CN103004596A - 一种利用间歇浸没培养方式快速获得大蒜种苗的方法 - Google Patents
一种利用间歇浸没培养方式快速获得大蒜种苗的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103004596A CN103004596A CN2012105452487A CN201210545248A CN103004596A CN 103004596 A CN103004596 A CN 103004596A CN 2012105452487 A CN2012105452487 A CN 2012105452487A CN 201210545248 A CN201210545248 A CN 201210545248A CN 103004596 A CN103004596 A CN 103004596A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- garlic
- submergence
- culture
- bulb
- cultivation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 235000004611 garlic Nutrition 0.000 title claims abstract description 92
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 67
- 238000007654 immersion Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 244000245420 ail Species 0.000 title 1
- 240000002234 Allium sativum Species 0.000 claims abstract description 91
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 claims abstract description 20
- 238000012549 training Methods 0.000 claims description 44
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 claims description 41
- 238000005286 illumination Methods 0.000 claims description 41
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 29
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 26
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 26
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 26
- NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N N-benzyladenine Chemical compound N=1C=NC=2NC=NC=2C=1NCC1=CC=CC=C1 NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- RMOGWMIKYWRTKW-UONOGXRCSA-N (S,S)-paclobutrazol Chemical compound C([C@@H]([C@@H](O)C(C)(C)C)N1N=CN=C1)C1=CC=C(Cl)C=C1 RMOGWMIKYWRTKW-UONOGXRCSA-N 0.000 claims description 13
- 239000005985 Paclobutrazol Substances 0.000 claims description 13
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 13
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 10
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 11
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 7
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 abstract description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 abstract description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 abstract 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 18
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 13
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 13
- JTEDVYBZBROSJT-UHFFFAOYSA-N indole-3-butyric acid Chemical compound C1=CC=C2C(CCCC(=O)O)=CNC2=C1 JTEDVYBZBROSJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 208000037805 labour Diseases 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 8
- 244000223014 Syzygium aromaticum Species 0.000 description 6
- 235000016639 Syzygium aromaticum Nutrition 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 3
- 241000234282 Allium Species 0.000 description 2
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 2
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 2
- 244000144987 brood Species 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 238000004161 plant tissue culture Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000004017 vitrification Methods 0.000 description 2
- 239000005972 6-Benzyladenine Substances 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 229930191978 Gibberellin Natural products 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N Kinetin Natural products N=1C=NC=2N=CNC=2C=1N(C)C1=CC=CO1 FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000406668 Loxodonta cyclotis Species 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001651 autotrophic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000032459 dedifferentiation Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- IXORZMNAPKEEDV-UHFFFAOYSA-N gibberellic acid GA3 Natural products OC(=O)C1C2(C3)CC(=C)C3(O)CCC2C2(C=CC3O)C1C3(C)C(=O)O2 IXORZMNAPKEEDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003448 gibberellin Substances 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N kinetin Chemical compound N=1C=NC=2N=CNC=2C=1NCC1=CC=CO1 QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001669 kinetin Drugs 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 238000011017 operating method Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019362 perlite Nutrition 0.000 description 1
- 239000010451 perlite Substances 0.000 description 1
- 230000029553 photosynthesis Effects 0.000 description 1
- 238000010672 photosynthesis Methods 0.000 description 1
- 239000003375 plant hormone Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000003716 rejuvenation Effects 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 238000012090 tissue culture technique Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Cultivation Of Plants (AREA)
Abstract
本发明涉及一种利用间歇浸没培养方式快速获得大蒜种苗的方法，将大蒜丛生芽或灭菌后的花苞等作为接种材料，转接到间歇浸没培养反应器中进行增殖诱导和鳞茎生成培养两个阶段，增殖培养结束后，在无菌条件下将增殖培养液替换为鳞茎生成培养液以促进大蒜小鳞茎形成，并进行移栽，以获得大量均一的大蒜种苗。本方法大大提高了大蒜种苗生产过程中的自动化程度，减少培养时的人力投入，并且可以大大提高增殖率。利用反应器生产大蒜种苗具有无病原菌，遗传均一稳定等优点，且成活率显著提高，劳动力成本显著降低。本方法在提高大蒜种苗质量的同时降低种苗成本，为低成本的生产大量高质量的大蒜鳞茎提供保障。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用间歇浸没培养方式快速获得大蒜种苗的方法，属于植物细胞工程技术领域。具体涉及一种利用间歇浸没生物反应器进行大蒜组织培养和规模化快繁以快速获得大批量种苗（鳞茎）的方法。
背景技术
大蒜(Pinellia spp.)是人们日常生活中不可或缺的调味品，一直以来深受广大人民群众的喜爱。且大蒜具有调节免疫力，保肝护肝，抗氧化，抗诱变以及抗癌等作用。
传统的大蒜种植是以蒜瓣留种作为种植材料进行种植。此种方法具有两个方面明显的缺点。一是蒜瓣作为种植材料会消耗大量的大蒜产品，并且其繁殖率低，通常一个蒜瓣一个生长周期只能产生六到八个蒜瓣，致使种植成本居高不下；二是经过多代无性繁殖会使病毒等种传病害在繁殖体内积累，造成大蒜品质衰退，严重影响大蒜的产量和质量。
通过研究，以上问题可以利用组培快繁的方法来解决。通过组培快繁利用优良大蒜品种作为扩繁的材料，可获得遗传基础和外观品质形状等重要性状均一的繁殖体，并且可以改变传统的以蒜瓣作为种植材料的现状，大幅度的降低种植的成本。同时组织培养过程中可以利用茎尖培养对侵染大蒜的病毒进行脱除，实现复壮的目的，使生产得到的大蒜种苗产量更高，品质更好。但是传统的组织培养方法得到的大蒜组培苗细弱，组培苗应用于大田生产时需要严格的驯化条件和管理操作。在进行炼苗移栽时，对组培苗上附着琼脂的清洗时对其伤害较大，因此炼苗成活率较低，且在生长一段时间后才能形成小鳞茎，不利于大蒜组培苗的生长。
在国内关于大蒜的组织培养已经有很多方面的报道，如申请号为95116060.5的“利用植物组织培养技术大规模生产无病毒种蒜的方法”、申请号为03111732.5的“利用组织培养技术将大蒜再分化植物体的方法”及申请号为200910085914.8的“大蒜胚性愈伤组织诱导的培养基”等。ZL200810101415.2公开了一种快速繁殖大象大蒜(Allium Ampeloprasun Var. mpeloprasun)的方法，采用不定芽增殖法快繁大象大蒜品种，利用顶端分生组织得到无菌苗，再利用无菌苗的基部得到的大量增殖不定芽；避免了组培过程中脱分化、再分化引起的组培苗玻璃化现象，极大地提高了繁殖系数。该方法包括外植体的消毒、无菌苗诱导、不定芽诱导和继代增殖、不定芽生根、组培苗移栽的操作步骤。以MS基本培养基为基础，添加不同比例的植物激素(Α-萘乙酸NAA、吲哚丁酸IBA、6-苄基腺嘌呤6-BA、激动素KT、赤霉素GA)，通过不同的组合，在适宜的不定芽诱导和增殖培养基、生根培养基上快速繁殖出新植株。但是上述技术方案存在较大的缺点，主要体现在其过程中，需要反复转接繁殖体和更换固体培养基，导致操作复杂且耗费人工及物料等方面，并且培养时间长，从而致使生产得到的大蒜种苗成本居高不下而不易为广大种植户接受，因此难以真正推广应用。
发明内容
利用传统固体培养基组织培养方法进行种苗生产的自动化水平低、且成本居高不下，其中很大的一部分是劳动力和能耗成本，如传统的大蒜种苗及微型鳞茎生产需要经历的初代诱导培养、继代增殖培养、生根培养及微型鳞茎诱导和后续的组培苗清洗和炼苗移栽都需要大量的人工，包括培养基的配制、大量培养瓶的清洗灌装灭菌和耗费劳动力最大的切割转接过程。这些都大大增加了组培生产过程中劳动力的投入。
间歇浸没培养反应器主要是利用液体培养基对植物的组织器官进行间歇浸没培养，浸没时供给营养，间歇时提供足够的氧气。由于该培养方式较好的解决了液体培养时植物组织的玻璃化问题，并且营养物质随着对植物组织的浸没可以得到很好的传递，因此间歇浸没培养可以很好的解决植物组织培养中的各种难题。并且间歇浸没培养方式可以大大提高自动化水平和植物增殖效率，以及降低人力和物力的消耗。是替代传统培养的一种行之有效的方法。
利用间歇浸没培养反应器成功进行其它无性繁殖植物的组织培养的研究已有报道。如专利号为ZL 200910114406.1的“利用间歇浸没式生物反应器进行甘蔗组织培养快繁”的研究，其利用间歇浸没方式对三种甘蔗的培养进行了介绍，同时也为利用此种培养方式进行其它种类植物的培养提供了技术启示。但是间歇浸没培养方式用于植物的培养就如同植物组织培养方法对不同植物组织培养一样，一种培养方式应用于不同的植物时需要不同的条件及处理方式。培养时涉及到的培养方法如：材料的选取、培养基构成、浸没频率、接种密度、培养时间、外界环境以及不同材料的处理方式等各个方面并不能通过简单的有限的实验推理来得到。专利中提及的五个步骤以及其中涉及到的具体的培养方式和培养条件完全不能用于大蒜种苗的培育，不仅所用的外殖体材料形态完全不同，且其操作的增殖培养、生根培养和生根苗驯化移栽的步骤也与大蒜的培养具有不同的培养思路。利用间歇浸没式培养方法进行大蒜组织培养快繁却未见报道和公开应用。
本发明的目的在于提供一种规模化获得大蒜种苗的方法，具体是利用间歇浸没培养反应器进行大蒜组培快繁获得微型鳞茎，并进一步分级、炼苗和移栽后获得生产用大蒜种苗的方法。采用该方法相对于传统大蒜组织培养方法获得大蒜种苗具有以下特点：1）增殖率高；2）种苗健壮；3)移栽成活率高；4）培养周期短；5）可提前下种；6）自动化程度高和节省劳动力消耗等优点。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
基本步骤包括：增殖培养、微型鳞茎生成培养、微型鳞茎分级及炼苗移栽，所述的增殖培养和微型鳞茎生成的步骤在同一个间歇浸没培养反应器中进行。
具体地，所述的方法包括以下步骤：
（1）增殖培养：在无菌条件下将大蒜丛生芽或灭菌后的花苞接种到无菌的间歇浸没培养反应器中进行增殖培养；
（2）微型鳞茎生成培养：增殖培养结束后，在同一个间歇浸没培养反应器中，无菌条件下将增殖培养液替换为鳞茎生成培养液，进行继续培养后得到微型鳞茎；
（3）微型鳞茎分级及炼苗移栽：将得到的大蒜微型鳞茎分级，根据需要决定是否炼苗后移栽到栽培基质中。
本发明所述方法包括如下具体步骤：
（1）增殖培养：无菌条件下将大蒜丛生芽或无菌处理后的花苞外植体接种到预先灭菌的间歇浸没培养反应器中进行增殖培养。其中，所述的间歇浸没培养反应器应理解为现有技术中任何间歇浸没式培养反应器，因为它们均具备对大蒜外植体进行间歇式浸没培养的功能。
该步骤中间歇浸没培养参数为：
浸没频率：1~20 min/3h，优选5~10min/3h；接种密度：10~100个/L，优选30~80个/L；培养时间：15~30 d，优选20~25d；增殖培养液配方可以但不限于Ms+1.0~5.0 mg/L 6-BA+0.02 ~0.2mg/L NAA+2.0mg/L KT+30 g/L蔗糖； pH5.0~6.5，优选5.5~6.0。培养条件为：光照强度1500~2000 lux，光照8~18 h/d，优选10~15 h/d，温度25±1℃。
其中，进一步优选间歇浸没培养反应器的参数设置为：浸没频率：8 min/3h；接种密度：60个/L；培养时间：22d；增殖培养液配方为Ms+3.0 mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+2.0mg/L KT+30 g/L蔗糖，pH5.8；培养条件为：光照强度1800 lux，光照时间12 h/d，培养温度25℃。
（2）微型鳞茎生成培养：增殖培养结束后，在同一间歇浸没培养反应器内，将组培苗的增殖培养液替换为鳞茎生成培养液进行培养。所述鳞茎生成培养液为但不限于1/2Ms+1.0~2.0 mg/L IBA+0.01~0.1 mg/L NAA+5mg/L多效唑+45 g/L蔗糖，pH5.0~6.5，优选5.5~6.0。该步骤中间歇浸没培养参数为：浸没频率：1~20min/6h, 优选5~10 min/6h；培养时间：15~40d，优选20~30 d；培养条件为：光照强度1500-2000 lux，光照时间8~18h/d，优选光照时间10~15h/d；培养温度25±1℃。
其中，进一步优选鳞茎生成培养液组成为：1/2Ms+1.5mg/L IBA+0.05 mg/L NAA+5mg/L多效唑+45 g/L蔗糖，pH5.8；间歇浸没培养参数为：浸没频率8min/6h；培养时间25d；培养条件为：光照强度1800 lux，光照时间12 h/d，培养温度25℃。
（3）微型鳞茎分级及炼苗移栽：根据得到的微型鳞茎的大小将其分为三类：①直径>4.0 mm；②直径3.0～4.0 mm；③直径<3.0 mm。其中，①类和②类微型鳞茎可直接移栽种植，③类微型鳞茎需要进行炼苗待长出叶片后再进行移栽以提高成活率。
作为本发明的最佳实施方案，本发明优选采用以下技术方案：
（1）增殖培养：在无菌条件下将大蒜丛生芽或灭菌后的花苞接种到无菌的间歇浸没培养反应器中进行增殖培养；培养参数为：浸没频率：8 min/3h；接种密度：60个/L；培养时间：22d；增殖培养液配方为Ms+3.0 mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+2.0mg/L KT+30 g/L蔗糖，pH5.8；培养条件为：光照强度1800 lux，光照时间12 h/d，温度25℃。
（2）微型鳞茎生成培养：增殖培养结束后，在同一间歇浸没培养反应器中将增殖培养液替换为鳞茎生成培养液进行继续培养得到微型鳞茎；所设定参数为：鳞茎生成培养液组成为：1/2Ms+1.5mg/L IBA+0.05 mg/L NAA+5mg/L多效唑+45 g/L蔗糖，pH5.8；间歇浸没培养反应器的参数设置为：浸没频率8min/6h；培养时间25d；培养条件为：光照强度1800 lux，光照12 h/d，温度25℃。
（3）微型鳞茎分级及炼苗移栽：将得到的大蒜微型鳞茎分级，根据需要经炼苗后移栽到栽培基质中①类直径>4.0 mm和②类直径3.0～4.0 mm的微型鳞茎直接种植，③类直径<3.0 mm的微型鳞茎经炼苗长出叶片后再进行移栽。
采用上述技术方案，本发明具有如下极其显著的效果：
（1）增殖率高，生物产量大，培养时间短。间歇浸没培养反应器培养是利用液体培养对植物组织器官进行间歇浸没的培养，这种培养方式下大蒜的增殖率远远高于常规培养。本发明利用间歇浸没培养得到的大蒜的增殖率可达到1:30，远远高于固体培养1:5左右的效果。较高的增殖率也为短时间内得到一定数量的组培苗提供了基础，从而减少继代次数，降低组培苗变异频率。利用间歇浸没培养的方式经过50天左右的培养能够取得增殖30倍的效果，而传统固体培养方式经过100天的培养只能得到5倍的增殖效果。因此在生产同样数量大蒜种苗的情况下，利用间歇浸没培养方式会大大缩短培养时间。
（2）组培苗质量好。间歇浸没培养过程中当液体浸没时可以很好的给植物组织提供养分，且可以进行气体交换，使植物进行自养型的光合作用，且相当于对组培苗进行了炼苗，从而得到的组培苗更加健壮。由于经过了诱导微型鳞茎生成的步骤，得到的组培苗移栽后短时间内即可长成较大的大蒜，如本发明利用间歇浸没培养得到的大蒜的微型鳞茎中①类和②类微型鳞茎占85%，③类微型鳞茎占15%，得到的组培苗成活率在95%以上。而常规培养得到的几乎全部为③类微型鳞茎，需要全部进行炼苗，且苗移栽过程需要大量的人工和高标准的操作，尽管如此移栽成活率仅仅为60%左右。
（3）自动化水平高，节省大量劳动力消耗。利用间歇浸没反应器培养大蒜不仅可以大大减少培养瓶的个数，从而减少了灌装洗涤以及接种等各方面的劳动力消耗；同时在一个培养装置中形成2000个左右新的鳞茎，相对于固体培养瓶每瓶产出10个左右的种苗具有极大的效率差别。其二，在培养过程中可实现自动化的控制，不需要反复转接组培苗，因而较少耗费人工和缩短培养时间。从而大大节省了劳动力成本，高的增殖率、较好的种苗质量以及高的成活率也降低了种苗的生产成本。
综上所述，本发明利用间歇浸没培养反应器进行大蒜组培快繁相对于传统培养具有扩繁效率高、培养时间短及成本低的优点，更适合大蒜种苗规模化生产。
附图说明
图1间歇浸没培养反应器中增殖培养结束时大蒜种苗的生长状态。
图2为间歇浸没培养方法得到的大蒜微型鳞茎的分级图。
其中，A1为①类鳞茎状态；A2为①类鳞茎生长3天后状态；A3为①类鳞茎生长7天后状态；B1为②类鳞茎状态；B2为②类鳞茎生长3天后状态；B3为②类鳞茎生长7天后状态；C1为③类鳞茎状态；C2为③类鳞茎生长3天后状态；C3为③类鳞茎生长7天后状态。
图3为不同级别的大蒜微型鳞茎移栽后生长状态。
其中，A1为①类鳞茎移栽7天后状态；A2为①类鳞茎移栽14天后状态；A3为①类鳞茎移栽21天后状态；B1为②类鳞茎移栽7天后状态；B2为②类鳞茎移栽14天后状态；B3为②类鳞茎移栽21天后状态；C1为③类鳞茎移栽7天后状态；C2为③类鳞茎移栽14天后状态；C3为③类鳞茎移栽21天后状态。
具体实施方式
实施例1
利用间歇浸没式培养反应器对大蒜花苞外植体进行扩繁，具体步骤如下：
（1）增殖培养：具体方法是在无菌状态下，将灭菌后的大蒜花苞作为外植体接种到预先灭菌的间歇浸没培养反应器中。间歇浸没培养参数为：浸没频率：10 min/3h；接种密度50/L；培养时间：20 d。增殖培养液配方为Ms+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+2.0mg/L KT+30 g/L蔗糖，pH5.5。培养条件为：光照强度1500-2000 lux，光照10 h/d，温度25±1℃。间歇浸没培养反应器中增殖培养结束时大蒜种苗的生长状态如图1所示。
（2）微型鳞茎生成培养：具体方法是增殖培养结束后，在同一反应器中将增殖培养液替换为鳞茎生成培养液进行继续培养。所述鳞茎生成培养液为1/2Ms+1.0 mg/L IBA+0.01 mg/L NAA+5mg/L多效唑+45 g/L蔗糖，pH5.8。间歇浸没培养参数为：浸没频率：10min/6h；培养时间：30 d。培养条件为：光照强度1500-2000 lux，光照10 h/d，温度25±1℃。
（3）微型鳞茎分级及炼苗移栽：将得到的微型鳞茎分级后，根据不同级别直接移栽或者是炼苗后栽培，保持湿度、控制适当光照，以保证移栽成活率。在一个培养周期内增殖效率达1:25以上。①类和②类微型鳞茎占70%，③类微型鳞茎占30%，得到的组培苗成活率在90%以上。其中，间歇浸没培养方法得到的大蒜微型鳞茎的分级和不同级别的大蒜微型鳞茎移栽后生长状态参见图2和图3。
实施例2
利用间歇浸没式培养反应器对大蒜丛生芽作为外植体进行扩繁，具体步骤如下：
（1）增殖培养：具体方法是无菌状态下，将大蒜丛生芽接种到预先灭菌的间歇浸没培养反应器中。间歇浸没培养参数为：浸没频率：8 min/3h；接种密度：60/L；培养时间：22 d。增殖培养液配方为Ms+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+2.0mg/L KT+30 g/L蔗糖，pH5.8。培养条件为：光照强度1500-2000 lux，光照12 h/d，温度25±1℃。
（2）生根及微型鳞茎生成：具体方法是增殖培养结束后，在同一反应器内将增殖培养液替换为鳞茎生成培养液继续培养。所述鳞茎生成培养液为1/2Ms+1.0 mg/L IBA+0.01 mg/L NAA+5mg/L多效唑+45 g/L蔗糖，pH5.8。间歇浸没培养参数为：浸没频率：8min/6h；培养时间：25 d。培养条件为：光照强度1500-2000 lux，光照12 h/d，温度25±1℃。
（3）微型鳞茎分级及炼苗移栽：将得到的微型鳞茎分级后，根据不同级别直接移栽或者是炼苗后栽培，保持湿度、控制适当光照，以保证移栽成活率。在一个培养周期内增殖效率达1:28以上。①类和②类微型鳞茎占80%，③类微型鳞茎占20%，得到的组培苗成活率在95%以上。
实施例3
利用间歇浸没式培养反应器对大蒜花苞进行扩繁，具体步骤如实施例1所示，所不同的是所选用的增殖培养液配方为Ms+4.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+2.0mg/L KT+30 g/L蔗糖，pH5.8。鳞茎生成培养液为1/2Ms+2.0 mg/L IBA+0. 1 mg/L NAA+5mg/L多效唑+45 g/L蔗糖，pH5.8。在一个培养周期内增殖效率达1:28以上。①类和②类微型鳞茎占75%，③类微型鳞茎占25%，得到的组培苗成活率在90%以上。
实施例4
利用间歇浸没式培养反应器对大蒜丛生芽进行扩繁，具体步骤如实施例2所示，所不同的是所选用的增殖培养液配方为Ms+3.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+2.0mg/L KT+30 g/L蔗糖，pH5.8。鳞茎生成培养液为1/2Ms+1.5 mg/L IBA+0.05 mg/L NAA+5mg/L多效唑+45 g/L蔗糖，pH5.8。在一个培养周期内增殖效率达1：30以上。①类和②类微型鳞茎占85%，③类微型鳞茎占15%，得到的组培苗成活率在95%以上。
对照例1
利用常规固体培养方法对大蒜丛生芽进行扩繁的具体步骤如下：
（1）增殖培养：利用常规组培方法得到的无菌大蒜丛生芽作为外植体。于无菌状态下接种到装有50 mL固体培养基的大小为250 mL的培养瓶中，每个培养瓶中接种5个外植体，保证每个外植体培养用的培养基的量与间歇浸没反应器培养的量一致。增殖培养基配方为Ms+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+2.0mg/L KT+30 g/L蔗糖+6 g/L琼脂，pH5.8，pH5.8。培养条件为：光照强度1500-2000 lux，光照12 h/d，温度25±1℃。
（2）生根及微型鳞茎生成培养：增殖培养20 d结束后将组培苗取出后转接入具有相同量的鳞茎生成培养基的培养瓶中，培养基配方为1/2Ms+1.0 mg/L IBA+0.01 mg/L NAA+5mg/L多效唑+45 g/L蔗糖+6 g/L琼脂，pH5.8。再进行30 d的培养。培养条件为：光照强度1500-2000 lux，光照12 h/d，温度25±1℃。
（3）炼苗及微型鳞茎移栽：将培养50 d后得到的微型鳞茎取出后，由于鳞茎较小，需要全部进行炼苗，5 d后移栽到珍珠岩中，保持湿度、温度及光照。一个培养周期内增殖效率为1:5以上。移栽成活率为60%以上。
由此可知，采用本发明所述技术方案与现有常规固体培养方法对大蒜丛生芽进行扩繁相比，本发明的增效效率和移栽成活率得到了显著提高。
对照例2
利用间歇浸没式培养反应器对大蒜丛生芽作为外植体进行扩繁的具体步骤：
（1）增殖培养：具体方法是在无菌状态下，将大蒜丛生芽接种到预先灭好菌的间歇浸没培养反应器中。间歇浸没培养反应器的参数设置为：浸没频率：60 min/3 h；接种密度：150/L；培养时间：22 d。增殖培养液配方为Ms+4.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+2.0mg/L KT+30 g/L蔗糖，pH5.8。培养条件为：光照强度1500-2000 lux，光照12 h/d，温度25±1℃。
（2）生根及微型鳞茎生成：具体方法是增殖培养结束后，在同一反应器内将增殖培养液替换为鳞茎生成培养液继续培养。所述鳞茎生成培养液为1/2Ms+2.0 mg/L IBA+0.01 mg/L NAA+5mg/L多效唑+45 g/L蔗糖，pH5.8。设置间歇浸没培养参数为：浸没频率：120min/6h；培养时间：25 d。培养条件为：光照强度1500-2000 lux，光照12 h/d，温度25±1℃。
（3）微型鳞茎分级及炼苗移栽：在一个培养周期内增殖效率为1:8。多为③类微型鳞茎，且得到的组培苗外观畸形及玻璃化严重，成活率仅有27%左右。
从上述试验结果可以看出并不是利用间歇浸没培养方式进行大蒜的培养就能够得到好的培养效果。本对照试验中在不同的培养条件如较高的培养浸没频率、不同的接种密度及培养时间等处理方法下得到的增殖率仅仅比常规培养高一点，而且鳞茎的状态较差，成活率很低，因此本对照试验中描述的培养条件下不适合用做大蒜的种苗培养。
对照例3
利用间歇浸没式培养反应器对大蒜丛生芽作为外植体进行扩繁的具体步骤：
（1）增殖培养：具体方法是在无菌状态下，将大蒜丛生芽接种到预先灭菌的间歇浸没培养反应器中。间歇浸没培养的参数为：浸没频率：1 min/12h；接种密度：180/L；培养时间：22 d。增殖培养液配方为Ms+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+2.0mg/L KT+30 g/L蔗糖，pH5.8。培养条件为：光照强度1500-2000 lux，光照12 h/d，温度25±1℃。
（2）生根及微型鳞茎生成：具体方法是增殖培养结束后，在同一反应器内将增殖培养液替换为鳞茎生成培养液继续培养。所述鳞茎生成培养液为1/2Ms+1.0 mg/L IBA+0.01 mg/L NAA+5mg/L多效唑+45 g/L蔗糖，pH5.8。间歇浸没培养参数为：浸没频率：1min/24h；培养时间：25 d。培养条件为：光照强度1500-2000 lux，光照12 h/d，温度25±1℃。
（3）微型鳞茎分级及炼苗移栽：在一个培养周期内增殖效率为1:4。③类微型鳞茎为主，且组培苗干枯现象严重，得到的组培苗成活率仅有45%左右。
从上述试验结果可以看出：本对照试验中在不同的培养条件如较低的培养浸没频率、较高的接种密度及不同的培养液等处理方法下得到的增殖率要低于常规培养方式，而且鳞茎较小，种苗干枯现象严重导致成活率低，因此本对照试验中描述的利用间歇浸没式生物反应器进行培养的培养条件下不完全适合用做大蒜的种苗培养。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种利用间歇浸没培养方式快速获得大蒜种苗的方法，包括增殖培养、微型鳞茎生成培养、微型鳞茎分级及炼苗移栽的步骤，其特征在于，所述的增殖培养和微型鳞茎生成的步骤均在同一个间歇浸没培养反应器中进行。
2.根据权利要求1所述的一种利用间歇浸没培养方式快速获得大蒜种苗的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
（1）增殖培养：在无菌条件下将大蒜丛生芽或灭菌后的花苞接种到无菌的间歇浸没培养反应器中进行增殖培养；
（2）微型鳞茎生成培养：增殖培养结束后，于同一间歇浸没培养反应器中，将增殖培养液替换为鳞茎生成培养液进行继续培养得到微型鳞茎；
（3）微型鳞茎分级及炼苗移栽：将得到的大蒜微型鳞茎分级，根据需要经炼苗后移栽到栽培基质中。
3. 根据权利要求2所述的一种利用间歇浸没培养方式快速获得大蒜种苗的方法，其特征在于，所述的步骤（1）间歇浸没培养反应器的参数设置为：浸没频率：1~20 min/3h；接种密度：10~100个/L；培养时间：15~30 d；增殖培养液配方为Ms+1.0~5.0 mg/L 6-BA+0.02~0.2mg/L NAA+2.0mg/L KT+30 g/L蔗糖，pH5.0~6.5；培养条件为：光照强度1500-2000 lux，光照时间8~18 h/d，温度25±1℃。
4.根据权利要求3所述的一种利用间歇浸没培养方式快速获得大蒜种苗的方法，其特征在于，所述的步骤（1）间歇浸没培养反应器的参数为：浸没频率：5 ~10 min/3h；接种密度：30~80个/L；培养时间：20~25d；增殖培养液配方为Ms+1.0~5.0 mg/L 6-BA+0.02~0.2mg/L NAA+2.0mg/L KT+30 g/L蔗糖，pH5.5~6.0；培养条件为：光照强度1500 ~2000 lux，光照时间10~15 h/d，温度25±1℃。
5.根据权利要求4所述的一种利用间歇浸没培养方式快速获得大蒜种苗的方法，其特征在于，所述的步骤（1）间歇浸没培养反应器的参数设置为：浸没频率：8 min/3h；接种密度：60个/L；培养时间：22d；增殖培养液配方为Ms+3.0 mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+2.0mg/L KT+30 g/L蔗糖，pH5.8；培养条件为：光照强度1800 lux，光照时间12 h/d，温度25℃。
6.根据权利要求2所述的一种利用间歇浸没培养方式快速获得大蒜种苗的方法，其特征在于，所述的步骤（2）中鳞茎生成培养液组成为：1/2Ms+1.0~2.0 mg/L IBA+0.01~0.1 mg/L NAA+5mg/L多效唑+45 g/L蔗糖，pH5.0~6.5；间歇浸没培养反应器的参数设置为：浸没频率1~20min/6h；培养时间15~40d；培养条件为：光照强度1500 ~2000 lux，光照8~18h/d，温度25±1℃。
7.根据权利要求6所述的一种利用间歇浸没培养方式快速获得大蒜种苗的方法，其特征在于，所述的步骤（2）中鳞茎生成培养液组成为：1/2Ms+1.0~2.0 mg/L IBA+0.01~0.1 mg/L NAA+5mg/L多效唑+45 g/L蔗糖，pH5.8；间歇浸没培养反应器的参数设置为：浸没频率5~10min/6h；培养时间20~30d；培养条件为：光照强度1500 ~2000 lux，光照10~15h/d，温度25±1℃。
8.根据权利要求7所述的一种利用间歇浸没培养方式快速获得大蒜种苗的方法，其特征在于，所述的步骤（2）中鳞茎生成培养液组成为：1/2Ms+1.5mg/L IBA+0.05 mg/L NAA+5mg/L多效唑+45 g/L蔗糖，pH5.8；间歇浸没培养反应器的参数设置为：浸没频率8min/6h；培养时间25d；培养条件为：光照强度1800 lux，光照12 h/d，温度25℃。
9.根据权利要求2所述的一种利用间歇浸没培养方式快速获得大蒜种苗的方法，其特征在于，所述的步骤（3）中微型鳞茎分级及炼苗移栽中将微型鳞茎分为三级：①直径>4.0 mm；②直径3.0～4.0 mm；③直径<3.0 mm；①类和②类微型鳞茎可直接移栽种植，③类微型鳞茎需要进行炼苗待长出叶片后再进行移栽以提高成活率。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210545248.7A CN103004596B (zh) | 2012-12-17 | 2012-12-17 | 一种利用间歇浸没培养方式快速获得大蒜种苗的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210545248.7A CN103004596B (zh) | 2012-12-17 | 2012-12-17 | 一种利用间歇浸没培养方式快速获得大蒜种苗的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103004596A true CN103004596A (zh) | 2013-04-03 |
| CN103004596B CN103004596B (zh) | 2014-07-16 |
Family
ID=47954127
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201210545248.7A Expired - Fee Related CN103004596B (zh) | 2012-12-17 | 2012-12-17 | 一种利用间歇浸没培养方式快速获得大蒜种苗的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103004596B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107410028A (zh) * | 2017-08-22 | 2017-12-01 | 南京工业大学大丰海洋产业研究院 | 一种黄芪种苗的培养方法 |
| CN108605844A (zh) * | 2018-06-21 | 2018-10-02 | 上海惠和种业有限公司 | 一种嘉定白蒜茎尖脱毒苗形成脱毒小鳞茎的方法 |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1238122A (zh) * | 1999-06-15 | 1999-12-15 | 南京农业大学 | 一种大蒜脱毒种苗快速繁殖的方法 |
| CN1656885A (zh) * | 2005-03-01 | 2005-08-24 | 山东省农业科学院蔬菜研究所 | 一种大蒜有性生殖胚培养技术 |
| CN101720668A (zh) * | 2009-09-18 | 2010-06-09 | 广西壮族自治区农业科学院 | 利用间歇浸没式生物反应器进行甘蔗组织培养快繁 |
| KR100965812B1 (ko) * | 2008-01-24 | 2010-06-24 | 대한민국 | 마늘 생육기간 중 인편분화기에 생장점 적출, 배양을 통한종구생산 방법 |
| CN101816288A (zh) * | 2010-05-06 | 2010-09-01 | 江苏徐淮地区徐州农业科学研究所 | 大蒜胚性悬浮培养系建立用的培养基 |
| CN101822221A (zh) * | 2010-05-06 | 2010-09-08 | 江苏徐淮地区徐州农业科学研究所 | 大蒜胚性悬浮培养系体胚诱导出芽用的培养基 |
| CN101233827B (zh) * | 2008-03-06 | 2011-04-06 | 北京市农林科学院 | 一种快速繁殖大象大蒜的方法 |
| CN102440184A (zh) * | 2010-10-14 | 2012-05-09 | 王文和 | 利用生物反应器快速膨大培养百合脱毒籽球的方法 |
-
2012
- 2012-12-17 CN CN201210545248.7A patent/CN103004596B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1238122A (zh) * | 1999-06-15 | 1999-12-15 | 南京农业大学 | 一种大蒜脱毒种苗快速繁殖的方法 |
| CN1656885A (zh) * | 2005-03-01 | 2005-08-24 | 山东省农业科学院蔬菜研究所 | 一种大蒜有性生殖胚培养技术 |
| KR100965812B1 (ko) * | 2008-01-24 | 2010-06-24 | 대한민국 | 마늘 생육기간 중 인편분화기에 생장점 적출, 배양을 통한종구생산 방법 |
| CN101233827B (zh) * | 2008-03-06 | 2011-04-06 | 北京市农林科学院 | 一种快速繁殖大象大蒜的方法 |
| CN101720668A (zh) * | 2009-09-18 | 2010-06-09 | 广西壮族自治区农业科学院 | 利用间歇浸没式生物反应器进行甘蔗组织培养快繁 |
| CN101816288A (zh) * | 2010-05-06 | 2010-09-01 | 江苏徐淮地区徐州农业科学研究所 | 大蒜胚性悬浮培养系建立用的培养基 |
| CN101822221A (zh) * | 2010-05-06 | 2010-09-08 | 江苏徐淮地区徐州农业科学研究所 | 大蒜胚性悬浮培养系体胚诱导出芽用的培养基 |
| CN102440184A (zh) * | 2010-10-14 | 2012-05-09 | 王文和 | 利用生物反应器快速膨大培养百合脱毒籽球的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 《Journal of horticultural science & biotechnology》 20041231 KIM E. K. et al., "Enhanced shoot and bulblet proliferation of garlic (Allium sativum L.) in bioreactor systems" 第818-822页 第79卷, 第5期 * |
| KIM E. K. ET AL.,: ""Enhanced shoot and bulblet proliferation of garlic (Allium sativum L.) in bioreactor systems"", 《JOURNAL OF HORTICULTURAL SCIENCE & BIOTECHNOLOGY》, vol. 79, no. 5, 31 December 2004 (2004-12-31), pages 818 - 822 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107410028A (zh) * | 2017-08-22 | 2017-12-01 | 南京工业大学大丰海洋产业研究院 | 一种黄芪种苗的培养方法 |
| CN108605844A (zh) * | 2018-06-21 | 2018-10-02 | 上海惠和种业有限公司 | 一种嘉定白蒜茎尖脱毒苗形成脱毒小鳞茎的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103004596B (zh) | 2014-07-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102150624B (zh) | 半夏属植物的组培快繁方法 | |
| CN101647393B (zh) | 毛花猕猴桃组培快速繁殖方法 | |
| CN102119655B (zh) | 铁皮石斛自然光快繁育苗方法 | |
| CN101491215B (zh) | 香椿组培快繁方法 | |
| CN101720670B (zh) | 旱半夏组织培养快速繁殖方法 | |
| CN111616052A (zh) | 一种苹果砧木楸子的快速繁殖及无糖生根培养方法、应用 | |
| CN102217540A (zh) | 一种中国石蒜的快速繁殖方法 | |
| CN101574055A (zh) | 蓝靛果忍冬组织培养方法 | |
| CN101361456A (zh) | 利用离体叶片高效繁殖生产非洲菊的方法 | |
| CN105684901A (zh) | 一种荒漠区药用植物黑果枸杞的快速繁殖方法 | |
| CN104137779A (zh) | 一种白木乌桕茎段快速诱导再生植株的方法 | |
| CN103988776A (zh) | 一种南通小方柿组培快繁方法 | |
| CN101695280B (zh) | 红树莓的组织培养与快速繁殖方法 | |
| CN106106178B (zh) | 一种糖果鸢尾的组织培养方法 | |
| CN103070078A (zh) | 一种利用芋头茎尖进行组织培养的快繁方法 | |
| CN103583357B (zh) | 一种生石花无菌播种及再生体系建立的方法 | |
| CN103733995A (zh) | 一种芍药愈伤组织诱导方法 | |
| CN103947548A (zh) | 一种百子莲高频再生体系建立的方法 | |
| CN102860257B (zh) | 一种鱼腥草地上茎组织培养快速繁殖的方法 | |
| CN103340153A (zh) | 一种以马尾松离体成熟胚为外植体的组织培养方法 | |
| CN103039360B (zh) | 韭菜组织培养快繁的方法 | |
| CN102067818B (zh) | 试管藕诱导方法 | |
| CN104604678A (zh) | 一种野生竹节参无糖开放式组织培养快速育苗方法 | |
| CN104719168A (zh) | 利用间歇浸没生物反应器培育白芨种苗的方法 | |
| CN103004596B (zh) | 一种利用间歇浸没培养方式快速获得大蒜种苗的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20140716 Termination date: 20171217 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |