CN102440184A - 利用生物反应器快速膨大培养百合脱毒籽球的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了利用鼓泡式生物反应器快速膨大切花百合脱毒小鳞茎(籽球)的培养方法，属于植物组培快繁技术领域和植物细胞工程领域。本发明优化了反应器用组培百合脱毒籽球鳞茎膨大液体培养基(MS+NAA 0.2mg/L+CPPU 4mg/L+5％蔗糖(pH 5.8)，按2500-3000籽球块/升的数量借种籽球块，调节过滤空气进气量使反应器内湍动区流速3-5cm/s，保持反应器内压力恒定在0.03-0.05Mpa，在22±1℃；光照强度1500-2000Lx，光照12h/d培养40-45天，培养籽球直径、根系和籽球重可达定植要求。本发明可缩短了培养周期，节省能源、人工和培养空间，提高了培养基的利用效率，降低生产成本，具有实用性强、易于在生产中推广应用。

Description

利用生物反应器快速膨大培养百合脱毒籽球的方法

技术领域

本发明公开了利用鼓泡式生物反应器快速膨大切花百合脱毒小鳞茎(籽球)的培养方法，属于植物组培快繁技术领域和植物细胞工程的技术领域。

背景技术

百合是重要的观赏花卉，主要用于切花品种生产。百合在开放环境条件下，不可避免地要被病毒侵染，病毒侵染所造成的百合农艺性状退化严重，极大地影响了百合的生产。种植百合脱毒种球是百合花卉生产的最重要的环节，近年来我国百合的消费量逐年增大，现在我国百合生产将近90％以上的脱毒种球依赖进口。百合脱毒技术是利用人工组培方法脱除百合外植体所感染的病毒，并进行无病毒培养物的营养繁殖实现无病毒籽球的快速繁育的技术。我国百合脱毒技术在生产上绝大多数采用传统组培方式生产脱毒籽球，在生产过程中采用固体培养基完成组培过程的培养，其中脱毒籽球膨大培养是限制生产规模和速度的环节之一。采用传统组培方法这一过程需要将培养物置于固体培养基表面进行表面培养，培养基利用效率低；在调整培养基成分时需要大量的人力进行转接；培养时间要长达2-3个月的时间；生产过程需要很大的培养空间，为保证培养空间的温、湿、光等条件要满足培养需要还需消耗很多能源。

鼓泡式生物反应器是以气体为分散相，液体为连续相、涉及气液界面的反应器，具有结构简单，易于操作，操作成本低，混合和传质传热性能好的特点。利用鼓泡式生物反应器采用液体培养的方式对百合脱毒籽球进行膨大培养可缩短培养时间，提高培养基利用率，节省培养空间，降低生产成本，可弥补和解决传统百合脱毒籽球膨大组培方式的不足。

发明内容

本发明的目的是克服传统组培膨大培养脱毒百合籽球过程中培养方法的缺陷，既培养周期长，培养基利用效率低，不能调整培养基成分，转接需要大量人力；培养空间较大，能耗较高等缺陷。以花卉市场大众喜爱的“西伯利亚”(Siberia)、“索帮”(Sorbonne)、“马可波罗”(Marco polo)、“曼妮莎”(Manissa)、“康伽德奥”(Concad′O)5个品种的组培脱毒籽球为材料，优化了脱毒百合籽球液体膨大培养培养基成分和反应器培养条件，通过生物反应器液体培养快速膨大培养脱毒籽球，缩短了百合脱毒优质种球的快繁时间，在生产数量上较常规方法快4-5倍，且籽球的定植成活率高。本发明可缩短了培养周期，节省能源、人工和培养空间，提高了培养基的利用效率，降低生产成本，具有籽球成活率高、适于定植，易于在切花百合原种的规模化快繁生产中推广应用。本发明提供了一种适用于鼓泡式生物反应器的快速膨大培养脱毒百合籽球的优化方法，包括液体培养基配方和反应器运行和调节的方法。

本发明通过以下技术方案实现：

利用生物反应器快速膨大培养百合脱毒籽球的方法，按如下步骤进行：

(1)培养基的配制：鳞茎膨大培养基(MS+NAA 0.2mg/L+CPPU 4mg/L+5％蔗糖(pH 5.8)，配制液体培养基体积为反应器罐体体积的1/2-3/5。

(2)反应器灭菌和预运行：加入培养基后，对反应器罐体和管道系统进行蒸汽灭菌，灭菌后将反应器调节到25±1℃、调节过滤空气进气量，同时调节反应器空气出口阀使反应器主体内液体培养基处于拟均匀流动的循环流状态，湍动区流速2-3cm/s，保持罐内压力恒定大于0.02Mpa，运行2天，验证灭菌效果并确保反应器运行稳定。

(3)培养籽球的准备：在无菌环境中，将常规组培脱毒籽球芽切去叶片和部分基部组织，纵切成2-3块直径3.0-5.0mm籽球块，按2500-3000籽球块/升的数量准备培养材料。

(4)培养籽球的接种：使用70％酒精对反应器借种口进行灭菌，点燃反应器借种口的火圈对反应器接种口灭菌用，然后在接种火圈点燃状态下，迅速打开接种口盖将籽球转移进反应器内，然后将接种口盖拧紧。

(5)反应器运行条件：将反应器调节到22±1℃；光照强度1500-2000Lx，光照12h/d；调节过滤空气进气量，同时调节反应器空气出口阀使反应器内液体培养基处于拟均匀流动的循环流状态，湍动区流速3-5cm/s，保持反应器内压力恒定在0.03-0.05Mpa。

(6)反应器运行过程中补料：每2-3天观察反应器内培养液水分损耗，用蠕动泵通过补液孔向反应器添加灭菌蒸馏水，保证培养液体积。观察培养籽球生长状态，培养40-45d，培养籽球直径可达1.0-1.4cm，根系在3-5条/粒，籽球重0.7-1.2g/粒。

(7)冷藏：取出步骤(6)培养的组培鳞茎用清水洗去培养液，包裹于消毒草炭中，经4-6℃冷藏处理45天打破休眠(4℃冷藏处理时间可在2-4个月之间)

(8)移栽驯化：将步骤(7)鳞茎，选择具夏季冷凉气候的800-1000米海拔地区，在避雨和防虫隔离条件下，4月下旬至5月中旬移栽在消毒过的基质上定植。

Claims (5)

1.利用生物反应器快速膨大培养百合脱毒籽球的方法，按特征在于按如下步骤进行：

(1)培养基的配制：鳞茎膨大培养基MS+NAA 0.2mg/L+CPPU 4mg/L+5％蔗糖(pH 5.8)，配制液体培养基体积为反应器罐体体积的1/2-3/5。

(2)反应器灭菌和预运行：加入培养基后，对反应器罐体和管道系统进行蒸汽灭菌，灭菌后将反应器调节到25±1℃、调节过滤空气进气量，同时调节反应器空气出口阀使反应器主体内液体培养基处于拟均匀流动的循环流状态，湍动区流速2-3cm/s，保持罐内压力恒定大于0.02Mpa，运行2天，验证灭菌效果并确保反应器运行稳定。

(3)培养籽球的准备：在无菌环境中，将常规组培脱毒籽球芽切去叶片和部分基部组织，纵切成2-3块直径3.0-5.0mm籽球块，按2500-3000籽球块/升的数量准备培养材料。

(4)培养籽球的接种：使用70％酒精对反应器借种口进行灭菌，点燃反应器借种口的火圈对反应器接种口灭菌用，然后在接种火圈点燃状态下，迅速打开接种口盖将籽球转移进反应器内，然后将接种口盖拧紧。

(5)反应器运行条件：将反应器调节到22±1℃；光照强度1500-2000Lx，光照12h/d；调节过滤空气进气量，同时调节反应器空气出口阀使反应器内液体培养基处于拟均匀流动的循环流状态，湍动区流速3-5cm/s，保持反应器内压力恒定在0.03-0.05Mpa。

(6)反应器运行过程中补料：每2-3天观察反应器内培养液水分损耗，用蠕动泵通过补液孔向反应器添加灭菌蒸馏水，保证培养液体积。观察培养籽球生长状态，培养40-45d，培养籽球直径可达1.0-1.4cm，根系在3-5条/粒，籽球重0.7-1.2g/粒。

(7)冷藏：取出步骤(6)培养的组培鳞茎用清水洗去培养液，包裹于消毒草炭中，经4-6℃冷藏处理45天打破休眠(4℃冷藏处理时间可在2-4个月之间)

(8)移栽驯化：将步骤(7)鳞茎，选择具夏季冷凉气候的800-1000米海拔地区，在避雨和防虫隔离条件下，4月下旬至5月中旬移栽在消毒过的基质上定植。

2.根据权利要求书1所述的利用生物反应器快速膨大培养百合脱毒籽球的方法，其特征在于生物反应器中用于百合组培脱毒籽球培养的液体培养基成分为：MS+NAA 0.2mg/L+CPPU 4mg/L+5％蔗糖(pH5.8)；

3.根据权利要求书1所述的利用生物反应器快速膨大培养百合脱毒籽球的方法，其特征在于借种于液体培养基中的籽球块量为2500-3000籽球块/升；

4.根据权利要求书1所述的利用生物反应器快速膨大培养百合脱毒籽球的方法，其特征在于培养籽球块在反应器中培养的条件为：22±1℃；光照强度1500-2000Lx，光照12h/d；液体培养基湍动区流速3-5cm/s为拟均匀循环流状，反应器内压力恒定在0.03-0.05Mpa，培养40-45天。

5.根据权利要求书1所述的利用生物反应器快速膨大培养百合脱毒籽球的方法，其特征在于反应器中培养籽球鳞茎直径达1.0-1.4cm，根系在7-10条/粒，籽球重0.7-1.2g/粒时为冷藏、定植标准。