CN103518625B

CN103518625B - 琴叶榕叶片的组织培养基及离体再生方法

Info

Publication number: CN103518625B
Application number: CN201310534804.5A
Authority: CN
Inventors: 娄娟; 陈泽雄
Original assignee: Chongqing University of Arts and Sciences
Current assignee: Hangzhou province science and Technology Co Ltd
Priority date: 2013-11-01
Filing date: 2013-11-01
Publication date: 2015-11-25
Anticipated expiration: 2033-11-01
Also published as: CN103518625A

Abstract

本发明公开了一种琴叶榕叶片的组织培养基及离体再生方法；本发明建立的琴叶榕叶片离体再生体系为：愈伤组织诱导培养基为MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L，愈伤组织增殖培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L，不定芽分化培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L，生根培养基为1/2MS+IBA0.1mg/L+AC300+卡拉胶6.0g/L+蔗糖30g/L；接种部位为带叶柄的叶片，方式为叶片背面朝下接触培养基。本发明对琴叶榕叶片离体培养和不定芽再生进行了优化设计，提高了愈伤组织的诱导率和不定芽的分化率。

Description

琴叶榕叶片的组织培养基及离体再生方法

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，涉及一种琴叶榕叶片的组织培养基及离体再生方法。

背景技术

琴叶榕(Ficuslyrata)为桑科榕属常绿乔木，叶片厚革质，深绿色，表面具光泽，全缘，叶脉凹陷，长15-38cm，宽10-17cm，因形似小提琴而得名，原产热带非洲，可做庭园树、行道树、盆栽树；喜温暖、湿润和阳光充足环境，生长适温为25℃至35℃，15℃左右休眠，5℃以上可安全越冬；对水分的要求是宁湿勿干；对光照的适应性较强，在明亮的散射光能生长良好，夏季以避免阳光直射；对土壤的要求也不严，比较喜欢酸性，不耐瘠薄和碱性土壤。琴叶榕又称牛奶子，其根和叶有药用价值，主治祛风除湿，清热解毒，具有治疗疟疾、黄疸、痛经、乳痈、腰背酸痛、跌打损伤及消除炎症等功效。

琴叶榕耐寒性差，温度低于5℃时叶片会枯黄甚至脱落，影响其园林效果的发挥，阻碍了它向北方地区的推广和应用。要对琴叶榕进行遗传改良，增强其抗寒性，需向琴叶榕中导入抗寒基因。而建立稳定的、高效的叶片离体再生体系是进行遗传转化的重要基础的前提。琴叶榕外植体的再生技术已有一定的报道，但在其外植体再生技术的激素种类、浓度配比、叶片的具体部位、放置方式等方面值得进一步探讨。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种琴叶榕叶片的组织培养基及离体再生方法，从培养基不同的激素种类、配比、接种部位和方式以及培养条件等方面对琴叶榕叶片离体培养和不定芽再生进行优化设计，建立琴叶榕叶片离体再生体系。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明公开了一种琴叶榕叶片的组织培养基，包括愈伤组织诱导培养基、愈伤组织增殖培养基、不定芽分化培养基和生根培养基；所述愈伤组织诱导培养基是以MS培养基为基本培养基，并添加有蔗糖30g/L、琼脂3.2g/L、6-苄氨基嘌呤2.0mg/L和萘乙酸0.1mg/L；所述愈伤组织增殖培养基是以MS培养基为基本培养基，并添加有6-苄氨基嘌呤1.0mg/L和萘乙酸0.1mg/L；所述不定芽分化培养基是以MS培养基为基本培养基，并添加有6-苄氨基嘌呤1.0mg/L和萘乙酸0.1mg/L；所述生根培养基是以1/2MS培养基为基本培养基，并添加有吲哚-3-丁酸0.1mg/L、活性炭300mg/L、卡拉胶6.0g/L和蔗糖30g/L。

本发明还公开了一种使用上述琴叶榕叶片的组织培养基进行琴叶榕叶片离体再生的方法，包括以下步骤：

1）愈伤组织诱导：以琴叶榕叶片作为外植体，将叶片清洗消毒后，接种于所述愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，获得愈伤组织；

2）愈伤组织增殖：将愈伤组织转入所述愈伤组织增殖培养基中进行增殖培养；

3）不定芽分化：将愈伤组织接种于所述不定芽分化培养基中进行不定芽分化培养；

4）生根培养：将不定芽的小苗接种到所述生根培养基中进行生根培养；

5）试管苗移栽：将所得试管苗移栽入体积比为8:2的草炭土-珍珠岩混合基质中培养，即得琴叶榕组培种苗。

进一步，所述步骤1）中，琴叶榕叶片为带叶柄的叶片，叶片背面朝下接触培养基。

进一步，所述步骤1）～步骤4）中，培养条件为：接种后在25±2℃下，暗培养2周后在光照强度为1500～2000lx条件下培养。

本发明中所述的MS培养基和1/2MS培养基为植物组织培养中常用的基本培养基，其具体配方如下表所示：

本发明的有益效果在于：本发明从培养基不同的激素种类、配比、接种部位和方式以及培养条件等方面对琴叶榕叶片离体培养和不定芽再生进行了优化设计，建立了琴叶榕叶片离体再生体系，提高了愈伤组织的诱导率和不定芽的分化率，为基因工程改良琴叶榕使其具有抗寒性奠定了基础。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为琴叶榕外植体叶片；

图2为琴叶榕愈伤组织诱导；

图3为琴叶榕愈伤组织增殖；

图4为琴叶榕不定芽分化；

图5为琴叶榕生根；

图6为琴叶榕移栽。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

本发明实施例所用的试验材料取自重庆文理学院花卉研究中心温室大棚。以下试验中的培养条件均为：接种后在25±2℃下，暗培养2周后在光照强度为1500～2000lx条件下培养。

1）愈伤组织诱导：取温室大棚里生长的健壮、无病虫害琴叶榕植株的嫩叶，用流水冲洗10-15min后用洗衣粉浸泡3-4min，再用清水冲洗，取出放在超净工作台上先用75%乙醇表面消毒30s，0.1%升汞的消毒3-5min，最后用无菌水冲洗4-5次；将叶片切成15mm×15mm的方块，在每一小块的叶片上划几个伤口，如图1所示，接种到愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养。

试验所用愈伤组织诱导培养基是以MS培养基为基本培养基，添加蔗糖30g/L、琼脂3.2g/L，再添加不同生长激素（6-BA、NAA）及浓度，pH调至5.85.8-6.0；每瓶接种4块叶片，每处理4瓶，重复3次；观察愈伤的生长情况。

试验结果见表1，表明激素种类与激素浓度组合对琴叶榕的愈伤组织的诱导影响很大。培养基中只添加6-BA时，诱导率为0；当培养基中同时添加有6-BA和NAA时，均有诱导出愈伤组织，说明NAA对愈伤组织的诱导是必要的。处理8即6-BA2.0mg·L-1+NAA0.1mg·L-1时愈伤诱导率最高达80%，愈伤组织呈黄绿色，质地致密，团块最大直径达10mm，如图2所示；其他添加有NAA的组合虽都有黄绿色，质地致密的愈伤组织形成，但有少量褐化，且诱导率和愈伤团块大小都没有处理8好。在培养基为MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L时，其愈伤组织的诱导率最高，愈伤组织的色泽、质地都是最好的。因此，适合琴叶榕叶片的愈伤组织诱导培养基为MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L组合，即以MS培养基为基本培养基，并添加有蔗糖30g/L、琼脂3.2g/L、6-苄氨基嘌呤（6-BA）2.0mg/L和萘乙酸（NAA）0.1mg/L。

表1愈伤组织诱导培养基的选择

2）愈伤组织增殖：将愈伤组织转入愈伤组织增殖培养基中进行增殖培养。试验所用愈伤组织增殖培养基有两种：①MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L；②MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.1mg/L。每隔15d转接一代，在第二代末期，在接种的2种培养基上皆有绿色愈伤组织出现，①的增殖系数较大，愈伤呈黄绿色、团块大、直径大，如图3所示；而②的愈伤颜色比较暗，且还出褐化，有枯死的迹象，团块相对较小。所以适合琴叶榕叶片的愈伤组织增殖培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L组合，即以MS培养基为基本培养基，并添加有6-苄氨基嘌呤（6-BA）1.0mg/L和萘乙酸（NAA）0.1mg/L。

3）不定芽分化：将愈伤组织接种于不定芽分化培养基中进行不定芽分化培养。试验所用不定芽分化培养基有两种：①MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.1mg/L；②MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L。每隔15d转接一代，在第三代出现不定芽；从表2看出，处理2能分化产生不定芽，不定芽的诱导率高达50%，如图4所示；在处理1上原先质地致密的黄绿色愈伤组织大多褐化而且不能分化出不定芽。因此，适合琴叶榕叶片的不定芽分化培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L组合，即以MS培养基为基本培养基，并添加有6-苄氨基嘌呤（6-BA）1.0mg/L和萘乙酸（NAA）0.1mg/L。

表2不定芽分化培养基的选择

4）生根培养：将不定芽的小苗接种到生根培养基中进行生根培养。试验所用生根培养基有两种：①1/2MS+IBA0.1mg/L+AC300mg/L+卡拉胶6.0g/L+蔗糖30g/L；②1/2MS+IBA0.5mg/L+蔗糖15g/L+琼脂5.5g/L。培养7-10d陆续有根长出，继续培养20d，表3表明在1/2MS+IBA0.1mg/L+AC300mg/L+卡拉胶6.0g/L+蔗糖30g/L的培养基上，其生根效果最好，生根率达95%，平均根数7条，平均根长20mm，表现为根粗壮，试管苗长势好，如图5所示。因此，适合琴叶榕叶片的生根培养基为1/2MS+IBA0.1mg/L+AC300mg/L+卡拉胶6.0g/L+蔗糖30g/L组合，即以1/2MS培养基为基本培养基，并添加有吲哚-3-丁酸（IBA）0.1mg/L、活性炭300mg/L、卡拉胶6.0g/L和蔗糖30g/L。

表3生根培养基的选择

5）试管苗移栽：炼苗1周，然后将所得试管苗取出，将培养基洗干净，栽于草炭土和珍珠岩(8:2)混合的基质中，并保持85%的湿度。移栽2周后开始长新叶，成活率达97%，如图6所示。

为了研究琴叶榕叶片不同部位的再生能力，把嫩叶分3个部位，分别是叶边、叶脉、叶柄，分别用1、2、3标记，叶片的正反面分别用字母a、b表示。

将琴叶榕叶片不同的部位接种于相同的愈伤组织诱导培养基和不定芽分化培养基中诱导愈伤组织和不定芽分化。由表4可以看出，叶片不同部位均可以分化出不定芽，但其分化不定芽的能力不同，叶柄的分化率高达50%，不定芽数为72个，而叶边的分化率为10%，不定芽数为14个。因此，琴叶榕叶片不同部位的再生能力不同，再生体系优选带有叶柄的叶片，最有利于不定芽的分化。

表4叶片不同部位对不定芽分化的影响

将琴叶榕叶片以不同的放置方式接种于相同的愈伤组织诱导培养基和不定芽分化培养基中诱导愈伤组织和不定芽分化。由表5可以看出，叶片背面向下接触培养基(正放)与叶片背面向上接触培养基(反放)两种放置方式均能分化出不定芽，但正放的分化率为40%，不定芽数为58个，反放的分化率为25%，不定芽数为36个。正放的效果比反放好，这可能与叶片背面接触培养基,叶背面有大量气孔，组织疏松，利于营养吸收有关。因此，琴叶榕叶片的放置方式也会影响再生，优选的方式为叶片背面朝下接触培养基，最有利于不定芽的分化。

表5叶片不同放置方式对不定芽分化的影响

综上所述，本发明建立的琴叶榕叶片离体再生体系为：愈伤组织诱导培养基为MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L，愈伤组织增殖培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L，不定芽分化培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L，生根培养基为1/2MS+IBA0.1mg/L+AC300+卡拉胶6.0g/L+蔗糖30g/L；接种部位为带叶柄的叶片，方式为叶片背面朝下接触培养基；培养条件为接种后在25±2℃下，暗培养2周后在光照强度为1500～2000lx条件下培养。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims

1.琴叶榕叶片的组织培养基，其特征在于：由愈伤组织诱导培养基、愈伤组织增殖培养基、不定芽分化培养基和生根培养基组成；所述愈伤组织诱导培养基是以MS培养基为基本培养基，并且添加剂组成为蔗糖30g/L、琼脂3.2g/L、6-苄氨基嘌呤2.0mg/L和萘乙酸0.1mg/L；所述愈伤组织增殖培养基是以MS培养基为基本培养基，并且添加剂组成为6-苄氨基嘌呤1.0mg/L和萘乙酸0.1mg/L；所述不定芽分化培养基是以MS培养基为基本培养基，并且添加剂组成为6-苄氨基嘌呤1.0mg/L和萘乙酸0.1mg/L；所述生根培养基是以1/2MS培养基为基本培养基，并且添加剂组成为吲哚-3丁酸0.1mg/L、活性炭300mg/L、卡拉胶6.0g/L和蔗糖30g/L；

所述MS培养基和1/2MS培养基的具体配方如下表所示：

。

2.使用权利要求1所述的琴叶榕叶片的组织培养基进行琴叶榕叶片离体再生的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)愈伤组织诱导：以琴叶榕叶片作为外植体，将叶片清洗消毒后，接种于所述愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，获得愈伤组织；

2)愈伤组织增殖：将愈伤组织转入所述愈伤组织增殖培养基中进行增殖培养；

3)不定芽分化：将愈伤组织接种于所述不定芽分化培养基中进行不定芽分化培养；

4)生根培养：将不定芽的小苗接种到所述生根培养基中进行生根培养；

5)试管苗移栽：将所得试管苗移栽入体积比为8:2的草炭土-珍珠岩混合基质中培养，即得琴叶榕组培种苗；

所述步骤1)～步骤4)中，培养条件为：接种后在25±2℃下，暗培养2周后在光照强度为1500～2000lx条件下培养。

3.根据权利要求2所述的琴叶榕叶片离体再生的方法，其特征在于：所述步骤1)中，琴叶榕叶片为带叶柄的叶片，叶片背面朝下接触培养基。