CN115702630B - 猴耳环无糖组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种猴耳环无糖组织培养方法，包括以下步骤：取猴耳环种子，清洗浸泡后播种，待其发芽；切出腋芽，对腋芽消毒，清洗后接种至培养基，培养至萌发幼芽；将幼芽接种至继代培养基，进行丛生芽增殖；待丛生芽长成无根苗后移栽到经消毒的基质中，加入培养液进行无糖培养，培养期间通入二氧化碳并进行光照；培养液中包括吲哚丁酸和萘乙酸；通入二氧化碳的浓度为1800‑3700μmol·mol‑1，光照强度为6000‑6500lx，培养至长出根系，出苗移栽。本发明的猴耳环无糖组织培养方法得到猴耳环幼苗生根率高、根系发达，苗健壮，存活率高。
Description
技术领域
本发明涉及猴耳环培育技术领域，特别是涉及一种猴耳环无糖组织培养方法。
背景技术
猴耳环是豆科猴耳环属多年生高大乔木，又名围涎树、蛟龙木、落地金钱、鸡三树、尿桶公等，广泛分布于我国浙江、广东、广西、福建、台湾地区及云南等地区。猴耳环具有抗菌消炎、活血散结、清热解毒、去湿敛疮等功效，已被列入我国中药保护品种。
猴耳环药材主要来源于野生资源，过度开发采集会导致野生药材蕴藏量急剧下降，无法满足市场需求。而现有人工培育的猴耳环存在生根率低、苗木存活率低等问题。因此，亟需开发新的猴耳环人工培育方法以弥补药材供应，实现药材资源可持续利用。
发明内容
基于此，有必要针对上述问题，提供一种猴耳环无糖组织培养方法，具有生根率高、根系发达、苗存活率高的优点，更适合进行商业化生产。
一种猴耳环无糖组织培养方法，包括以下步骤：
播种：取猴耳环种子，清洗浸泡后播种，待其发芽；
消毒：切出腋芽，对腋芽消毒，清洗后接种至培养基，培养至萌发幼芽；
增殖培养：将幼芽接种至继代培养基，进行丛生芽增殖；
生根培养：待丛生芽长成无根苗后移栽到经消毒的基质中，加入培养液进行无糖培养，培养期间通入二氧化碳并进行光照；培养液中包括吲哚丁酸和萘乙酸；通入二氧化碳的浓度为1800-3700μmol·mol-1，光照强度为6000-6500lx，培养至长出根系，出苗移栽。
传统组织培养方式培养猴耳环，容易出现根系畸形、不发达、移栽成活率低或缓苗时间长等问题。而本发明的猴耳环无糖培养方法，通过对培养液、光照强度、温度、湿度、二氧化碳浓度等因素的动态调整，使苗快速适应无糖组培环境，生根无畸形、生根率高、根系发达，苗存活率高，无需炼苗，移栽成活率大大提升。
在其中一个实施例中，所述播种步骤具体为：猴耳环种子用水清洗后，用百菌清溶液浸泡15-25min，播种至轻型育苗基质中，待其发芽。
在其中一个实施例中，所述消毒步骤中，消毒方式为：先用体积浓度为70-80％的酒精消毒1-2min，再用质量浓度为4％-6％的次氯酸钙溶液消毒5-25min。此消毒方法可提高猴耳环外植体的萌芽率。
在其中一个实施例中，所增殖培养步骤中，增殖至第3-4代。
在其中一个实施例中，所述生根培养步骤中，基质为蛭石、河沙和泥炭土的混合物，蛭石、河沙和泥炭土的质量比为1：(0.8-1.2)：(0.8-1.2)。该基质疏水性好，孔隙率大，可采用该基质并配合上述培养液进行猴耳环无糖组织培养，可提高苗的生根率和移栽成活率。
在其中一个实施例中，所述生根培养步骤中，培养液为含有0.3-0.5mg/L吲哚丁酸(IBA) 和0.05-0.10mg/L萘乙酸(NAA)的MS培养基。
在其中一个实施例中，所述生根培养步骤中，通入二氧化碳和光照的时间均为每日的8 时-16时。
在其中一个实施例中，所述生根培养步骤中，无糖培养初期通入二氧化碳的浓度为 1800-2200μmol·mol-1，无糖培养中期通入二氧化碳的浓度为2800-3200μmol·mol-1，无糖培养后期通入二氧化碳的浓度为3300-3700μmol·mol-1，无糖培养初期为无糖培养的第1-7天，无糖培养中期为无糖培养的第8-37天，无糖培养后期为无糖培养的第38-47天。
在其中一个实施例中，所述生根培养步骤中，无糖培养的温度为25-28℃，湿度为55％-85％。
在其中一个实施例中，所述生根培养步骤中，无糖培养初期的湿度控制为80±5％，无糖培养中期的湿度控制为70±5％，无糖培养后期的湿度控制为60±5％。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的猴耳环无糖培养方法，通过对培养液、光照强度、温度、湿度、二氧化碳浓度等因素的动态调整，使苗快速适应无糖组培环境，生根无畸形、生根率高、根系发达，苗存活率高，无需炼苗，移栽成活率大大提升。采用传统组织培养方式，猴耳环基部在诱导出根时根系表现粗短、膨大、畸形且愈伤组织较多，不少植株在茎底部出现愈伤组织，生根过程中小苗有出现叶片变黄且提前落叶，而采用本发明的猴耳环无糖组培方法，诱导生根的根系发达整齐、伸展性好、小苗健壮、叶色翠绿。
附图说明
图1为采用实施例1中采用无糖组培生根苗。
图2为采用对比例1中传统组织培养生根苗。
具体实施方式
为了便于理解本发明，以下将给出较佳实施例对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
实施例1
一种猴耳环无糖组织培养方法，包括以下步骤：
(1)取200颗猴耳环种子，用自来水清洗干净，再用稀释500倍的百菌清溶液浸泡20min，播种至轻型育苗基质中，待其发芽。
(2)待苗长到15cm左右时，切出腋芽，在超净工作台进行消毒，先用体积浓度为75％的酒精消毒1min，无菌水清洗后，再用5wt％的次氯酸钙溶液消毒25min，无菌水清洗后，接种至培养基，该培养基可以是本领域常用的猴耳环培养基，本实施例中选用含有0.5mg/L 6- 苄氨基嘌呤(6-BA)和0.05mg/L萘乙酸的MS培养基，培养至萌发幼芽。平均污染率24.0％，萌芽率70％。
(3)将幼芽接种至继代培养基，该继代培养基可以是本领域常用的继代培养基，本实施例中选用含有0.8mg/L 6-苄氨基嘌呤和0.05mg/L萘乙酸的MS培养基，进行丛生芽增殖，增殖3代。
(4)待丛生芽长成无根苗后移栽到经消毒的基质中，该基质为蛭石、河沙和泥炭土以质量比1:1:1混合而成，加入培养液进行无糖培养，培养液为含有0.4mg/L吲哚丁酸和0.1mg/L 萘乙酸的MS培养基，培养期间每天8时-16时通入二氧化碳并进行光照，光照强度为 6000-6500lx。无糖培养大致可分为初期(第1-7天)、中期(第8-37天)和后期三个阶段(第 38-47天)。初期通入二氧化碳的浓度为2000μmol·mol-1，中期通入二氧化碳的浓度为3000μmol·mol-1，后期通入二氧化碳的浓度为3500μmol·mol-1。无糖培养的温度为26℃，初期的湿度控制为80％，中期的湿度控制为70％，后期的湿度控制为60％。培养至长出根系，出苗移栽。
本实施例的无糖组培的生根率和移栽成活率分别为100％和99.9％，平均根长、根数和幼苗生长情况如表1所示，苗高和苗径如表2所示。无糖组培生根苗如图1所示。
实施例2
一种猴耳环无糖组织培养方法，与实施例1的区别在于，步骤(2)中的消毒方式为：先用体积浓度为75％的酒精消毒1min，无菌水清洗后，再用0.01wt％的升汞消毒15min。平均污染率29.0％，萌芽率54％。
实施例3
一种猴耳环无糖组织培养方法，与实施例1的区别在于，步骤(2)中的消毒方式为：先用体积浓度为75％的酒精消毒1min，无菌水清洗后，再用10wt％的益培隆溶液消毒25min。平均污染率86.5％，萌芽率77％。
实施例4
一种猴耳环无糖组织培养方法，与实施例1的区别在于，步骤(4)中的培养液为包括 0.3mg/L吲哚丁酸和0.05mg/L萘乙酸的MS培养基。本实施例的无糖组培的生根率和移栽成活率分别为100％和98.5％，平均根长、根数和幼苗生长情况如表1所示。
实施例5
一种猴耳环无糖组织培养方法，与实施例1的区别在于，步骤(4)中的培养液为包括 0.5mg/L吲哚丁酸和0.1mg/L萘乙酸的MS培养基。本实施例的无糖组培的生根率和移栽成活率分别为100％和98.7％，平均根长、根数和幼苗生长情况如表1所示。
实施例6
一种猴耳环无糖组织培养方法，与实施例1的区别在于，步骤(4)中的基质为蛭石。苗高和苗径如表2所示。
实施例7
一种猴耳环无糖组织培养方法，与实施例1的区别在于，步骤(4)中的基质为河沙。苗高和苗径如表2所示。
实施例8
一种猴耳环无糖组织培养方法，与实施例1的区别在于，步骤(4)中的基质为泥炭土。苗高和苗径如表2所示。
实施例9
一种猴耳环无糖组织培养方法，与实施例1的区别在于，步骤(4)中的基质为蛭石和河沙按质量比1:1混合而成。苗高和苗径如表2所示。
实施例10
一种猴耳环无糖组织培养方法，与实施例1的区别在于，步骤(4)中的基质为蛭石和泥炭土按质量比1:1混合而成。苗高和苗径如表2所示。
实施例11
一种猴耳环无糖组织培养方法，与实施例1的区别在于，步骤(4)中的基质为河沙和泥炭土按质量比1:1混合而成。苗高和苗径如表2所示。
对比例1
一种猴耳环传统组织培养方法，包括以下步骤：取猴耳环种子，用70％的酒精处理，无菌水清洗，再用0.1％HgCl2溶液清洗，无菌水冲洗；将种子接种于培养基中，至长出幼苗；取猴耳环幼苗，切成带节茎段，接种于丛芽诱导培养基中；切取健壮的小芽接种到基本培养基中进行生根培养，观察根系生长情况。
传统组织培养的生根率和移栽成活率分别为57.5％和80.3％，平均根长、根数和幼苗生长情况如表1所示，苗高和苗径如表2所示。传统组织培养生根苗如图2所示。
表1平均根长、根数和幼苗生长情况
| 平均根长 | 根数 | 幼苗生长情况 | |
| 实施例1 | 7.19±1.49 | 8.91±0.72 | 较好 |
| 实施例4 | 6.47±0.85 | 6.21±1.41 | 较好 |
| 实施例5 | 6.72±1.54 | 7.27±1.07 | 较好 |
| 对比例1 | 5.34±1.22 | 7.56±0.56 | 一般 |
从表1可以看出，本发明的无糖组培方法相比于传统组培方法，苗平均根长更长、根数更多，实施例1的无糖组培苗的平均根长和根数最多，生长状况最好。
表2苗高和地径
| 苗高(cm) | 地径(mm) | |
| 实施例1 | 7.43±2.72 | 1.36±0.43 |
| 实施例6 | 5.27±1.84 | 1.12±0.12 |
| 实施例7 | 5.39±1.95 | 1.17±0.30 |
| 实施例8 | 6.23±1.14 | 1.25±0.22 |
| 实施例9 | 5.31±1.08 | 1.13±0.41 |
| 实施例10 | 6.29±0.88 | 1.16±0.52 |
| 实施例11 | 6.43±1.00 | 1.24±0.50 |
| 对比例1 | 4.46±1.49 | 0.70±0.62 |
从表2可以看出，本发明的无糖组培方法相比于传统有糖组培方法，苗高和地径更大，实施例1的苗高和地径最大。
从苗生长状态看，无糖组培方式下诱导生根的效果明显优于传统组培，根系发达整齐、伸展性好，小苗健壮，叶色翠绿(图1)。传统组培方式的猴耳环基部在诱导出根时根系表现粗短、膨大、畸形且愈伤组织较多(图2)，不少植株在茎底部出现愈伤组织，生根过程中小苗有出现叶片变黄且提前落叶。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (9)
1.一种猴耳环无糖组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
播种：取猴耳环种子，清洗浸泡后播种，待其发芽；
消毒：切出腋芽，对腋芽消毒，清洗后接种至培养基，培养至萌发幼芽；
增殖培养：将幼芽接种至继代培养基，进行丛生芽增殖；
生根培养：待丛生芽长成无根苗后移栽到经消毒的基质中，加入培养液进行无糖培养，培养期间通入二氧化碳并进行光照；培养液中包括吲哚丁酸和萘乙酸；通入二氧化碳的浓度为1800-3700μmol·mol-1，光照强度为6000-6500lx，培养至长出根系，出苗移栽；
所述消毒步骤中，消毒方式为：先用体积浓度为70-80％的酒精消毒1-2min，再用质量浓度为4％-6％的次氯酸钙溶液消毒5-25min。
2.根据权利要求1所述的猴耳环无糖组织培养方法，其特征在于，所述播种步骤具体为：猴耳环种子用水清洗后，用百菌清溶液浸泡15-25min，播种至轻型育苗基质中，待其发芽。
3.根据权利要求1所述的猴耳环无糖组织培养方法，其特征在于，所述生根培养步骤中，基质为蛭石、河沙和泥炭土的混合物，蛭石、河沙和泥炭土的质量比为1：(0.8-1.2)：(0.8-1.2)。
4.根据权利要求1所述的猴耳环无糖组织培养方法，其特征在于，所增殖培养步骤中，增殖至第3-4代。
5.根据权利要求1所述的猴耳环无糖组织培养方法，其特征在于，所述生根培养步骤中，培养液为包括0.3-0.5mg/L吲哚丁酸和0.05-0.10mg/L萘乙酸的MS培养基。
6.根据权利要求1所述的猴耳环无糖组织培养方法，其特征在于，所述生根培养步骤中，通入二氧化碳和光照的时间均为每日的8时-16时。
7.根据权利要求1-6任一项所述的猴耳环无糖组织培养方法，其特征在于，所述生根培养步骤中，无糖培养初期通入二氧化碳的浓度为1800-2200μmol·mol-1，无糖培养中期通入二氧化碳的浓度为2800-3200μmol·mol-1，无糖培养后期通入二氧化碳的浓度为3300-3700μmol·mol-1，无糖培养初期为无糖培养的第1-7天，无糖培养中期为无糖培养的第8-37天，无糖培养后期为无糖培养的第38-47天。
8.根据权利要求7所述的猴耳环无糖组织培养方法，其特征在于，所述生根培养步骤中，无糖培养的温度为25-28℃，湿度为55％-85％。
9.根据权利要求8所述的猴耳环无糖组织培养方法，其特征在于，所述生根培养步骤中，无糖培养初期的湿度控制为80±5％，无糖培养中期的湿度控制为70±5％，无糖培养后期的湿度控制为60±5％。
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|---|---|---|---|
| CN202110941012.4A CN115702630B (zh) | 2021-08-17 | 2021-08-17 | 猴耳环无糖组织培养方法 |
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|---|---|
| CN115702630A CN115702630A (zh) | 2023-02-17 |
| CN115702630B true CN115702630B (zh) | 2023-11-24 |
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ID=85181242
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| CN202110941012.4A Active CN115702630B (zh) | 2021-08-17 | 2021-08-17 | 猴耳环无糖组织培养方法 |
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|---|---|---|---|---|
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Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
| CN1214858A (zh) * | 1998-11-20 | 1999-04-28 | 昆明市环境科学研究所 | 一种无糖箱式植物组织的培养方法 |
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-
2021
- 2021-08-17 CN CN202110941012.4A patent/CN115702630B/zh active Active
Patent Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
| CN1214858A (zh) * | 1998-11-20 | 1999-04-28 | 昆明市环境科学研究所 | 一种无糖箱式植物组织的培养方法 |
| CN103430843A (zh) * | 2013-08-09 | 2013-12-11 | 华南农业大学 | 一种猴耳环种子苗茎段组织培养快速繁殖方法 |
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 林药猴耳环无糖组培生根技术对比研究;王立等;《湖北农业科学》;第61卷(第9期);第151-155页 * |
| 药用植物猴耳环的组织培养与快速繁殖;付姝颖等;《植物生理学报》;第51卷(第12期);第2195页摘要、第2196页第2.1-2.5节 * |
| 高CO2浓度下4种豆科乔木种子萌发和幼苗生长;陈章和等;《植物生态学报》;第23卷(第2期);第161-170页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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