CN110476816A

CN110476816A - 一种快速获得葡萄桐幼苗的方法

Info

Publication number: CN110476816A
Application number: CN201910929698.8A
Authority: CN
Inventors: 罗克明; 张烩涓; 秦士飞; 黄艳
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2019-09-29
Filing date: 2019-09-29
Publication date: 2019-11-22
Anticipated expiration: 2039-09-29
Also published as: CN110476816B

Abstract

一种快速获得葡萄桐幼苗的方法，包括外植体选择和消毒、初代诱导、继代增殖和生根培养四个步骤，其采用特殊的初代诱导方式，使得初代诱导的增殖系数可达3.49；然后配合特定的增殖培养条件，使增殖培养的增殖系数可达8.66；最后配合适宜的条件，使生根培养的生根率达80％、平均根数5.17、平均根长达4.22，本发明方法的初代诱导、增殖培养和生根培养过程共110天左右，即通过110天左右，即通过一颗温室幼苗获得24.18颗左右葡萄桐幼苗。

Description

一种快速获得葡萄桐幼苗的方法

技术领域

本发明涉及植物快速繁殖技术领域，具体涉及一种快速获得葡萄桐幼苗的方法。

背景技术

油桐(Vernicia fordii)属大戟科(Euphorbiaceae)油桐属(Vernicia L.)落叶乔木，喜光、喜温暖、不耐严寒。我国的油桐资源主要有三年桐(Vernicia fordii)和千年桐(Vernicia montana)两种，三年桐又名光桐，千年桐又名皱桐。我们平常所说的油桐，广义上是油桐属植物的统称，包括三年桐、千年桐和日本油桐(Vernicia cordata)；狭义上的油桐是指三年桐(谭晓风，油桐的生产现状及其发展建议[J].经济林研究,2006,24(3):62-64.)。油桐是我国传统的大宗出口商品，具有重要的工业价值、能源价值、一定的药用价值及生态价值。桐油是重要的工业原料，随着能源问题的不断加剧，桐油被选为生物柴油的生产原料，因此具有广阔的市场前景(谭晓风，蒋桂雄，谭方友等。我国油桐产业化发展战略调查研究报告[J].经济林研究,2011,29(03):1-7；张玲玲，彭俊华，油桐资源价值及其开发利用前景[J].经济林研究,2011,29(02):130-136)。

葡萄桐是湖南省泸溪县一个优良的农家品种，属小米桐品种群，是典型的三年桐。它具有盛果期早，结实丛生性强、果大、皮薄、产量高等优点。葡萄桐主要分布于泸溪县一带，课题组2012年成功引种葡萄桐，在重庆地区取得了良好的栽培效果，其果实优良性状也得到了保持，说明葡萄桐可以在重庆地区进行大量种植。

目前，油桐的繁殖栽培手段主要采取传统的种子萌发实生苗和嫁接繁殖方法，扦插繁殖较为少见。其中，油桐种子萌发率较低，主要是由于种子具有初生休眠性(康明,彭幼芬.赤霉素对油桐种子发芽的生理效应[J].中南林业科技大学学报,1986,2:121-127.)，另外，种子萌发实生苗还存在发芽期长、出苗不整齐、生长势差等问题；嫁接繁殖也存在诸多问题：(1)需要接穗和砧木具有一定的亲和性；(2)接穗应随采随嫁接，不可长距离运输，地域易成为限制因素；(3)油桐嫁接一般选择在春季的3月中、下旬和秋季的8月份进行，具有一定的时间限制。

相较于传统的种子萌发实生苗和嫁接繁殖方法，组织培养和非试管快繁技术不仅可以缩短育种周期、不受外界条件限制，还可经脱毒从而获得大量无菌幼苗，因此是较为先进的育苗方式，但当其运用于油桐时，而其仍然存在有效芽增殖系数低，繁殖周期长的问题。

发明内容

为解决上述问题，提供一种快速获得具有稳定优良性状的葡萄桐幼苗的方法。所述方法能够在110天左右获得葡萄桐幼苗，且具可持续育苗。

本发明的技术方案如下：

一种快速获得葡萄桐幼苗的方法，包括以下步骤：

(1)取温室萌发的葡萄桐幼苗的上胚轴，消毒，得外植体；

(2)将所述外植体进行初代诱导培养，得丛生幼芽，所述初代诱导培养的条件是：培养温度为25～30℃，光照强度为2500～3000lx，光照时间为14-16h/d；所述初代诱导培养依次分为初代诱导培养I和初代诱导培养II，初代诱导培养I是在添加有2.0mg/L细胞分裂素6-BA、0.1mg/L生长素IBA和80mg/L Vc的MS培养基中培养8～10d；初代诱导培养II是在添加有1.5mg/L细胞分裂素6-BA、0.01mg/L生长素IBA和80mg/L Vc的MS培养基中培养18～22d；

(3)将所述丛生幼芽切成单芽，置于增殖培养基中增殖培养，得增殖幼芽(单生或丛生)，所述增殖培养的条件是：培养温度25-30℃，光照强度2500-3000lx，光照时间14-16h/d，所述增殖培养基是添加有细胞分裂素6～BA和生长素IBA的MS培养基；

(4)将增殖幼芽切成增殖单芽，将大于1cm的增殖单芽置于生根培养基中生根培养，得葡萄桐幼苗，所述生根培养的条件是：培养温度25-30℃，光照强度2500-3000lx，光照时间14-16h/d，所述生根培养基是添加有生长素IBA的1/2MS培养基。

优选的，所述步骤(4)还包括：将小于1cm的增殖单芽置于步骤(3)的增殖培养基中，重复培养，然后进入步骤(4)。

优选的，步骤(1)中，所述消毒的消毒剂方式为：采用75％乙醇消毒30s，然后采用0.1％HgCl₂消毒10min。

优选的，步骤(3)中，所述增殖培养时间为55～65d。

优选的，步骤(4)中，所述生根培养的时间为15～20d。

优选的，步骤(3)中，所述增殖培养基中细胞分裂素6-BA的浓度为1.5mg/L。

优选的，步骤(3)中，所述增殖培养基中生长素IBA的浓度为0.01mg/L。

优选的，步骤(4)中，所述生根培养基中生长素的IBA的浓度为0.5mg/L。

本发明所述细胞分裂素6-BA是6-苄氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine)；本发明所述生长素IBA是吲哚丁酸(Indole-3-Butyric Acid)。

本发明MS培养基(每升)包括：硝酸钾(KNO₃；1900mg)、磷酸二氢钾(KH₂PO₄；170mg)、氯化钙(CaCl₂；440mg)、硼酸(H₃BO₃；6.2mg)、硫酸锌(ZnSO₄；8.6mg)、硫酸铜(CuSO₄；0.025mg)、乙二胺四乙酸二钠(Na₂-EDTA；37.3mg)、硫酸亚铁(FeSO₄；27.8mg)、甘氨酸(2mg)、盐酸吡哆醇(VB₆；0.5mg)、硝酸铵(NH₄NO₃；1650mg)、硫酸镁(MgSO₄；370mg)、碘化钾(KI；0.83mg)、硫酸锰(MnSO₄；22.3mg)、钼酸钠(NaMoO₄；0.25mg)、氯化钴(CoCl₂；0.025mg)、盐酸硫胺素(VB₁；0.1mg)、烟酸(VB₅；0.5mg)、肌醇(100mg)等。

本发明的有益效果在于：

1.本发明方法中，采用特殊的初代诱导方式，使得初代诱导的增殖系数可达3.49；然后配合特定的增殖培养条件，使增殖培养的增殖系数可达8.66；最后配合适宜的条件，使生根培养的生根率达80％、平均根数5.17、平均根长达4.22，本发明方法的初代诱导、增殖培养和生根培养过程共110天左右，即通过110天左右，即通过一颗温室幼苗获得24.18(3.49×8.66×0.8)颗左右无菌葡萄桐幼苗；

2.本发明方法的步骤(4)中，将小于1cm增殖单芽置于增殖培养基中重复培养，继续增殖，具有持续育苗的能力；

3.本发明方法不受地域和季节的限制，可随时随地进行培养；且保持葡萄桐优良株系基因型和表现型，使获得的无菌幼苗能具有葡萄桐亲本的优良性状，保持了葡萄桐结实丛生性强、果大、皮薄、产量高等优点；采用获得的无菌幼苗可大量用于重庆地区造林，其他地区可先进行引种试验，试验成功的地区也可大量使用此发明所获得的葡萄桐幼苗进行造林。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明进行进一步的说明。

以下实施例所用材料与试剂若无特殊说明，即可通过常规市售渠道获得。以下实施例采用的MS培养基粉末为百思(basebio)；产品编号：BS 1061，配置时取4.74g粉末溶于1L水中，配制成MS培养基。

实施例1

(1)外植体的选择及消毒：葡萄桐种子温室萌发后，突破种皮，即可形成弓形苗；继续生长，子叶与胚乳将发生脱离，然后逐渐伸直，真叶展开形成直苗，形成直苗之后取用上胚轴，将上胚轴按照75％乙醇消毒30s，0.1％HgCl₂消毒10min的方式消毒，得外植体。

(2)初代诱导：将外植体在培养温度25-30℃，光照强度2500-3000lx，光照时间16h/d下培养25-35天得到丛生幼芽。初代诱导可分两步进行：首先在MS+2.0mg/L 6-BA+0.1mg/L IBA+80mg/L Vc中光照培养10天，使诱导率达到81.48％；然后在超净工作台上将其放入MS+1.5mg/L 6-BA+0.01mg/L IBA+80mg/L Vc中光照培养20天，共获得幼芽94.33个，初代诱导的增殖系数可达到3.49。

(3)继代增殖：将丛生幼芽切成单芽(或小块)在培养温度25-30℃，光照强度2500-3000lx，光照时间16h/d下培养60天(30天换一次培养基)，得增殖幼芽；增殖培养基是MS培养基+1.5mg/L细胞分裂素(6-BA)+0.01mg/L生长素(IBA)。增殖的不定芽增殖系数最高达8.66，增殖较明显。

(4)生根培养：将上述增殖幼芽切为增殖单芽，将1cm以上的增殖单芽在培养温度25-30℃，光照强度2500-3000lx，光照时间16h/d下进行生根培养，培育20天，得幼苗。生根培养基是1/2MS培养基+0.5mg/L生长素(IBA)；将小于1cm的增殖单芽继续进行继代增殖。生根培养中的幼芽生根率达80％、平均根数达5.17、平均根长达4.22。

将上述幼苗进行炼苗和移栽。先将瓶盖拧松炼苗3d，再将瓶盖打开炼苗2d，最后将根上的琼脂洗净后移栽于0.1％高锰酸钾溶液消毒的混合基质中(珍珠岩：腐殖土：蛭石＝1：2：1)，浇透水，保鲜膜覆盖(留小孔)，光照培养，一周后揭膜。当葡萄桐优良株系幼苗长至20cm以上高度时，移栽至苗圃基地进行培育。当苗圃基地的葡萄桐幼苗长至1m高度时，进行油桐示范林造林。

为进一步研究本发明，发明人对四个步骤的效果分别进行了研究。

外植体的选择和消毒处理：

按照表1的内容对外植体进行选择和消毒。处理1～6的外植体为野外当年生嫩枝，处理7～12为温室萌发幼苗的上胚轴；将外植体用75％乙醇消毒30s、无菌水清洗2次，然后按表1所示的消毒剂处理相应的时间。消毒处理后接种于初代诱导培养基(初代诱导培养基配方与实施例1中相同)中，两周后统计污染率和存活率，每处理27个外植体，试验重复3次，结果见表1。

表1不同消毒处理对葡萄桐外植体的影响

注：表中所列数据为平均数±标准差；不同小写字母表示P<0.05差异显著水平。

结果显示：本发明方法中以温室萌发幼苗的上胚轴为外植体，75％乙醇浸泡30s，0.1％HgCl₂消毒10min的消毒效果最佳，污染率低至17.28％，存活率高达69.14％。

初代诱导：

其外植体的选择和消毒步骤与实施例1的对应内容相同，然后吸干经消毒处理后上胚轴表面的水分，按照自然生长的方向分别移入表2的各初代诱导培养基中，在培养温度25℃，光照强度3000lx，光照时间为16h/d条件下培养30天，统计幼芽诱导率、总芽数、产生愈伤组织情况、产生玻璃化现象及芽生长情况，每个处理27个外植体，实验重复3次，结果见表2。

表2不同6-BA、IBA激素浓度配比对葡萄桐顶芽初代诱导的影响

注：表中所列数据为平均数±标准差；不同小写字母表示P<0.05差异显著水平；A、所接种的27个外植体30天后所产生总芽数：大于80(++++)；60-80(+++)；40-60(++)；小于40(+)；B、出现愈伤的情况：多(+++)；较多(++)；较少(+)；无(—)；C、出现玻璃化的情况：多(+++)；较多(++)；较少(+)；无(—)。

结果表明，6-BA与IBA的合理使用有利于葡萄桐幼芽的初代诱导，MS+2.0mg/L 6-BA+0.1mg/L IBA诱导率最高，为95.56％，但存在大量愈伤和严重玻璃化，最终产生总芽数为64.67个；当MS+1.5mg/L 6-BA+0.01mg/L IBA总芽数最多，为91.03个，即初代诱导所产生的腋芽增殖倍数可达到3.37，但诱导率仅为66.51％。发明人进一步结合两个处理条件，首先在MS+2.0mg/L 6-BA+0.1mg/L IBA条件下培养10天左右，外植体的诱导率为81.48％；之后将外植体移入MS+1.5mg/L 6-BA+0.01mg/L IBA下20天后，则27个外植体所获得总芽数为94.33，增殖系数为3.49，，同时也有效避免了大量愈伤和严重玻璃化的存在。

继代增殖：

其外植体的选择和消毒、初代诱导培养步骤与实施例1对应的步骤相同；然后将得到的丛生芽切成单芽(或小块)置于表3的各增殖培养基中，并按表2的培育条件培养60天后(30天换接一次)，统计增殖倍数、产生愈伤组织情况、产生玻璃化现象及芽生长情况，每个处理15个芽，试验重复3次，结果见表3。

表3不同激素组合对诱导芽继代增殖的影响

注：表中所列数据为平均数±标准差；不同小写字母表示P<0.05差异显著水平；A、不定芽增殖倍数：大于8(++++)；6-8(+++)；4-6(++)；小于4(+)；B、出现愈伤的情况：多(+++)；较多(++)；较少(+)；无(—)；C、出现玻璃化的情况：多(+++)；较多(++)；较少(+)；无(—)。

结果显示：在MS+1.5mg/L 6-BA+0.01mg/L IBA增殖培养基中，培养60天的增殖系数高达8.66，增殖最明显；叶片有部分玻璃化情况，但不影响后续生根则影响不大。

生根培养：

其外植体的选择和消毒步骤、初代诱导以及继代增殖与实施例1的对应内容相同，将得到的增殖幼芽切为增殖单芽，并将大于1cm的增殖单芽移至表4所示添加生长素的1/2MS或MS生根培养基中，并按表2的培育条件诱导生根，培育20天后，统计生根率、平均根数、平均根长及生长情况，每瓶接种15株，试验重复3次，结果见表4。

表4不同基本培养基和IBA浓度对葡萄桐组培苗生根的影响

结果显示：1/2MS+0.5mg/L IBA最适合葡萄桐组培苗生根，生根率达80.00％，平均根数达到5.17，平均根长达4.22，根粗壮。

Claims

1.一种快速获得葡萄桐幼苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取温室萌发的葡萄桐幼苗的上胚轴，消毒，得外植体；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)还包括：将小于1cm的增殖单芽置于步骤(3)的增殖培养基中，重复培养，然后进入步骤(4)。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述消毒的消毒剂方式为：采用75％乙醇消毒30s，然后采用0.1％HgCl₂消毒10min。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述增殖培养时间为55～65d。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述生根培养的时间为15～20d。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述增殖培养基中细胞分裂素6-BA的浓度为1.5mg/L。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述增殖培养基中生长素IBA的浓度为0.01mg/L。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述生根培养基中生长素的IBA的浓度为0.5mg/L。