CN116602213A - 一种珠芽魔芋叶面球茎一步成苗的组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种珠芽魔芋叶面球茎一步成苗的组织培养方法，包括以下步骤：选用珠芽魔芋叶面球茎，消毒，备用；将叶面球茎的表面芽点朝上，接种于催芽‑芽诱导培养基中，在26～28℃、湿度60～70％及光照强度1200lx～1500lx下培养，光照培养时间为6～8小时；待芽生长到2～3cm时，调整培养温度为22～24℃、光照强度为2400lx～3000lx，并延长光照时间至12～14小时。本发明选用珠芽魔芋的整个叶面球茎作为外植体，在培养基添加GA3破除叶面球茎休眠，促使表面芽点萌动，KT诱导芽分化，实现一步成苗，培养过程无需转瓶转接，简化了现有技术的步骤，缩短了生产周期，降低了污染率和褐变率。
Description
技术领域
本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种珠芽魔芋叶面球茎一步成苗的组织培养方法。
背景技术
珠芽类魔芋源于热带雨林，适宜夏季高温高湿环境，生长势旺盛，产量高、抗逆性强，尤其是对软腐病、白绢病的抗性显著强于白魔芋和花魔芋，具有很好的推广应用价值。
目前，珠芽魔芋优质种芋供应不足且价格过高，传统的珠芽繁殖方式远远不能满足生产实际需求。而现有的珠芽魔芋的组织培养步骤繁琐，先要进行愈伤组织诱导，再诱导根芽分化，最后对芽进行继代培养成苗。整个生长周期较长，污染率高，成活率低，且切块的外植体极易发生褐变，导致工厂化生产成本高、风险大，进而不能大规模的工厂化推广应用。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明选用珠芽魔芋的叶面球茎作为外植体，直接诱导球茎表面芽点萌发，实现一步成苗，培养过程无需转瓶转接，简化了现有技术的步骤，缩短了生产周期，降低了污染率和褐变率。
本发明提供一种珠芽魔芋叶面球茎一步成苗的组织培养方法，包括以下步骤：
选用珠芽魔芋叶面球茎，消毒，备用；
将叶面球茎的表面芽点朝上，接种于催芽-芽诱导培养基中，在26～28℃、湿度60～70％及光照强度1200lx～1500lx下培养，光照培养时间为6～8小时；待芽生长到2～3cm时，调整培养温度为22～24℃、光照强度为2400lx～3000lx，并延长光照时间至12～14小时培养至成苗；所述催芽-芽诱导培养基由以下原料配制而成：MS+1.0～2.0mg/LKT+2.0～3.0mg/L GA3+5.8～6.0g/L琼脂+8～19g/L蔗糖，pH 6.2～6.5。
优选地，所述叶面球茎是取自5～8g、采收时间不超过10天的珠芽魔芋。
优选地，所述消毒是先用质量分数75％的酒精进行表面消毒60～90秒，无菌水冲洗3次，继续在紫外灯下消毒30～40min。
优选地，每株叶面球茎接种催芽-芽诱导培养基的体积为100～120mL。
对比现有技术，本发明的有益效果：
(1)本发明以叶面球茎直接作为外植体，相比用地下球茎，其携带病源菌量小，只需用75％的酒精进行表面消毒，避免了使用升汞带来的负面效果；外植体不做切块处理，褐变率和感染病菌的风险明显降低。外植体的消毒更加简单易行环保，有效解决了污染和褐变的问题。
(2)本发明在培养基中添加一定浓度的GA3用于打破休眠，KT促进芽分化，两者配合使用可刺激叶面球茎表面芽点快速萌发。同时，利用强-弱光和变温处理及环境条件控制，诱导叶面球茎一步成苗，培养过程无需转瓶转接，简化了现有组培繁琐的步骤，节约了生产成本。
(3)本发明提供的珠芽魔芋组培方法，10～15天可诱导出芽，40～50天左右可诱导成苗，明显缩短了珠芽魔芋组培的的生长周期。同时，不经过愈伤组织分化和多次继代处理，生产出的组培苗或组培芋性状相对稳定，变异率较低。
附图说明
图1是叶面球茎切块后褐变；
图2是叶面球茎切块后真菌污染；
图3是叶面球茎切块后形成的愈伤组织；
图4是叶面球茎接种后形成的芽。
具体实施方式
下面结合具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
在本发明的描述中，如未特殊说明，所用试剂及原料均为市售，所用方法均为本领域常规技术。
实施例1
一种珠芽魔芋叶面球茎一步成苗的组织培养方法，包括以下步骤：
(1)叶面球茎的选择与处理
选用5～8g的珠芽魔芋叶面球茎，采收时间不超过10天。用自来水清洗干净，用质量分数75％的酒精进行表面消毒90秒，用无菌水冲洗3次。放入超净工作台，打开紫外灯消毒30分钟，待表皮晾干后可用；
(2)叶面球茎表面芽的诱导
将叶面球茎的表面芽点朝上，接种于催芽-芽诱导培养中培养。培养基配方为MS+1.0mg/L KT+3.0mg/L GA3+5.8g/L琼脂+8g/L蔗糖，pH 6.2。每瓶添加100ml培养基，保证充足的养分以达到一步成苗的目的；培养基中的GA3主要是起到诱导叶面球茎表面芽点萌发、打破休眠的作用。KT主要是促进芽分化。其中GA3不能高压灭菌，因此需要细菌滤器加入培养基；
(3)培养环境条件控制
接种后，室内培养温度26℃，光照强度1200lx，光照时间6小时，空气湿度70％。待芽生长到2～3cm左右时，增加光照强度2400lx，延长光照时间12小时，降低培养温度22℃，防止徒长或白化苗，至培养成苗。
实施例2
一种珠芽魔芋叶面球茎一步成苗的组织培养方法，包括以下步骤：
(1)叶面球茎的选择与处理
选用5～8g的珠芽魔芋叶面球茎，采收时间不超过10天。用自来水清洗干净，用质量分数75％的酒精进行表面消毒60秒，用无菌水冲洗3次。放入超净工作台，打开紫外灯消毒40分钟，待表皮晾干后可用；
(2)叶面球茎表面芽的诱导
将叶面球茎的表面芽点朝上，接种于催芽-芽诱导培养中培养。培养基配方为MS+1.5mg/L KT+2.0mg/L GA3+5.8g/L琼脂+8g/L蔗糖，pH 6.5。每瓶添加100ml培养基，保证充足的养分；
(3)培养环境条件控制
接种后，室内培养温度28℃，光照强度1200lx，光照时间6小时，空气湿度60％。待芽生长到2～3cm左右时，增加光照强度2400lx，延长光照时间12小时，降低培养温度24℃，防止徒长或白化苗，至培养成苗。
实施例3
一种珠芽魔芋叶面球茎一步成苗的组织培养方法，包括以下步骤：
(1)叶面球茎的选择与处理
选用5～8g的珠芽魔芋叶面球茎，采收时间不超过10天。用自来水清洗干净，用质量分数75％的酒精进行表面消毒90秒，用无菌水冲洗3次。放入超净工作台，打开紫外灯消毒30分钟，待表皮晾干后可用；
(2)叶面球茎表面芽的诱导
将叶面球茎的表面芽点朝上，接种于催芽-芽诱导培养中培养。培养基配方为MS+2.0mg/L KT+3.0mg/L GA3+6.0g/L琼脂+19g/L蔗糖，pH 6.3。每瓶添加120ml培养基，保证充足的养分；
(3)培养环境条件控制
接种后，室内培养温度28℃，光照强度1200lx，光照时间6小时，空气湿度70％。待芽生长到2～3cm左右时，增加光照强度2400lx，延长光照时间12小时，降低培养温度22℃，防止徒长或白化苗，至培养成苗。
实施例4
一种珠芽魔芋叶面球茎一步成苗的组织培养方法，包括以下步骤：
(1)叶面球茎的选择与处理
选用5～8g的珠芽魔芋叶面球茎，采收时间不超过10天。用自来水清洗干净，用质量分数75％的酒精进行表面消毒60秒，用无菌水冲洗3次。放入超净工作台，打开紫外灯消毒30分钟，待表皮晾干后可用；
(2)叶面球茎表面芽的诱导
将叶面球茎的表面芽点朝上，接种于催芽-芽诱导培养中培养。培养基配方为MS+1.0mg/L KT+2.0mg/L GA3+5.8g/L琼脂+8g/L蔗糖，pH 6.2。每瓶添加120ml培养基，保证充足的养分；
(3)培养环境条件控制
接种后，室内培养温度26℃，光照强度1200lx，光照时间6小时，空气湿度60％。待芽生长到2～3cm左右时，增加光照强度2400lx，延长光照时间12小时，降低培养温度24℃，防止徒长或白化苗，至培养成苗。
实施例5
一种珠芽魔芋叶面球茎一步成苗的组织培养方法，包括以下步骤：
(1)叶面球茎的选择与处理
选用5～8g的珠芽魔芋叶面球茎，采收时间不超过10天。用自来水清洗干净，用质量分数75％的酒精进行表面消毒60秒，用无菌水冲洗3次。放入超净工作台，打开紫外灯消毒30分钟，待表皮晾干后可用；
(2)叶面球茎表面芽的诱导
将叶面球茎的表面芽点朝上，接种于催芽-芽诱导培养中培养。培养基配方为MS+1.0mg/L KT+2.0mg/L GA3+5.8g/L琼脂+8g/L蔗糖，pH 6.2。每瓶添加120ml培养基，保证充足的养分；
(3)培养环境条件控制
接种后，室内培养温度27℃，光照强度1500lx，光照时间8小时，空气湿度65％。待芽生长到2～3cm左右时，增加光照强度3000lx，延长光照时间14小时，降低培养温度23℃，防止徒长或白化苗，至培养成苗。
对比例1
一种珠芽魔芋组织培养方法，与实施例1不同仅在于：以地下球茎切块为外植体。
对比例2
一种珠芽魔芋组织培养方法，与实施例1不同仅在于：以叶面球茎切块为外植体。
分别按照实施例1(由于实施例1～5污染及褐变的情况基本相同，故以下仅以实施例1为例进行效果说明)及对比例1、2提供的方法进行组培，统计不同方法接种后污染数及褐变数，并计算污染率及褐变率。结果见表1。
表1不同外植体接种后污染率和褐变率统计
由表1可知，利用珠芽魔芋地下球茎作为外植体，污染率和褐变率明显高于叶面球茎作为外植体。而叶面球茎直接作为外植体接种，其污染率和褐变率明显低于叶面球茎切块后培养(图1～4)。
此外，由图3可知，叶面球茎切块培养易形成愈伤组织，还需进行芽分化诱导，而接种叶面球茎可直接诱导表面芽点萌发(见图4)，缩短培养周期。结果如表2所示。
表2各组出芽时间及成苗时间(天)
| 分组 | 出芽时间(天) | 成苗时间(天) |
| 实施例1 | 10 | 50 |
| 实施例2 | 12 | 47 |
| 实施例3 | 13 | 43 |
| 实施例4 | 15 | 52 |
| 实施例5 | 11 | 43 |
| 对比例1 | 32 | 77 |
| 对比例2 | 30 | 81 |
注：成苗时间包括出芽时间。
本发明在研究过程中发现，培养基中激素浓度的添加量及GA3的使用方法也对叶面球茎不定芽分化和成苗的周期影响较大，具体研究结果如表3～4所示。
对比例3
一种珠芽魔芋组织培养方法，与实施例1不同仅在于：将叶面球茎的表面芽点朝上，在3.0mg/L GA3溶液中浸泡60分钟，然后接种于芽诱导培养，培养基配方为MS+1.0mg/LKT+5.8g/L琼脂+8g/L蔗糖，pH 6.2。接种后，室内培养温度26℃，光照强度1200lx，光照时间6小时，空气湿度70％。待芽生长到2～3cm左右时，增加光照强度2400lx，延长光照时间12小时，降低培养温度22℃，防止徒长或白化苗，至培养成苗。
表3各组出芽时间及成苗时间(天)
| 分组 | 出芽时间(天) | 成苗时间(天) |
| 实施例1 | 10 | 50 |
| 对比例3 | 32 | 67 |
由表3可知，相较于在GA3溶液中浸泡种芋，本发明将GA3添加在培养基中珠芽魔芋的生长周期更短。这是因为添加在培养基中的GA3能够在一段时间内持续发挥作用，从而缩短生长周期。
表4不同激素浓度配比对叶面球茎不定芽分化的影响
注：表4中不同编号对应组培方法的其余培养条件均与实施例1相同。
本发明在研究过程中发现，培养基中的激素浓度添加量对芽分化影响较大，当KT或者GA3的浓度过大或者过小时，无论怎么调节另一种激素的浓度仍具有明显的抑制作用。结合表4可知，当KT浓度0.5和3.0时，对芽分化有明显的抑制作用；当GA3为4.0时，对芽分化产生一定的抑制。而KT和GA3的配比对芽分化的影响也差异显著。其中当KT和GA3浓度配比为1.0mg/L和3.0mg/L、1.5mg/L和2.0mg/L、2.0mg/L和3.0mg/L时，芽分化率较高，分别为86％、88％和88％，有效芽数分为21个、23个和19个。
由表4还可知，激素之间的配比对珠芽魔芋的生长周期有一定影响，当其中一个激素浓度过大时，对芽分化产生明显的抑制，导致生长周期也有延长的趋势。同时，考虑到出芽速度及芽分化率，本发明将培养基配方确定为MS+1.0～2.0mg/LKT+2.0～3.0mg/L GA3+5.8～6.0g/L琼脂+8～19g/L蔗糖，pH 6.2～6.5。
以上公开的仅为本发明的几个具体实施例，但是，本发明实施例并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种珠芽魔芋叶面球茎一步成苗的组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
选用珠芽魔芋叶面球茎，消毒，备用；
将叶面球茎的表面芽点朝上，接种于催芽-芽诱导培养基中，在26～28℃、湿度60～70％及光照强度1200lx～1500lx下培养，光照培养时间为6～8小时；待芽生长到2～3cm时，调整培养温度为22～24℃、光照强度为2400lx～3000lx，并延长光照时间至12～14小时培养至成苗；所述催芽-芽诱导培养基由以下原料配制而成：MS+1.0～2.0mg/LKT+2.0～3.0mg/LGA3+5.8～6.0g/L琼脂+8～19g/L蔗糖，pH6.2～6.5。
2.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，所述叶面球茎是取自5～8g、采收时间不超过10天的珠芽魔芋。
3.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，所述消毒是先用质量分数75％的酒精进行表面消毒60～90秒，无菌水冲洗3次，继续在紫外灯下消毒30～40min。
4.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，每株叶面球茎接种催芽-芽诱导培养基的体积为100～120mL。
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