CN103385168A - 一种油桐叶片再生植株的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种油桐叶片再生植株的方法，属于油桐的快繁技术领域。主要通过油桐叶片直接诱导不定芽、继代培养、增殖培养、壮苗培养、生根培养、炼苗移栽等过程，不仅为快速繁殖优良油桐植株提供了一条途径，而且为以后通过基因工程的方法改良油桐的抗性、提高油桐产量及油质质量等性状，以及为油桐遗传体系的建立打下坚实的基础。

Description

一种油桐叶片再生植株的方法
技术领域
本发明属于油桐的快繁技术领域，具体涉及一种油桐叶片再生植株的方法。 
背景技术
油桐(Vernicia fordii)属大戟科(euphorbiaceae)油桐属(Vernicia)落叶乔木，是中国特有的经济树种，与油茶、核桃、乌桕并称我国四大木本油料树种。油桐种子含油率达50%-70%，其中约94%为不饱和脂肪酸，从油桐中提炼的桐油是一种可替代传统柴油的优质干性油，在原油日趋减少和环保压力加重的今天，油桐成为了优良的生物能源树种，桐油是一种抗冷热、防潮、防锈、防腐蚀的优良涂料，也是合成新型复合材料的基本原料，具有广泛的用途。近年来，随着能源缺乏和桐油加工综合利用技术的提高，发展油桐产业已迫在眉睫，油桐有可能成为替代生物能源的最有潜力的树种，油桐的种质资源保护、良种选育以及高产栽培技术受到了关注。 
油桐种苗繁育主要采用播种育苗及嫁接育苗，播种育苗后代分化严重，难以保持母本的优良性状，产量高低不一。嫁接育苗虽然能保持母本的优良性状，但是成活率较低以及受良种穗条的限制等不能大规模育苗。组织培养是快速繁殖优良植物品种的一条重要途径。目前，关于油桐组织培养的研究很少，张珊珊等通过对油桐种胚培养建立了油桐种胚无菌苗，李建安等人通过油桐叶片诱导了愈伤组织，但并未诱导出不定芽。关于木本植物通过叶片培育再生植株一直是林业科研人员在组培上的一个难题，油桐通过叶片直接诱导出不定芽再生植株的方式迄今尚未报道。本发明主要通过油桐叶片直接诱导不定芽，继代培养、增殖培养、壮苗培养、生根培养及炼苗移栽等过程，不仅为快速繁殖优良油桐植株提供了一条新的途径，而且为以后在基因工程领域通过叶盘法转基因来改良油桐的抗性、提高油桐产量及油质质量等性状打下坚实的基础。 
发明内容
本发明的目的是针对目前油桐采用叶盘法直接诱导不定芽再生植株技术领域中的缺失，提供一种油桐叶片再生植株的方法；该方法利用油桐无菌苗叶片直接诱导出不定芽，其诱导率高，不定芽继代增殖系数高，壮苗效果好，生根率高。 
本发明的目的是通过以下方式实现的。 
一种油桐叶片再生植株的方法，包括以下步骤： 
将油桐无菌苗叶片，在无菌条件下切成面积为0.5-1cm2的叶盘，接种到1/2MS+1.0-3.0mg/L6-BA+0.05-0.1mg/L IAA+0.05-0.1mg/L IBA的培养基中诱导不定芽，暗培养3-5天后，在光照条件下培养20-30天，培养温度为26士1℃，光照强度为1800-2000lx，光照时间14-16h/d；然后经过继代、增殖、壮苗和生根培养获得完整植株；最后进行炼苗、移栽。 
上述方法中继代培养的具体过程如下：将叶盘诱导的不定芽切下接种到1/2MS+1.0-3.0mg/L6-BA+0.05-0.1mg/L IBA的培养基中进行不定芽的继代培养，暗培养1-3天后，在光照条件下培养15-25天；培养温度为26士1℃，光照强度为1800-2000lx，光照时间14-16h/d。 
上述方法中增殖培养的具体过程如下：将继代培养得到的不定芽切下接种到MS+2.0-3.0mg/L6-BA+0.05-0.1mg/L IBA的培养基中进行不定芽的增殖培养，暗培养1-3天后，在光照条件下培养25-30天；培养温度为26士1℃，光照强度为1800-2000lx，光照时间14-16h/d。 
上述方法中壮苗培养的具体过程如下：将增殖培养得到的芽转接到MS+0.3-1.0mg/L6-BA+0.5-1.0mg/L NAA的培养基中进行壮苗培养，暗培养1-3天后，在光照条件下培养20-25天；培养温度为26士1℃，光照强度为1800-2000lx，光照时间14-16h/d。 
上述方法中生根培养的具体过程如下：将增殖培养获得2-4cm的苗接到1/2MS+0.05-0.3mg/LIBA的培养基中进行生根培养；培养温度为26士1℃；暗培养5-7天，再转到光照下培养5-8天生根，光照强度为1800-2000lx，光照时间14-16h/d。 
上述方法中炼苗、移栽的具体过程如下： 
将生根后的苗先在室内进行移栽前炼苗，3-5天后从培养瓶中取出，洗净根部培养基，移栽到营养杯中，基质为泥炭土：珍珠岩：蛭石=2:1:1，组培苗移栽后保持湿度不低于80%，覆盖薄膜并每天喷水1-2次，两周后即可逐步进行正常管理。 
上述方法中： 
叶盘诱导不定芽使用的培养基优选为：1/2MS+2.0-3.0mg/L6-BA+0.05-0.1mg/LIAA+0.05-0.1mg/L IBA； 
增殖培养使用的培养基优选为：MS+3.0mg/L6-BA+0.05-0.1mg/L IBA； 
壮苗培养使用的培养基优选为：MS+0.5mg/L6-BA+0.5-1.0mg/L NAA； 
生根培养使用的培养基优选为：1/2MS+0.05-0.1mg/L IBA。 
上述方法中油桐无菌苗的获得过程如下： 
选取成熟的油桐当年生种子，取其种皮，将种仁用自来水冲洗3-5min，然后浸泡20-30h，中间换水2-3次，然后在超净工作台中用0.1%的HgCl2消毒3-5min，用无菌水冲洗4-6次，接种在1/2MS基本培养基中，暗培养2-3天，再转到光照条件下培养15-20天即可成苗；培养温度为26士1℃，光照强度为1800-2000lx，光照时间14-16h/d。 
上述方法中用到的培养基均附加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH调至5.4-5.8。 
本发明主要过程包括：油桐叶片直接诱导不定芽，通过继代培养、增殖培养、壮苗培养、生根培养、炼苗及移栽。该方法不定芽诱导率高，不定芽继代增殖系数高，壮苗效果好，生根率高；不仅为快速繁殖大量优良油桐植株提供了一条新的技术途径，而且为以后通过基因工程的方法改良油桐抗性、提高油桐产量及油质质量等性状，以及为油桐遗传体系的建立打下基础。这为油桐从传统的育种方式向分子育种方向迈进提供了可行性，为以后缓解生物能源短缺方面有着重要意义。 
附图说明
图1为本发明油桐无菌苗叶片诱导的不定芽的照片； 
图2为本发明油桐无菌苗叶片诱导的不定芽的照片； 
图3为本发明油桐无菌苗叶片诱导的不定芽的照片； 
图4为本发明油桐无菌苗叶片诱导的不定芽的照片； 
图5为本发明不定芽继代培养的照片； 
图6为本发明不定芽继代培养的照片； 
图7为本发明不定芽继代培养的照片； 
图8为本发明不定芽继代培养的照片； 
图9为本发明不定芽增殖培养的照片； 
图10为本发明不定芽增殖培养的照片； 
图11为本发明不定芽壮苗培养的照片； 
图12为本发明不定芽壮苗培养的照片； 
图13为本发明不定芽生根培养的照片； 
图14为本发明不定芽生根培养的照片； 
图15为本发明不定芽生根培养的照片； 
图16为本发明不定芽生根培养的照片； 
图17为本发明生根后移栽的组培苗的照片； 
图18为本发明移栽后成活的组培苗的照片。 
具体实施方式
以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。 
实施例1 
依次进行以下操作： 
1、选取成熟的油桐当年生种子，取其种皮，将种仁用自来水冲洗3-5min，然后浸泡20-30h，中间可以换水2-3次，然后在超净工作台中用0.1%的HgCl2的消毒3-5min，用无菌水冲洗4-6次，接种在1/2MS基本培养基中，暗培养2-3天，再转到光照条件下培养15-20天即可成苗，成苗率可达91%。附加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.4-5.8；培养温度为26士1℃，光照强度为1800-2000lx，光照14-16h/d； 
表1不同消毒处理方式对油桐种胚的消毒效果影响 
75%酒精 0.1%升汞 污染率 褐化率
0 2 27.69 0
0 3 3.22 0
0 4 3.13 0
0 5 2.98 1.23
10 3 3.01 4.98
10 5 0 46
20 5 0 56
30 5 0 65
2、选取油桐试管无菌苗叶片，在无菌条件下切成面积为0.5-1cm2的叶盘，接种在培养基为1/2MS培养基+1.0-3.0mg/L6-BA+0.05-0.1mg/L IAA+0.05-0.1mg/L IBA诱导不定芽，先暗培养3-5天，再到光照条件下培养20-30天，最高诱导率可达86.36%。附加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.5。培养温度为(26士1)℃，光照强度为1800-2000lx，光照14-16h/d；（见附图1-4） 
表2不同激素配比对油桐叶片不定芽诱导的效果影响 
3、将诱导的不定芽切下接种到1/2MS培养基+1.0-3.0mg/L6-BA+0.05-0.1mg/L IBA中进行不定芽的继代培养，暗培养1-3天，再到光照条件下培养15-25天，附加蔗糖30g/L,琼脂7g/L，pH5.4-5.8；培养温度为26士1℃，光照强度为1800-2000lx，光照14-16h/d；（见附图5-8） 
4、将不定芽进行增殖培养，将继代的不定芽切下接种在MS培养基+2.0-3.0mg/L6-BA+0.05-0.1mg/L IBA进行不定芽的增殖培养，暗培养1-3天，再转到光照条件下培养25-30天，最高增值系数为6.5。附加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.5。培养温度为(26士1)℃，光照强度为1800-2000lx，光照14-16h/d；（见附图9-10） 
表3不同激素配比对油桐不定芽增殖系数的影响 
Figure BDA00003443689200061
5、将增殖的芽进行壮苗培养，将增殖的芽转接到MS培养基+0.3-1.0mg/L6-BA+0.5-1.0mg/L NAA进行壮苗培养，暗培养1-3天，再转到光照条件下培养20-25天，苗高为3-5cm，苗粗为0.2-0.4cm。附加蔗糖30g/L,琼脂7g/L，pH5.5，培养温度为(26士1)℃，光照强度为1800-2000lx，光照14-16h/d；（见附图11-12） 
表4不同激素配比对油桐不定芽壮苗的影响 
Figure BDA00003443689200071
6、待试管苗长到2-4cm时接到生根培养基1/2MS+0.05-0.3mg/L IBA，附加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.5。培养温度为(26士1)℃，光照强度为1800-2000lx，光照14-16h/d。暗处理5-7天再转到光照下培养，光照培养下一周左右就会生根，生根率92%以上。（见附图13-16） 
表5不同激素配比对油桐试管苗生根的影响 
Figure BDA00003443689200081
7、将生根后的试管苗先在室内进行移栽前炼苗，约3-5天，然后从培养瓶中取出，洗净根部培养基，移栽到营养杯中，基质为泥炭土：珍珠岩：蛭石=2:1:1，组培苗移栽后保持湿度80%以上，覆盖薄膜并每天喷水1～2次，两周后即可逐步进行正常管理，移栽成活率可达90%以上。（见附图17-18）。

Claims (9)

1.一种油桐叶片再生植株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将油桐无菌苗叶片，在无菌条件下切成面积为0.5-1cm2的叶盘，接种到1/2MS+1.0-3.0mg/L6-BA+0.05-0.1mg/L IAA+0.05-0.1mg/L IBA的培养基中诱导不定芽，暗培养3-5天后，在光照条件下培养20-30天，培养温度为26士1℃，光照强度为1800-2000lx，光照时间14-16h/d；然后经过继代、增殖、壮苗和生根培养获得完整植株；最后进行炼苗、移栽。
2.根据权利要求1所述的油桐叶片再生植株的方法，其特征在于，继代培养的具体过程如下：将叶盘诱导的不定芽切下接种到1/2MS+1.0-3.0mg/L6-BA+0.05-0.1mg/L IBA的培养基中进行不定芽的继代培养，暗培养1-3天后，在光照条件下培养15-25天；培养温度为26士1℃，光照强度为1800-2000lx，光照时间14-16h/d。
3.根据权利要求1所述的油桐叶片再生植株的方法，其特征在于，增殖培养的具体过程如下：将继代培养得到的不定芽切下接种到MS+2.0-3.0mg/L6-BA+0.05-0.1mg/L IBA的培养基中进行不定芽的增殖培养，暗培养1-3天后，在光照条件下培养25-30天；培养温度为26士1℃，光照强度为1800-2000lx，光照时间14-16h/d。
4.根据权利要求1所述的油桐叶片再生植株的方法，其特征在于，壮苗培养的具体过程如下：将增殖培养得到的芽转接到MS+0.3-1.0mg/L6-BA+0.5-1.0mg/L NAA的培养基中进行壮苗培养，暗培养1-3天后，在光照条件下培养20-25天；培养温度为26士1℃，光照强度为1800-2000lx，光照时间14-16h/d。
5.根据权利要求1所述的油桐叶片再生植株的方法，其特征在于，生根培养的具体过程如下：将增殖培养获得2-4cm的苗接到1/2MS+0.05-0.3mg/LIBA的培养基中进行生根培养；培养温度为26士1℃；暗培养5-7天，再转到光照下培养5-8天生根，光照强度为1800-2000lx，光照时间14-16h/d。
6.根据权利要求1所述的油桐叶片再生植株的方法，其特征在于，炼苗、移栽的具体过程如下：
将生根后的苗先在室内进行移栽前炼苗，3-5天后从培养瓶中取出，洗净根部培养基，移栽到营养杯中，基质为泥炭土：珍珠岩：蛭石=2:1:1，组培苗移栽后保持湿度不低于80%，覆盖薄膜并每天喷水1-2次，两周后即可逐步进行正常管理。
7.根据权利要求1-6任一项所述的油桐叶片再生植株的方法，其特征在于，叶盘诱导不定芽使用的培养基为：1/2MS+2.0-3.0mg/L6-BA+0.05-0.1mg/L IAA+0.05-0.1mg/L IBA；
增殖培养使用的培养基为：MS+3.0mg/L6-BA+0.05-0.1mg/L IBA；
壮苗培养使用的培养基为：MS+0.5mg/L6-BA+0.5-1.0mg/L NAA；
生根培养使用的培养基为：1/2MS+0.05-0.1mg/L IBA。
8.根据权利要求1所述的油桐叶片再生植株的方法，其特征在于，所述的油桐无菌苗的获得过程如下：
选取成熟的油桐当年生种子，取其种皮，将种仁用自来水冲洗3-5min，然后浸泡20-30h，中间换水2-3次，然后在超净工作台中用0.1%的HgCl2消毒3-5min，用无菌水冲洗4-6次，接种在1/2MS基本培养基中，暗培养2-3天，再转到光照条件下培养15-20天即可成苗，培养温度为26士1℃，光照强度为1800-2000lx，光照时间14-16h/d。
9.根据权利要求1所述的油桐叶片再生植株的方法，其特征在于，所述的方法中用到的培养基均附加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH调至5.4-5.8。
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