CN115152629A - 一种树莓组织培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种树莓组织培养方法，属于植物组织培养技术领域。本发明采集树莓外植体，经过诱导培养、增殖培养、壮苗培养和生根培养，获得组培苗，通过调整各培养阶段的培养基激素浓度和配比，能够提升诱导率、增殖系数、生根率及组培苗性状，提升树莓组织培养的繁殖效率，促进产业发展。

Description

一种树莓组织培养方法
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，尤其涉及一种树莓组织培养方法。
背景技术
树莓，属蔷薇科悬钩子属植物，属灌木小浆果果树。树莓果实成熟时色泽宜人，柔嫩多汁，风味独特。果实中除含有糖、酸、维生素等营养物质外，富含过氧化物歧化酶、花青素、鞣花酸、类黄酮等营养保健成分，具有防止脑神经老化、强心、抗癌、软化血管、增强人体免疫、保护视力等功能。
2018年树莓面积9573hm2，产量3.83万t。预计我国将在2030年树莓新增面积达2万hm2，需种苗达1.8亿株以上，市场前景广阔。我国树莓产业发展很快，积累了宝贵经验，但苗木繁育上仍以传统的扦插、根蘖为主，与组织培养繁育的苗木相比，繁殖系数低，品种容易退化，植株生长慢，产量低、树势弱，不利于规模化生产的需要。要使之支撑国内产业参与国际市场竞争，应建立树莓良种快速繁殖体系，为产业发展提供优苗壮苗。因此，亟需从外植体诱导、增殖培养、壮苗培养、生根培养、炼苗与定植等方面建立快繁体系，为我国树莓工厂化、规模化、产业化快速发展提供技术支持。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种树莓组织培养方法，通过调整各培养阶段的培养基激素浓度与配比，提升诱导率、增殖系数、生根率及组培苗性状，提升树莓组织培养的繁殖效率。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
一种树莓组织培养方法，包括外植体经过诱导培养、增殖培养、壮苗培养和生根培养，获得组培苗，其中：
诱导培养基配方为MS+BA 0.8-1.2mg/L+GA30.3-0.8mg/L+IBA 0.08-0.12mg/L+糖30-35g/L+琼脂4.0-4.5g/L，pH 5.8-6.0；
增殖培养基配方为MS+BA 0.3-0.8mg/L+GA30.3-0.6mg/L+IBA 0.05-0.1mg/L+糖30-35g/L+琼脂4.0-4.5g/L，pH 5.8-6.0；
壮苗培养基配方为MS+BA 0.2-0.4mg/L+GA30.2-0.5mg/L+IBA 0-0.1mg/L+糖15-30g/L+琼脂3.8-4.5g/L，pH 5.8-6.0；
生根培养基配方为1/2MS+IBA 0.2-0.5mg/L+糖15-20g/L+琼脂4.0-4.5g/L，pH5.6-5.8。
优选的是，所述外植体为带腋芽茎段，春季采集于新萌发半木质化枝条，秋季采集于刚停长封顶的枝条。
更优选的是，所述带腋芽茎段长度为1-2cm。
优选的是，所述外植体经过消毒处理，包括流水冲洗2-3h，置超净工台上用75％的酒精消毒30s以上，无菌水荡洗2-3次，0.1％HgCl2消毒3-7min，无菌水荡洗4-5次。
优选的是，所述组织培养过程中温度23-25℃，光照强度2000-3000lx，光照周期14h/10h，空气相对湿度60％-70％。
优选的是，所述增殖培养阶段，当组培苗长至3-5cm时，将丛生芽分为3-5个芽为一堆转接，剪去多余的大叶，35-45d转接一次。
优选的是，生根培养后用矿源黄腐酸钾2000-3000倍液+海藻素1500-2000倍液浸泡组培苗根部4-6min，移栽。
更优选的是，所述移栽基质由草炭土和沙土按体积比1-3:1组成。
更优选的是，所述移栽后扣小拱棚和遮阳网，棚内温度控制在白天22-27℃，夜间7-14℃，相对湿度80％-90％。
相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了一种树莓组织培养方法，调整了各培养阶段的培养基激素浓度与配比。通过调整诱导培养基激素浓度，提升了诱导萌芽率和出芽数量；通过调整增殖培养基激素浓度，提升了增殖系数，且有效降低了玻璃化；通过调整壮苗培养基激素浓度，提升了组培苗性状，利于后续生根；通过调整生根培养基激素浓度，提升了生根率，且缩短了生根时间，提升繁殖效率。本发明树莓组织培养方法，能够为树莓无性繁殖手段提供指导，利于产业发展。
具体实施方式
本发明提供了一种树莓组织培养方法，包括外植体经过诱导培养、增殖培养、壮苗培养和生根培养，获得组培苗。
本发明树莓组织培养方法适用于‘波尔卡’等树莓品种。
本发明优选树莓组织培养的外植体为带单个腋芽的茎段，进一步优选茎段长度为1-2cm，更优选茎段长度为1.5cm。
本发明优选带腋芽茎段来源于春季新萌发半木质化枝条，或秋季刚停长封顶的枝条。更优选，枝条在春、秋两季的晴天、阳光充足的上午9点-10点的日光温室(或其他设施)中采集。在温室或其他设施中采集枝条，相较于露地栽植的树莓，携带有少的病原菌，组织培养过程中污染率低。
生长条件下采集的外植体都携带有病原菌，影响组织培养的成活率，因此，需要对外植体进行消毒；另外，不适宜的消毒方法也会对外植体造成损伤，影响组织培养进行。本发明优选外植体消毒方法包括：用流水冲洗外植体2-3h，置超净工台上用75％的酒精消毒30s后，用无菌水荡洗2-3次，然后用0.1％HgCl2消毒，浸泡3-7min，无菌水荡洗4-5次；进一步优选HgCl2浸泡3-5min；更优选3min。此消毒方法能够保证外植体较低的污染率，且对腋芽损伤较小。
本发明诱导培养基配方组成为MS+BA 0.8-1.2mg/L+GA3 0.3-0.8mg/L+IBA 0.08-0.12mg/L+糖30-35g/L+琼脂4.0-4.5g/L；进一步优选MS+BA 1.0-1.2mg/L+GA30.5-0.8mg/L+IBA 0.08-0.1mg/L+糖30-35g/L+琼脂4.0-4.5g/L；更优选MS+BA 1.0mg/L+GA30.5mg/L+IBA 0.1mg/L+糖30g/L+琼脂4.0g/L。
本发明增殖培养基配方组成为MS+BA 0.4-0.8mg/L+GA3 0.3-0.6mg/L+IBA 0.05-0.1mg/L+糖30-35g/L+琼脂4.0-4.5g/L；进一步优选MS+BA 0.5-0.8mg/L+GA30.5-0.6mg/L+IBA 0.08-0.1mg/L+糖30-35g/L+琼脂4.0-4.5g/L；更优选MS+BA 0.5mg/L+GA30.5mg/L+IBA0.1mg/L+糖30g/L+琼脂4.0g/L。
本发明优选增殖培养过程中，当组培苗长至3-5cm时，将丛生芽分为3-5个芽为一堆进行转接，剪去多余的大叶，35-45d转接一次；进一步优选当组培苗长至4cm时，将丛生芽分为4个芽为一堆转接，每瓶6堆，剪去多余的大叶，40d转接一次。
本发明壮苗培养基配方组分为MS+BA 0.2-0.4mg/L+GA30.2-0.5mg/L+IBA 0-0.1mg/L+糖15-30g/L+琼脂3.8-4.5g/L；进一步优选MS+BA 0.2-0.3mg/L+GA30.3-0.5mg/L+IBA 0.1mg/L+糖15-30g/L+琼脂3.8-4.5g/L；更优选MS+BA0.3mg/L+GA30.5mg/L+IBA0.1mg/L+糖30g/L+琼脂4.0g/L。
本发明优选组织培养过程中的培养条件为：温度为23-25℃，光照强度为2000-3000lx，光照周期为14h/10h；进一步优选温度23.5-24.5℃，光照强度2200-2800lx；更优选温度24℃，光照强度2500lx。
本发明优选经过壮苗培养的组培苗生长至3-5cm，进行生根培养；进一步优选待组培苗生长4cm，进行生根培养。
本发明生根培养基配方组分为1/2MS+IBA 0.4-0.5mg/L+糖15-20g/L+琼脂4.0-4.5g/L；进一步优选1/2MS+IBA 0.5mg/L+糖15-20g/L+琼脂4.0-4.5g/L；更优选1/2MS+IBA0.5mg/L+糖15g/L+琼脂4.0g/L。
本发明优选生根培养后用矿源黄腐酸钾2000-3000倍液+海藻素1500-2000倍液浸泡组培苗根部4-6min，移栽；进一步优选用矿源黄腐酸钾2200-2800倍液+海藻素1700-1800倍液浸泡组培苗根部4-6min；更优选用矿源黄腐酸钾2500倍液+海藻素1750倍液浸泡组培苗根部5min。
本发明优选移栽基质由草炭土和沙土按体积比1-3:1组成；进一步优选草炭土:沙土＝2:1。优选基质厚度6-10cm，进一步优选厚度8cm，进行消毒且压实。
本发明优选移栽后扣小拱棚和遮阳网，棚内温度控制在白天22-27℃，夜间7-14℃，相对湿度80％-90％；进一步优选温度控制在白天25℃，夜间10℃，相对湿度85％。作为一种可实施方式，本发明根据天气情况揭、盖遮阳网，根据幼苗生长情况补充营养液，根据病虫害发生情况采取相应防治措施。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种‘波尔卡’树莓组织培养方法，包括以下步骤：
(1)外植体的采集与消毒
在春季的晴天、阳光充足的上午9点-10点采集日光温室栽植树莓的枝条，选择新萌发半木质化枝条，作为外植体材料，将外植体叶片从叶柄基部切除，剪成1.5cm含腋芽的茎段；用流水冲洗茎段2-3h，置超净工台上用75％的酒精消毒30s后，用无菌水荡洗2-3次，0.1％HgCl2消毒3min，无菌水荡洗4-5次；
(2)诱导培养
消毒处理后接入诱导培养基上进行诱导培养，诱导培养基为MS+BA 1.0mg/L+GA30.5mg/L+IBA0.1mg/L+糖30g/L+琼脂4.0g/L，pH 5.8-6.0。培养室温度24℃，光照强度2500lx，光照14h，黑暗10h，空气相对湿度65％；
(3)增殖培养
将诱导出的无菌苗转接增殖培养基上，增殖培养基为MS+BA 0.5mg/L+IBA0.1mg/L+GA30.5mg/L+糖30g/L+琼脂4.0g/L，pH 5.8-6.0，当组培苗长至3-5cm时，将丛生芽分为3-5个芽为一堆转接，剪去多余的大叶，每瓶6堆，40d转接一次，培养条件同上；
(4)壮苗培养
将增殖培养的组培苗接入壮苗培养基上，壮苗培养基为MS+BA 0.3mg/L+GA30.5mg/L+IBA 0.1mg/L+糖30g/L+琼脂4.0g/L，pH 5.8-6.0，培养条件同上，每瓶18个苗；
(5)生根培养
经壮苗培养的组培苗苗高长至3-5cm时，将组培苗剪成单株苗，转入生根培养基上，生根培养基为1/2MS+IBA0.5mg/L+糖15g/L+琼脂4.0g/L，pH 5.6-5.8，培养条件同上，每瓶15个苗；
(6)移栽
从培养器皿中将组培苗取出，用清水将根部附着的培养基冲洗干净，以确保根部吸收通畅，避免杂菌滋生。再用矿源黄腐酸钾2500倍液+海藻素1750倍液浸泡5min，移栽到消毒好并压实的基质中(草炭土:沙土＝2:1)，基质厚8cm。上方扣上塑料小拱棚，外加遮阳网。棚内温度控制在白天25℃，夜间10℃，相对湿度85％，视天气情况增减盖遮阳网，定期浇营养液及病害防治，促进植株生长。
实施例2
一种树莓组织培养方法，包括以下步骤：
(1)外植体的采集与消毒
在春季的晴天、阳光充足的上午9点-10点采集日光温室栽植树莓的枝条，选择新萌发半木质化枝条，作为外植体材料，将外植体叶片从叶柄基部切除，剪成1.0cm含腋芽的茎段；用流水冲洗茎段2-3h，置超净工台上用75％的酒精消毒30s后，用无菌水荡洗2-3次，0.1％HgCl2消毒5min，无菌水荡洗4-5次；
(2)诱导培养
消毒处理后接入诱导培养基上进行诱导培养，诱导培养基为MS+BA0.8mg/L+GA30.3mg/L+IBA 0.08mg/L+糖30g/L+琼脂4.0g/L，pH 5.8-6.0。培养室温度23℃，光照强度2000lx，光照14h，黑暗10h，空气相对湿度70％；
(3)增殖培养
将诱导出的无菌苗转接增殖培养基上，增殖培养基为MS+BA0.4mg/L+IBA0.05mg/L+GA30.3mg/L+糖30g/L+琼脂4.0g/L，pH 5.8-6.0，当组培苗长至3-5cm时，将丛生芽分为3-5个芽为一堆转接，剪去多余的大叶，每瓶6堆，35d转接一次，培养条件同上；
(4)壮苗培养
将增殖培养的组培苗接入壮苗培养基上，壮苗培养基为MS+BA0.2mg/L+GA30.2mg/L+IBA 0.1mg/L+糖15g/L+琼脂3.8g/L，pH 5.8-6.0，培养条件同上，每瓶18个苗；
(5)生根培养
经壮苗培养的组培苗苗高长至3-5cm时，将组培苗剪成单株苗，转入生根培养基上，生根培养基为1/2MS+IBA 0.4mg/L+糖15g/L+琼脂4.0g/L，pH5.6-5.8，培养条件同上，每瓶15个苗；
(6)移栽
从培养器皿中将组培苗取出，用清水将根部附着的培养基冲洗干净，以确保根部吸收通畅，避免杂菌滋生。再用矿源黄腐酸钾2000倍液+海藻素1500倍液浸泡4min，移栽到消毒好并压实的基质中(草炭土:沙土＝1:1)，基质厚6cm。上方扣上塑料小拱棚，外加遮阳网。棚内温度控制在白天22℃，夜间7℃，相对湿度90％，视天气情况增减盖遮阳网，定期浇营养液及病害防治，促进植株生长。
实施例3
一种树莓组织培养方法，包括以下步骤：
(1)外植体的采集与消毒
在秋季的晴天、阳光充足的上午9点-10点采集日光温室栽植树莓的枝条，选择刚停长封顶的枝条，作为外植体材料，将外植体叶片从叶柄基部切除，剪成2.0cm含腋芽的茎段；用流水冲洗茎段2-3h，置超净工台上用75％的酒精消毒30s后，用无菌水荡洗2-3次，0.1％HgCl2消毒7min，无菌水荡洗4-5次；
(2)诱导培养
消毒处理后接入诱导培养基上进行诱导培养，诱导培养基为MS+BA1.2mg/L+GA30.8mg/L+IBA0.12mg/L+糖35g/L+琼脂4.5g/L，pH 5.8-6.0。培养室温度25℃，光照强度3000lx，光照14h，黑暗10h，空气相对湿度60％；
(3)增殖培养
将诱导出的无菌苗转接增殖培养基上，增殖培养基为MS+BA0.8mg/L+IBA0.08mg/L+GA30.6mg/L+糖35g/L+琼脂4.5g/L，pH 5.8-6.0，当组培苗长至3-5cm时，将丛生芽分为3-5个芽为一堆转接，剪去多余的大叶，每瓶6堆，45d转接一次，培养条件同上；
(4)壮苗培养
将增殖培养的组培苗接入壮苗培养基上，壮苗培养基为MS+BA0.4mg/L+GA30.4mg/L+糖30g/L+琼脂4.5g/L，pH 5.8-6.0，培养条件同上，每瓶18个苗；
(5)生根培养
经壮苗培养的组培苗苗高长至3-5cm时，将组培苗剪成单株苗，转入生根培养基上，生根培养基为1/2MS+IBA 0.45mg/L+糖20g/L+琼脂4.5g/L，pH5.6-5.8，培养条件同上，每瓶15个苗；
(6)移栽
从培养器皿中将组培苗取出，用清水将根部附着的培养基冲洗干净，以确保根部吸收通畅，避免杂菌滋生。再用矿源黄腐酸钾3000倍液+海藻素2000倍液浸泡6min，移栽到消毒好并压实的基质中(草炭土:沙土＝3:1)，基质厚10cm。上方扣上塑料小拱棚，外加遮阳网。棚内温度控制在白天27℃，夜间14℃，相对湿度80％，视天气情况增减盖遮阳网，定期浇营养液及病害防治，促进植株生长。
实施例4
取样地点和消毒方法对树莓诱导培养污染率的影响
以‘波尔卡’树莓作为实验材料。
在春季的晴天、阳光充足的上午9点-10点采集日光温室及露地栽植树莓的枝条，选择新萌发半木质化枝条作为外植体材料，将外植体叶片从叶柄基部切除，剪成1.5cm含腋芽的茎段，再用流水冲洗2-3h，置超净工台上用75％的酒精消毒30s后，用无菌水荡洗2-3次。然后用0.1％HgCl2消毒，时间设3，5，7，9min，每个处理10个茎段，无菌水荡洗4-5次，每瓶接种5个外殖体，10瓶为一个处理，三次重复。2周后观察培养效果。根据表1和表2可以看出，在温室内采集枝条外植体、选择0.1％HgCl2消毒3min能够有效降低外植体组织培养污染率，且能够避免外植体受损。
表1日光温室栽植对树莓外植体诱导培养污染率的影响
Figure BDA0003764270590000081
表2 0.1％HgCl2消毒时间对树莓外植体的灭菌效果影响
Figure BDA0003764270590000082
Figure BDA0003764270590000091
实施例5
诱导培养基激素浓度对树莓诱导效果的影响
按照实施例4方法处理后，将消毒的外植体接入诱导培养基上进行诱导培养，诱导培养基为MS+BA 1.0mg/L+GA30.5mg/L+IBA 0.1mg/L+糖30g/L+琼脂4.0g/L，pH 5.8-6.0。培养室温度23℃-25℃，光照强度2000-3000lx，光照14h，黑暗10h，空气相对湿度60％-70％。对照选择诱导培养基为MS+BA0.6mg/L+IBA 0.2mg/L+GA30.5mg/L+糖30g/L+琼脂4.0g/L，pH5.8-6.0。培养30d后调查统计相关数据。
表3诱导培养基对树莓诱导培养效果的影响
Figure BDA0003764270590000092
根据表3可以看出，在诱导培养阶段，适宜的激素浓度，能够明显提升树莓诱导培养时的萌芽率，还提升了出芽数量。
实施例6
增殖培养基激素浓度对树莓增殖效果的影响
将实施例5诱导出的无菌苗转接增殖培养基上，增殖培养基为MS+BA0.5mg/L+IBA0.1mg/L+GA30.5mg/L+糖30g/L+琼脂4.0g/L，pH 5.8-6.0，当组培苗长至3-5cm时，将丛生芽分为3-5个芽为一堆转接，剪去多余的大叶，每瓶6堆。35-45d转接一次，培养条件同上。对照选择增殖培养基为MS+BA0.3mg/L+IBA0.1mg/L+GA30.3mg/L+糖30g/L+琼脂4.0g/L，pH5.8-6.0。培养45d调查相关数据。
表4增殖培养基对树莓组培苗增殖效果的影响
Figure BDA0003764270590000093
Figure BDA0003764270590000101
根据表4可以看出，在增殖培养阶段，适宜的激素浓度除了能够提升增殖系数外，还能够促进组培苗长势，降低玻璃化程度。
实施例7
壮苗培养基激素浓度对树莓组培苗壮苗培养效果的影响
将实施例6增殖培养的组培苗接入壮苗培养基上，壮苗培养基为MS+BA0.3mg/L+GA30.5mg/L+IBA 0.1mg/L+糖30g/L+琼脂4.0g/L，pH 5.8-6.0，培养条件同上，每瓶18个苗。对照培养基为：MS+BA 0.1mg/L+GA30.3mg/+IBA0.1mg/L+糖30g/L+琼脂4.0g/L，pH 5.8-6.0。培养40d调查相关数据。
表5壮苗培养基对树莓组培苗壮苗培养效果的影响
Figure BDA0003764270590000102
根据表5可以看出，在壮苗培养阶段，适宜的激素浓度能够促进组培苗生长，有利于后续生根培养时成活及生根。
实施例8
生根培养基对树莓组培苗壮苗培养效果的影响
经实施例7壮苗培养的组培苗苗高长至3-5cm时，将组培苗剪成单株苗，转入生根培养基上，生根培养基为1/2MS+IBA 0.5mg/L+糖15g/L+琼脂4.0g/L，pH 5.6-5.8，培养条件同上，每瓶15个苗。对照培养基为：1/2MS+IBA0.3mg/L+糖30g/L+琼脂4.0g/L，pH 5.8-6.0。培养40d调查相关数据。
表6生根培养基对树莓组培苗生根效果的影响
Figure BDA0003764270590000111
根据表6可以看出，在生根培养阶段，适宜的激素浓度能够促进组培苗生根，提升生根率，缩短生根时间，提升树莓组培繁殖效率，且生根质量好，利于后续移栽成活。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种树莓组织培养方法，包括外植体经过诱导培养、增殖培养、壮苗培养和生根培养，获得组培苗，其特征在于：
诱导培养基配方为MS+BA 0.8-1.2mg/L+GA30.3-0.8mg/L+IBA0.08-0.12mg/L+糖30-35g/L+琼脂4.0-4.5g/L，pH 5.8-6.0；
增殖培养基配方为MS+BA 0.3-0.8mg/L+GA30.3-0.6mg/L+IBA0.05-0.1mg/L+糖30-35g/L+琼脂4.0-4.5g/L，pH 5.8-6.0；
壮苗培养基配方为MS+BA 0.2-0.4mg/L+GA30.2-0.5mg/L+IBA0-0.1mg/L+糖15-30g/L+琼脂3.8-4.5g/L，pH 5.8-6.0；
生根培养基配方为1/2MS+IBA 0.2-0.5mg/L+糖15-20g/L+琼脂4.0-4.5g/L，pH 5.6-5.8。
2.根据权利要求1所述的树莓组织培养方法，其特征在于，所述外植体为带腋芽茎段，春季采集于新萌发半木质化枝条，秋季采集于刚停长封顶的枝条。
3.根据权利要求2所述的树莓组织培养方法，其特征在于，所述带腋芽茎段长度为1-2cm。
4.根据权利要求1所述的树莓组织培养方法，其特征在于，所述外植体经过消毒处理，包括流水冲洗2-3h，置超净工台上用75％的酒精消毒30s以上，无菌水荡洗2-3次，0.1％HgCl2消毒3-7min，无菌水荡洗4-5次。
5.根据权利要求1所述的树莓组织培养方法，其特征在于，所述组织培养过程中温度23-25℃，光照强度2000-3000lx，光照周期14h/10h，空气相对湿度60％-70％。
6.根据权利要求1所述的树莓组织培养方法，其特征在于，所述增殖培养阶段，当组培苗长至3-5cm时，将丛生芽分为3-5个芽为一堆转接，剪去多余的大叶，35-45d转接一次。
7.根据权利要求1所述的树莓组织培养方法，其特征在于，生根培养后用矿源黄腐酸钾2000-3000倍液+海藻素1500-2000倍液浸泡组培苗根部4-6min，移栽。
8.根据权利要求7所述的树莓组织培养方法，其特征在于，所述移栽基质由草炭土和沙土按体积比1-3:1组成。
9.根据权利要求7所述的树莓组织培养方法，其特征在于，所述移栽后扣小拱棚和遮阳网，棚内温度控制在白天22-27℃，夜间7-14℃，相对湿度80％-90％。
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