述暗培养温度为22～28℃，以55～65d为一个继代周期，继代培养2次；

步骤D中，所述暗培养温度为22～28℃，每30d继代一次，培养50～70d；

步骤E中，所述暗培养温度为22～28℃，以55～65d为一个继代培养周期；

步骤F中，所述暗培养温度为22～28℃，培养7d；所述光下培养采用光/暗时间比为14h/10h，光照强度为50μmoL·m^-2·s^-1，培养30d。

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