CN113016610B

CN113016610B - 一种藜麦下胚轴离体再生方法

Info

Publication number: CN113016610B
Application number: CN202110220885.6A
Authority: CN
Inventors: 刘洁玉; 朱木兰; 朱健康
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2021-02-26
Filing date: 2021-02-26
Publication date: 2023-01-10
Anticipated expiration: 2041-02-26
Also published as: CN113016610A

Abstract

本发明公开一种藜麦下胚轴离体再生体系，以藜麦下胚轴作为起始材料，经诱导可获得大量不定芽，可不受季节限制获得再生植株，为藜麦转基因提供技术支撑。本发明建立的藜麦离体再生方法为藜麦新品种创制、分子机理研究等提供技术保障，促进藜麦产业发展。

Description

一种藜麦下胚轴离体再生方法

技术领域

本发明涉及一种植物组织培养和生物技术领域，具体为藜麦下胚轴离体再生方法。

背景技术

藜麦(C.quinoa Wild,2n＝36)属苋科(Amaranthaceae)藜亚科(Chenopodioideae)藜属(Chenopodium)，一年生双子叶植物，其籽粒作为粮食，具有丰富的营养物质。有“粮食之母”之称的藜麦，在20世纪70年代被美国航空航天局选为太空主食(Giusti L.Elgenero Chenopodium en Argentina 1:Numeros decromosomas.Darwiniana,1970,16:98-105.)。在生物学上，藜麦表现出突出的抗逆性和适应性，具有优良的抗寒抗盐性，为明星抗逆植物(杨发荣,刘文瑜,黄杰,魏玉明,金茜.不同藜麦品种对盐胁迫的生理响应及耐盐性评价[J].草业学报,2017,26(12):77-88.)。面对全球生态系统的不断变化，藜麦将成为维护未来国家粮食安全的重要一员，发挥越来越重要的作用。随着人类对藜麦的不断研究，藜麦在遗传育种和分子生物学方面都有了一定的进展。但分子育种方面进展缓慢，严重制约藜麦新品种的创制和推广，成为藜麦推广和产业化进程上的绊脚石。

曹宁等建立了藜麦的快速繁殖体系(曹宁,高旭,丁延庆,程斌,陈天青,何庆才,张立异.藜麦组织培养快速繁殖体系建立研究[J].种子,2018,37(10):110-112，115.)。S.Eisa1等人第一次报针对藜麦愈伤组织和细胞培养产生的体细胞胚胎发生，建立了体外培养方案。下胚轴外植体在添加0.45uM 2,4-D改良的Murashige和Skoog(MS)培养基上，培养2周内诱导愈伤组织。将起源于下胚轴外植体的幼年藜麦愈伤组织转移到无生长素的MS培养基中，超过5％的体细胞胚胎发育成可移植的幼株。可见再生效率很低(Eisa,S.,Koyro,H.,Kogel,K.et al.Induction of somatic embryogenesis in cultured cellsof Chenopodium quinoa.Plant Cell Tiss Organ Cult 81,243-246(2005))。

Mohsen Hesami.等人利用下胚轴建立了再生方案，在黑暗条件下在MS培养基中获得种子萌发率最高。取生长一周无菌苗(子叶已经展开，图11)的0.5-1.0cm下胚轴在添加0.5mg/L 2,4-D和0.05mg/L BAP的MS基培养基上观察到最佳愈伤组织诱导率为93.33％。在添加1.0mg/L BAP，1.0mg/L KIN和0.2mg/L IBA的MS培养基上，再生频率为83.33％。(Development of a regeneration protocol through indirect organogenesis inChenopodium quinoa wild.Indo-Am.J.Agric.&Vet.Sci.,2016.4(1):25-32.)

虽然使用BAP等多类型激素，但用于取材状态和大小的限制，效率仍然不高(见图12)，并且并未研究离体再生小植物的伸长、生根和移栽成苗阶段。尚未报道有效的藜麦离体再生体系。

20世纪转基因和基因编辑技术的迅速发展，分子育种在培育新品种方面发挥着日益重要的作用。实现分子育种的关键是高效稳定的遗传转化体系。但藜麦遗传转化困难，严重影响藜麦的深入研究，其中制约藜麦遗传转化的关键因素是缺乏藜麦的离体再生体系。

发明内容

为解决上述瓶颈，本发明旨在建立藜麦的高效稳定的离体再生体系。一方面本发明人开展以藜麦多种不同外植体的再生研究，结合再生不同步骤的研究探索实现了高效藜麦离体再生体系。本发明中发明人针对下胚轴外植体的离体再生研究，通过添加不同激素，培养步骤的不同处理等方法，旨在提高以藜麦下胚轴为外植体的再生体系效率，实现藜麦的高效离体再生。

本发明的技术方案是一种藜麦离体再生方法，其包括如下步骤：

(1)无菌苗的制备：选取藜麦种子消毒后，放入基本培养基MS中培养。在具体实施方式中，先使用5‰高猛酸钾消毒3分钟，再用10％的次氯酸钠消毒12分钟，清洗后放入基本培养基MS中培养，优选将其置于光照条件下。

(2)愈伤组织诱导：切取步骤(1)中培养的子叶刚展开时的无菌苗的下胚轴(优选长度为1-3mm，优选为2mm)，接种于愈伤诱导培养基上，其中，所述愈伤诱导培养基为MS作为基本培养基，添加6-苄氨基嘌呤(BA)0.1-0.5mg/L与萘乙酸(NAA)1-5mg/L，并且添加脯氨酸0.05-3mg/L。优选地，BA添加量为0.2-0.3mg/L，NAA添加量为2-3mg/L，且两者的用量比例为1：10，脯氨酸添加量为0.1-0.2mg/L。在优选方式中，将其在黑暗条件培养，培养时间为10-15d，优选为13d。

(3)不定芽诱导培养：将步骤(2)获得的愈伤组织接种至不定芽诱导预培养基上，其中所述不定芽诱导培养基使用MS作为基本培养基，分别添加BA 0.5-3mg/L与NAA 0.1-0.3mg/L。优选地，BA添加量为1mg/L，NAA添加量为0.1mg/L。培养7-8周左右，外植体即产生不定芽。不定芽诱导发生率为89.44％。

(4)不定芽伸长培养：将步骤(3)中产生的不定芽诱导出的丛芽分成单株接种至不定芽伸长诱导培养基，其中不定芽诱导培养基使用MS作为基本培养基，添加0.1-1mg/L BA与0.01-0.1mg/L NAA。优选地，BA添加量为0.1mg/L，NAA添加量为0.01mg/L。培养4周左右后，不定芽伸长。

(5)生根诱导：取步骤(4)的单个芽伸长后的茎节段，放入生根培养基上，其中生根诱导培养基为MS作为基本培养基，添加3-吲哚丁酸(IBA)0.2-0.8mg/L，优选为0.4-0.6mg/L。于光下培养时间为8-9d，生根诱导率为95.56％。

(6)炼苗：挑选步骤(5)中已生根且长势健壮的瓶苗进行炼苗，炼苗方法为：将培养瓶盖打开，注入0.5-1cm清水，置于室温、自然光照下，静置2-3天，将瓶苗掏出，将基部附着的培养基洗净，准备移栽。

(7)移栽：将炼苗后的再生苗进行移栽，移栽基质为泥炭土：珍珠岩：蛭石＝3：1：1，移栽前将基质连盆浸入水中使其完全润湿，湿度正常养护。1个月后统计成活率，成活率在81.5％以上。

其中，所有MS培养基中均添加蔗糖30g/L，琼脂粉5.5g/L，调节培养基pH值为5.8。培养条件为20-25℃，光照强度2000-3000lx，光照12h/d。不定芽诱导培养基中每瓶接种外植体1个，每种处理接种30瓶。愈伤诱导培养基中每个培养皿接种外植体13个，每种处理接种10个培养皿。

本发明在多个环节进行优化组合实现高效藜麦离体再生。首先是，本发明采用子叶刚展开的无菌苗下胚轴作为藜麦外植体是实现高效离体再生的基础；其次结合利用常用激素配比研究获得最佳激素组合，在简化激素类型降低成本的同时实现藜麦高效离体再生，为之后藜麦分子育种和分子生物学研究降低了成本；再次，本发明利用黑暗条件诱导愈伤组织，可实现愈伤诱导率97.78％，尤其是添加脯氨酸使愈伤组织更加致密，为后续分化奠定了基础，且在一定范围内，随培养时间和转接次数增加，愈伤组织逐渐膨大；此外本发明通过在光照条件下实现无菌苗100％萌发，与黑暗相比还可以简化组培的步骤。，通过本发明的离体再生方法，最终实现不定芽89.44％的高效再生。因此，藜麦作为未来维护国家粮食战略安全的重要一员，本发明提供国内首个高效藜麦下胚轴离体再生方案，具有重要的意义和应用前景。

附图说明

图1：无菌种子萌发，bar＝1cm。

图2：本发明下胚轴截取时的生长状态，bar＝0.5cm。

图3：本发明下胚轴诱导产生的愈伤组织，bar＝1cm。

图4：高浓度激素下诱导的愈伤组织，bar＝1cm。

图5：本发明愈伤组织的膨大，bar＝1cm。

图6：本发明愈伤组织的起始分化,bar＝1cm。

图7：本发明培养的不定芽状态，bar＝1cm

图8：本发明不定芽的伸长，bar＝1cm。

图9：本发明不定芽的生根，bar＝1cm。

图10：本发明再生苗移栽入土后3周，bar＝0.5cm。

图11：Mohsen Hesami等人文章中取外植体时的无菌苗生长状态。

图12：Mohsen Hesami等人文章中的芽分化状态图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对本发明作进一步的说明，但并不构成对本发明限制。

实施例一

(1)取材：饱满的藜麦种子；

(2)消毒：种子用无菌水冲洗后，使用5‰高锰酸钾溶液处理3min，再使用10％次氯酸钠溶液处理15min，无菌水冲洗5次，滤纸吸干材料表面水分，接种至MS基本培养基中，培养5d后获得无菌苗，此时子叶刚刚开展(图1)。其中培养基所含蔗糖的量为30g/L，所含琼脂粉的量为5.5g/L，肌醇0.1g/L，调节培养基pH值为5.8；培养条件为25±2℃，光照强度2000-3000lx，光照12h/d。图1所示即是本发明切取外植体时的无菌苗阶段即子叶刚刚开展这一时期切取，而作为对照，提供Mohsen Hesami等人文章中取外植体时的无菌苗生长状态(见图11)，并没有注意到切取的最佳时机。

(3)愈伤组织诱导：选(2)中的无菌苗用解剖刀切2mm左右下胚轴，接种于愈伤诱导培养基上(图2)。愈伤诱导培养基以MS为基本培养基，添加不同浓度的BA(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/L)与NAA(1、2、3、4、5mg/L)两种常见植物激素进行不同浓度的组合，旨在获得高效诱导愈伤的激素配比(表1)。13d后统计愈伤率。其中培养基所含蔗糖的量为30g/L，所含琼脂粉的量为5.5g/L，添加不同浓度的脯氨酸，调节培养基pH值为5.8；培养条件为黑暗培养，培养温度为25±2℃。每个处理3个重复，每个重复30个下胚轴。

结果表明，不同浓度的NAA和BA激素组合能诱导藜麦下胚轴产生愈伤组织(表1)。当BA浓度一定时，随NAA浓度升高，愈伤诱导率呈现先升后降的趋势，最适NAA浓度为2-3mg/L。当NAA浓度一定时，随BA浓度升高，愈伤诱导率呈现先升后降的趋势，最适BA浓度为0.2-0.3mg/L。并且不同浓度的脯氨酸对诱导藜麦下胚轴产生的愈伤组织的致密度有影响(表2)。在脯氨酸添加0.2g/L时，愈伤组织致密度最佳；当脯氨酸添加低于0.2g/L时，随脯氨酸添加量的升高，愈伤逐渐致密，颜色淡黄；当脯氨酸添加高于0.2g/L时，随脯氨酸添加量的升高，愈伤状态逐渐不佳，逐渐发黄，不利于诱导不定芽。

培养14d时，其中添加0.2mg/L BA，2mg/L NAA，0.2g/L脯氨酸愈伤诱导培养基上诱导效果最好，诱导率达到97.78％，愈伤成淡黄色，质地紧密，颗粒状易于之后诱导为不定芽，且所需启动时间最短，接种9d左右开始启动，13d左右形成愈伤组织(图3)。当NAA浓度达到5mg/L时，愈伤活力差，诱导时间长(图4)。综上，BA最适浓度范围为0.2-0.3mg/L，NAA最适浓度范围为2-3mg/L，且两者用量比为1：10；其中最佳用量为0.2mg/L BA和2mg/L NAA激素组合为愈伤诱导培养基最佳激素组合。

表1不同激素组合对诱导下胚轴愈伤组织的影响

注：统计时间为培养的第14d。

表2：脯氨酸浓度对愈伤组织质地的影响

脯氨酸浓度(mg/L)	愈伤组织质地
		0	疏松
0.1	组织淡黄、致密
		0.2	组织淡黄、致密、颗粒状
0.3	组织黄、致密
		0.4	组织黄、致密
0.5	组织暗黄、致密

注：统计时间为培养的第14d。

(4)不定芽诱导：

将步骤(3)获得的愈伤组织放入不定芽诱导培养基上。不定芽诱导培养基使用MS作为基本培养基，选取了不同浓度的BA(0.5、1、2、3mg/L)与NAA(0.1、0.2、0.3mg/L)两种常见植物激素进行不同浓度的组合(表3)，进行不定芽高效诱导培养的研究。其中培养基所含蔗糖的量为30g/L，所含琼脂粉的量为5.5g/L。另添加促进培养基成分发挥作用的肌醇0.1g/L，调节培养基pH值为5.8；培养条件为25±2℃，光照强度2000-3000lx，光照14h/d。每个处理3个重复，每个重复30个愈伤块。对步骤(2)中的愈伤组织培养85d后统计不定芽发生率见表3。

结果表明，12种BA与NAA的激素组合藜麦愈伤组织产生不定芽，随着激素浓度的增加，不定芽发生率逐步上升，在一定范围内提高NAA的浓度能在一定程度上提高不定芽芽发生率；过高浓度的BA会降低不定芽芽发生率，使之持续愈伤化；当BA浓度为1mg/L时外植体形成不定芽发生率平均接近89.44％，植株保持有较好的整齐性和稳定性；当BA浓度达到3mg/L时，愈伤组织持续愈伤化，不分化成不定芽。综上，BA最适浓度范围为0.5-1mg/L，NAA最适浓度范围为0.1-0.2mg/L，而1mg/L BA+0.1mg/L NAA为不定芽诱导培养的最佳激素组合配方。

将(3)中的愈伤组织放入1mg/L BA+0.1mg/L NAA的最佳不定芽培养基上，培养10d后愈伤组织膨大，呈淡绿色(图5)。之后，将愈伤组织分割成5mm×5mm的愈伤块，转接至相同培养基上，培养2周后不定芽刚刚形成(图6)。之后将不定芽转接相同培养基上，培养18d获得不定芽(图7)。

表3不同激素组合对诱导不定芽的影响

注：统计时间为愈伤培养的第85d。

(5)将步骤(4)获得的丛芽分割后转入不定芽伸长诱导培养基。培养基使用MS作为基本培养基，选取了不同浓度的BA(0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mg/L)与NAA(0.01、0.03、0.05、0.07、0.09mg/L)两种激素进行不同浓度的组合(表4)，以获得不定芽高效伸长诱导培养的研究。其中培养基所含蔗糖的量为30g/L，所含琼脂粉的量为5.5g/L，调节培养基pH值为5.8；培养条件为25±2℃，光照强度2000-3000lx，光照14h/d。

结果表明，26种BA与NAA的不同激素组合促进藜麦不定芽伸长，当BA浓度一定时，在一定范围内提高NAA的浓度能在一定程度上提高不定芽芽发生率；当NAA浓度一定时，在一定范围内提高BA的浓度能在一定程度上提高不定芽芽发生率。BA最适浓度范围为0-0.1mg/l，NAA最适浓度范围为0-0.01mg/l，0.1mg/LBA+0.01mg/L NAA为不定芽伸长诱导培养的最佳激素组合配方。培养3-4周可观察到芽明显伸长(图8)。作为对照，提供MohsenHesami等人文章中的芽分化状态图(见图12)

表4不同激素组合对诱导不定芽伸长的影响

注：统计时间为不定芽伸长培养的第4周。

(6)将步骤(5)获得的伸长不定芽截取一个伸长芽，转接入附含有一定浓度的IBA的生根培养基上。生根培养基使用MS作为基本培养基，选取了不同浓度的IBA(0.2、0.4、0.6、0.8mg/L)(表5)，以获得不定芽诱导高效生根配方。其中培养基所含蔗糖的量为30g/L，所含琼脂粉的量为5.5g/L，调节培养基pH值为5.8；培养条件为25±2℃，光照强度2000-3000lx，光照14h/d。

结果表明，一定浓度IBA促进藜麦生根，在一定范围内提高IBA的浓度能在一定程度上提高不定芽生根率。IBA最适浓度范围为0.4-0.6mg/L，0.6mg/L IBA为不定芽生根诱导培养的最佳激素。培养8-9天可观察到生根(图9)。

表5激素对诱导不定芽生根的影响

(7)将步骤(6)获得的生根苗连同培养基、培养瓶等一起转入28±2℃、光照(80μmol.m-2.s-1)12h/d的培养条件下进行耐受培养1-2周后，打开培养瓶盖子，注入10-20ml无菌水或去离子水，炼苗5-8天。将生根小苗移栽到泥炭、菜园土和珍珠岩(3∶6∶1)的基质中，在24±2℃，光照培养(2000-3000lx)12h/d温室中生长良好，成为与自然生长小苗一致的藜麦再生植株(图10)。

Claims

1.一种高效藜麦下胚轴离体再生方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）无菌苗的制备：用高猛酸钾消毒，再用次氯酸钠消毒，清洗后放入基本培养基MS中培养；

（2）愈伤组织的诱导：选取（1）中培养的无菌苗，在其子叶刚展开时，用解剖刀切取下胚轴，接种于愈伤诱导培养基上，其中，所述愈伤诱导培养基为MS作为基本培养基， 6-苄氨基嘌呤添加量为0.2 -0.3mg/L，萘乙酸添加量为2-3 mg/L，且两者的用量比例为1：10，脯氨酸添加量为0.1-0.2 mg/L；将其在黑暗条件培养，培养时间为10-15 d；

（3）不定芽诱导培养：将步骤（2）获得的愈伤组织接种至不定芽诱导培养基上，其中所述不定芽诱导培养基使用MS作为基本培养基，添加1mg/L 6-苄氨基嘌呤与0.1-0.3 mg/L萘乙酸；

（4）不定芽伸长培养：将步骤(3)中产生的不定芽诱导出的丛芽分成单株接种至不定芽伸长诱导培养基，其中不定芽伸长诱导培养基使用MS作为基本培养基，添加0.1mg/L 6-苄氨基嘌呤与0.01-0.05 mg/L 萘乙酸；

（5）生根诱导：取步骤（4）的单个芽伸长后的茎节段，放入生根培养基上，其中生根诱导培养基为MS作为基本培养基，添加0.4-0.6mg/L 3-吲哚丁酸，于光下培养。

2.如权利要求1所述的高效藜麦下胚轴离体再生方法，其特征在于，进一步包括下述步骤：

（6）炼苗与移栽：挑选第（5）步中已生根且长势健壮的瓶苗进行炼苗，炼苗方法为：将培养瓶盖打开，注入0.5-1cm清水，置于室温、自然光照下，静置2-3天，将瓶苗掏出，将基部附着的培养基洗净，准备移栽；移栽基质为泥炭土：珍珠岩：蛭石=3：1：1，移栽前将基质连盆浸入水中使其完全润湿。

3.如权利要求1所述的高效藜麦下胚轴离体再生方法，其特征在于，所使用的培养基中均添加蔗糖30 g/L，琼脂粉5.5 g/L，调节培养基pH值为5.8。

4.如权利要求1所述的高效藜麦下胚轴离体再生方法，其特征在于，第（2）步中切取的下胚轴的长度为1-3mm。

5.如权利要求1所述的高效藜麦下胚轴离体再生方法，其特征在于，第（3）-（5）步培养条件为20-25℃，光照强度2000-3000lx，光照12h/d。

6.如权利要求1所述的高效藜麦下胚轴离体再生方法，其特征在于，第（1）步中，是先使用5‰高猛酸钾消毒3分钟，再用10%的次氯酸钠消毒12分钟，清洗后放入基本培养基MS中培养。

7.如权利要求1所述的高效藜麦下胚轴离体再生方法，其特征在于，第（3）步中，所述不定芽诱导培养基中的6-苄氨基嘌呤添加量为1mg/L，萘乙酸添加量为0.1mg/L。

8.如权利要求1所述的高效藜麦下胚轴离体再生方法，其特征在于，愈伤诱导培养基中添加0.2 mg/L 6-苄氨基嘌呤和2 mg/L萘乙酸。

9.如权利要求1所述的高效藜麦下胚轴离体再生方法，其特征在于，愈伤诱导培养基中添加脯氨酸的量为0.1 mg/L。

10.如权利要求1所述的高效藜麦下胚轴离体再生方法，其特征在于，第（4）步中，不定芽伸长诱导培养基中，6-苄氨基嘌呤添加量为0.1mg/L，萘乙酸添加量为0.01 mg/L。

11.如权利要求1所述的高效藜麦下胚轴离体再生方法，其特征在于，第（5）步中，生根诱导培养基中，添加3-吲哚丁酸0.5 mg/L。