CN110476818B - 一种物理辅促油桐带芽茎段再生植株的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种物理辅促油桐带芽茎段再生植株的方法，包括以下步骤：S1、初代培养：将油桐的种胚消毒处理后，接种于初代培养基上培养至种胚出芽，初代培养基为：1/2MS+0.5‑1.0mg/L GA3或者1/2MS+0.5mg/L IAA；S2、带芽茎段诱导出芽：切取步骤S1中油桐种胚上的带芽茎段，然后接种于诱导培养基中诱导出芽，诱导培养基为：MS+3mg/L 6‑BA+0.1mg/L IBA；S3、生根处理：将步骤S2中带新芽茎段转移至生根培养基，生根培养基为：1/2MS+0.2mg/LIBA+5g/L活性炭+1/10容器体积麦饭石。本发明提供的油桐带芽茎段的离体快繁的方法，通过种胚无菌萌发后获取带芽茎段，大大降低染菌率，提高出芽率；带芽茎段启动及增殖都采用相同的培养基，通过光质调控增殖系数，减少不同培养基调配的工作量；生根培养基通过添加附加物大大提高了生根率。

Description

一种物理辅促油桐带芽茎段再生植株的方法
技术领域
本发明属于油桐组织培养技术领域，具体涉及一种物理辅促油桐带芽茎段再生植株的方法。
背景技术
油桐(Vernicia fordii)又名三年桐，为大戟科油桐属落叶乔木，是我国特色的经济林树种。油桐属植物共3种：油桐、千年桐和日本油桐，其中油桐果提取的桐油品质最佳。桐油是制造优质油漆和油墨的基本原料，油桐果实还可开发利用为优良的生物质柴油及其他工业原料。油桐可能成为缓解我国能源短缺问题最有发展前途的生物质能源树种之一。全世界对绿色环保的呼吁促使纯天然材料的需求量骤增。目前油桐仍主要采用传统的播种育苗，油桐良种苗木供不应求。
植物器官离体快繁具有短时、高效、所育苗木性状整齐划一的特点。目前关于油桐组织培养的研究较多集中于种胚、叶柄和下胚轴的离体培养，多为阶段式不同培养基优化培养，不同阶段采用不同培养基增大了工作量，不利于后期工厂化生长，生长工序繁琐且成本较高。同时目前对物理因素如不同光质对组培苗的生长的相关研究也比较欠缺。因此现在需要研发出新的油桐带芽茎段的再生植株的方法，以解决现有技术中的油桐组织培养方法所存在的染菌率较高、不同阶段的培养基种类多等技术问题。
发明内容：
本发明目的是提供了一种物理辅促油桐带芽茎段再生植株的方法，要解决现有技术中所存在的技术问题。
为实现以上目的，本发明采用如下技术方案：
一种物理辅促油桐带芽茎段再生植株的方法，包括以下步骤：
S1、初代培养：将油桐的种胚消毒处理后，接种于初代培养基上培养至种胚出芽，所述初代培养基为：1/2MS+0.5-1.0mg/L GA3或者1/2MS+0.5mg/L IAA；
S2、带芽茎段诱导出芽：切取所述步骤S1中油桐种胚上的带芽茎段，然后接种于诱导培养基中诱导出芽，所述诱导培养基为：MS+3mg/L 6-BA+0.1mg/L IBA；
S3、生根处理：将所述步骤S2中长有新芽的茎段转移至生根培养基中进行生根培养，所述生根培养基为：1/2MS+0.2mg/L IBA+5g/L活性炭+1/10容器体积麦饭石。
优选的，所述步骤S1中的消毒处理具体包括：将油桐种胚先置于流动自来水下冲洗3-5h，然后置于75％酒精中消毒浸泡30s后通过无菌水清洗，再置于0.1％升汞消毒浸泡5-6min后通过无菌水中清洗。
优选的，所述步骤S2中的带芽茎段置于红光环境或者红光:蓝光＝4:1的环境下进行培养。
优选的，所述步骤S3中带新芽的茎段置于白光的光环境下培养。
优选的，所述步骤S1或步骤S2或步骤S3中培养环境的每日光照时长为14h，光照强度为60-80μmol/㎡.s。
优选的，所述步骤S1至S3中的初代培养基、诱导培养基和生根培养基的pH值均为5.6-5.8。
优选的，所述步骤S3中的麦饭石直径为3-6mm。
优选的，所述步骤S1至S3中的培养温度为25±2℃。
优选的，还包括步骤S4炼苗移栽：将生根后的油桐无菌苗开盖后在遮阳网下进行移栽前炼苗3-5天，然后从培养瓶中取出，清洗根部培养基后移栽至营养钵中。
前述各培养基中所使用到的外源激素全称分别为：赤霉素(Gibberellin A3,GA3)、6-苄基氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine,6-BA)、吲哚丁酸(Indole-3-Butytricacid,IBA)，IAA为吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid)。
本发明的技术方案至少具有以下有益效果：通过采用油桐种胚消毒后，进行无菌萌发并获取带芽茎段，再通过茎段进行扩繁，大大降低了再生植株的染菌率，且该外植体的再生能力明显优于田间带芽茎段，显著提高了出芽率；本方案中油桐的带芽茎段诱导及增殖都采用相同的培养基配方，因此无需在培养过程中将外植体转移至不同的培养基上，减少了培养基调配的工作量，简化了油桐扩繁的操作步骤，提高了工作效率；通过控制光质实现新芽增殖系数的调控，保证了新芽的生长数量和质量，提高了油桐再生植株的效率；此外，生根培养基中添加颗粒状的附加物，大大提高了油桐再生植株的生根率和生长质量。
附图说明
图1为本发明中油桐种胚出芽的照片；
图2为本发明中带芽茎段诱导出芽的照片；
图3为本发明中带芽茎段在红光：蓝光(4:1)的光质下培养的照片；
图4为本发明中油桐再生植株生根处理后的照片。
具体实施方式
以下提供本发明的优选实施例，以助于进一步理解本发明。本领域技术人员应了解到,本发明实施例的说明仅是示例性的，并不是为了限制本发明的方案。
实施例1
材料来源：本实施例中的油桐种子来自于国家油桐种质资源保存库，2018年10月采摘自湘西永顺县青坪镇油桐试验基葡萄桐优良家系P009。
本实施例中的物理辅促油桐带芽茎段再生植株的方法，具体包括以下步骤：
S1、初代培养：将油桐的种胚消毒处理后，接种于初代培养基上培养至种胚出芽。
为找到合适的油桐种子的消毒处理方式，设计如下表1所示的实验方案，每一行代表一个消毒处理方案，每一行的最后一列为该消毒处理方案的污染率统计结果。每个消毒处理的种子数量均为30颗，每一颗油桐种子的质量相差不超过0.2g；先将油桐的种子去除种皮获得种胚，然后按照下表1所示的每一行的方案进行消毒处理。
在采用酒精、升汞消毒和无菌水消毒时要注意液面要高于种胚；另外，消毒和清洗过程要多次振荡，以便于充分接触，清洗干净。消毒处理后接种时，用无菌刀片沿纵轴切开种仁(胚乳)，剥去2片白色子叶，两片子叶基部夹带有种胚，分清种胚上下端接种于已灭菌的初代培养基中。培养一个月后，将步骤S1中接种后发生污染的种胚数量除以每一组的种胚总数(30颗)即可以获得该消毒处理方案的污染率结果。
表1油桐种胚不同消毒处理后的污染率统计表
Figure BDA0002221191660000041
Figure BDA0002221191660000051
从上表1中的统计结果可知，步骤S1中油桐种胚的消毒处理的最佳方案为：将油桐种子去除种皮后，种胚先置于流动自来水下冲洗3-5h，然后置于75％酒精中消毒浸泡30s后通过无菌水清洗，再置于0.1％升汞消毒浸泡5-6min后通过无菌水中清洗3-5次。
消毒后的油桐种胚在接种时用无菌刀片沿纵轴切开种仁(胚乳)，剥去2片白色子叶(两片子叶基部夹带有种胚)，然后再接种于已灭菌的初代培养基中。
为了筛选出最合适的初代培养基，设计如下表2中所示的不同初代培养基配方，并将消毒后的油桐种胚接种于不同配方的初代培养基中，每个配方的初代培养基中接种30个油桐种胚，培养1个月后统计其出芽率和生长情况。
表2不同初代培养基配方中油桐种胚的出芽情况
Figure BDA0002221191660000052
Figure BDA0002221191660000061
从上表2中的统计结果可知，油桐种胚在E2号初代培养基中的出芽率为100％，且生长情况良好，参见附图1所示；在E3号初代培养基中的出芽率为93.3％，长势较好。采取这两种培养基都能达到良好的初代培养效果。因此油桐种胚的最佳初代培养基配方为：1/2MS+1.0mg/L GA3，次佳为E3号配方：1/2MS+0.5mg/L IAA。
S2、带芽茎段诱导出芽：切取步骤S1中油桐种胚上的带芽茎段，然后接种于诱导培养基中诱导出芽。
为了探索不同的诱导培养基配方对带芽茎段诱导出芽的效果，以筛选出最优培养基，按正交法设计的设计了如下表3所示的实验，在每个配方的诱导培养基上接种30个带芽茎段，置于相同温度和光照条件下统一培养1个月后统计其出芽率和芽均长，结果见下表4。其中MS和WPM的具体配方内容为本技术领域的公知常识，在此不进行赘述。
表3不同配方的诱导培养基正交实验设计
Figure BDA0002221191660000062
表4不同配方的诱导培养基对带芽茎段诱导出芽的影响
Figure BDA0002221191660000063
Figure BDA0002221191660000071
上表2中：a1、a2和a3分别为培养基、6-BA和IBA在F1、F2和F3水平下出芽率的和，R值为a值的极差(即最大值-最小值)；b1、b2和b3分别为培养基、6-BA和IBA在F1、F2和F3水平下芽均长的和，r值为b值的极差(即最大值-最小值)。
从上表4中出芽率和芽均长的统计结果可知，不同配方的诱导培养对带芽茎段诱导出芽的影响程度为：基本培养基＞IBA＞6-BA；由出芽率得出最佳诱导培养基配方为：MS+3.0 6-BA+0.1IBA，其带芽茎段的生长情况参见附图2所示；而由芽均长得出最佳诱导培养基配方为1/2MS+2.0mg/L 6-BA+0.05mg/L IBA。结合影响程度及差异显著性，用SPSS分析筛选出最适合诱导油桐的带芽茎段出芽的培养基配方为：MS+3.0mg/L 6-BA+0.1mg/L IBA。
为了探索不同光照情况对步骤S2中带芽茎段的生长情况，将接种于最佳诱导培养基MS+3.0mg/L 6-BA+0.1mg/L IBA中的带芽茎段置于如下表5所示的不同光照条件下培养1个月后，统计其新芽增殖系统、褐化率和生长情况，每一组光质下培养30个带芽茎段。在本实验中，不同光质通过采用不同的LED灯管照明，其中红光的波长为615-650nm，蓝光的波长为450-480nm，白光、红光、蓝光的LED灯管为市购，不同光照组的光照强度为70μmol/㎡.s，光照时间为14h/d，培养温度为25±2℃。
表5不同光质对油桐无菌苗增殖的影响
Figure BDA0002221191660000081
根据上表5中的统计结果，发现在红光和红光：蓝光＝4：1的光照条件下，带芽茎段的芽增殖系统最高，分别为6.9和6.6，远远超过白光调节下的增殖系数，而且新芽的生长情况良好。参见附图3所示的红光条件下带芽茎段的生长情况。因此，在带芽茎段的诱导阶段，其最佳的光照条件为红光或红光:蓝光＝4:1的光环境下进行培养。
S3、生根处理：将步骤S2中长有新芽的茎段从不同光质环境下移出，过渡到空白培养基(也即不添加任何激素的诱导培养基配方)，相同光质下继续培养10天，然后将各带芽茎段转移至生根培养基中进行生根培养。由于在诱导培养基中添加了较高浓度的细胞分裂素，会影响生根的效果，将带新芽的茎段从诱导培养基中转移空白培养基中过渡可以降低外源分裂素的积累量，减少对后续生根的影响；另外步骤S2中采用不同光质的培养环境对各组幼苗之间存在影响，所以将步骤S2中带新芽的茎段转移至空白培养基中过渡是采用相同光质减少后续生根培养时的植物材料之间的差异。
为了探索不同的生根培养基对油桐新芽生根的影响，设计如下表6所示的实验。每一组生根培养基都接种有30个带有1个新芽的茎段，置于白光下培养1个月后统计生根率。其中麦饭石、珍珠岩和活性炭均为市购产品，基础的生根培养基的配方为：1/2MS+0.2mg/LIBA，PH为5.5。
表6不同生根培养基对油桐无菌苗生根的影响
Figure BDA0002221191660000091
从上表6中可以看出，最佳的生根培养基为H5组配方：1/2MS+0.2mg/LIBA+5g/L活性炭+1/10容器体积麦饭石，其植株的根系粗壮，参见附图4所示的再生植株照片。因为麦饭石具有净化水质、浸水后溶出微量矿质元素的特点，活性炭也具吸附和促进根系形态建成的特点，因此麦饭石加上活性炭的组合促进了油桐无菌苗的生根。
为了了解不同直径麦饭石对油桐无菌苗生根的影响，设计了如下表7所示的实验。将步骤S2中的带新芽的茎段接种于下表7中不同配方的生根培养基中培养一个月，并统计其生根率。
表7不同直径麦饭石对油桐无菌苗生根的影响
Figure BDA0002221191660000101
从上表7中可以看出，生根培养基中添加麦饭石的最佳直径为4mm，但是添加随机混合麦饭石的生根率与添加直径为4mm的麦饭石的生根率差异不显著，因此为了方便可以直接选择添加3-6mm直径任意比例混合的麦饭石颗粒。
本实施例采用消毒处理后的油桐种胚接种于初代培养基诱导出芽，获得带芽茎段，然后将带芽茎段转移至诱导培养基中促使新芽成长，再转移至生根培养基中生根，整个再生植株的培养流程短、操作简单，只需要初代培养基、诱导培养基和生根培养基三种培养基即可，因此从种胚到获得无菌植株，只需要接种三次，出芽率很高，生长情况良好；油桐家系遗传力和重复力都很高，所以取优良家系种子育苗后进行带芽茎段的离体快繁不影响其优良性状的表现，同时因为其细胞活力高于田间带芽茎段细胞活力，可显著降低污染率，提高成活率。相比于现有技术中通过种胚、叶柄和下胚轴的离体培养需要诱导胚状体和不定芽的培养方式，本实施例的方法更简便、效果更好、而且成本更低，并且通过控制光照条件，显著提高了再生植株的生长质量。
最后应当说明的是，以上实施例仅用于说明本申请的技术方案而非对其保护范围的限制，尽管参照上述实施例对本申请进行了详细的说明，所述领域的普通技术人员应当理解：本领域技术人员阅读本申请后依然可对申请的具体实施方式进行种种变更、修改或等同替换，但以上变更、修改或等同替换，均在本申请的待授权或待批准之权利要求保护范围之内。

Claims (6)

1.一种物理辅促油桐带芽茎段再生植株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、初代培养：将油桐的种胚消毒处理后，接种于初代培养基上培养至种胚出芽，所述初代培养基为：1/2MS+0.5-1.0mg/L GA3或者1/2MS+0.5mg/L IAA；
S2、带芽茎段诱导出芽：切取所述步骤S1中油桐种胚上的带芽茎段，然后接种于诱导培养基中诱导出芽，所述诱导培养基为：MS+3mg/L 6-BA+0.1mg/LIBA；所述步骤S2中的带芽茎段置于红光环境或者红光:蓝光＝4:1的环境下进行培养；
S3、生根处理：将所述步骤S2中长有新芽的茎段转移至生根培养基中进行生根培养，所述生根培养基为：1/2MS+0.2mg/LIBA+5g/L活性炭+1/10容器体积麦饭石；
所述步骤S1至S3中的初代培养基、诱导培养基和生根培养基的pH值均为5.6-5.8。
2.根据权利要求1所述的物理辅促油桐带芽茎段再生植株的方法，其特征在于，所述步骤S1中的消毒处理具体包括：将油桐种胚先置于流动自来水下冲洗3-5h，然后置于75％酒精中消毒浸泡30s后通过无菌水清洗，再置于0.1％升汞消毒浸泡5-6min后通过无菌水清洗。
3.根据权利要求1所述的物理辅促油桐带芽茎段再生植株的方法，其特征在于，所述步骤S3中带新芽的茎段置于白光的光环境下培养。
4.根据权利要求2或3所述的物理辅促油桐带芽茎段再生植株的方法，其特征在于，所述步骤S1或步骤S2或步骤S3中培养环境的每日光照时长为14h，光照强度为60-80μmol/㎡.s。
5.根据权利要求4所述的物理辅促油桐带芽茎段再生植株的方法，其特征在于，所述步骤S1至S3中的培养温度为25±2℃。
6.根据权利要求5所述的物理辅促油桐带芽茎段再生植株的方法，其特征在于，所述步骤S3中的麦饭石直径为3-6mm。
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