CN115843692B - 一种大花葱组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种大花葱组织培养方法，属于植物组织培养技术领域。本发明组织培养方法包括以下步骤：以大花葱鳞茎为起始材料采集外植体，经初代培养、不定芽诱导及增殖培养、鳞茎诱导培养、鳞茎膨大及生根培养，获得鳞茎生根组培苗。本发明采用营养器官为外植体，经由直接不定芽诱导的植株再生技术，无愈伤组织诱导及愈伤组织分化诱导环节，减少植物组培过程中后代变异的发生，后代种苗遗传背景一致，最大限度保持母本的优良性状；采用瓶内直接诱导鳞茎进行后期种苗移栽，极大提高大花葱组培苗移栽成活率；不定芽繁殖系数3.0以上，鳞茎膨大率90％以上，组培苗生根率90％以上，完全达到植物种苗工厂化育苗生产的要求。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，尤其涉及一种大花葱组织培养方法。
背景技术
大花葱(Allium giganteum Regel)又称硕葱，为百合科葱属多年生球根花卉，同属有400余种。大花葱鳞茎球形或半球形，肉质，具葱味，花茎挺拔突出，花序大，顶生，完全开放的花序呈球状，花色艳丽，具有极高的观赏价值，在各国园林中广泛应用。
目前大花葱常用繁殖方式为种播和鳞茎分株。费砚良(1996)报道，大花葱虽然种子较多，但种子萌发时间长，技术要求较高，一旦条件不合适，萌发率低时不足1％，而且从播种到正常开花一般需要5年。另外，因为大花葱为异花授粉植物，种子播种后代变异较多。而利用鳞茎再生分株繁殖对母鳞茎的大小有要求，而且繁殖效率低下，每年仅可繁殖2-4个；CN102090252B的发明专利公开了一种“大花葱扦插繁殖方法”，以无性扦插繁殖为主，因受到材料数量及生产周期限制，每年生产大花葱球茎也仅为常规方法的2倍左右。
目前关于利用组织培养的方式进行大花葱种苗快繁研究较少。Andrej等(2002)利用成熟花器官进行培养获得休眠状态不定芽，还需要添加试剂打破休眠，而且利用花器官进行培养，后代变异几率会更大，不利于母本优良性状保持；尹思(2021)利用大花葱无菌苗幼叶为起始材料，通过高浓度生长素配合低浓度细胞分裂素，经由愈伤诱导、分化，然后诱导生根获得无菌苗，增殖系数最高约为1.8，生根率仅46％；陈权等(2021)利用大花葱鳞片为起始材料，经由愈伤诱导、愈伤分化后获得不定芽，但未进行不定根诱导及后续成苗研究，尚未完全获得可实际应用的大花葱组培苗。截止目前，可以认为大花葱可实际应用于种球快速生产的组培快繁技术体系尚未建立。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种大花葱组织培养方法，建立大花葱种球快速生产的组培快繁技术体系，保持母本的优良性状，增加繁殖系数。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
一种大花葱组织培养方法，包括以下步骤：
以大花葱鳞茎为起始材料采集外植体，经初代培养、不定芽诱导及增殖培养、鳞茎诱导培养、鳞茎膨大及生根培养，获得鳞茎生根组培苗；
初代培养基配方为：MS+6-BA 0.1-0.2mg/L+NAA 0.02-0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0-9.0g/L，pH 5.7-5.8；或MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.02-0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0-9.0g/L，pH 5.7-5.8；
不定芽诱导培养基配方为：MS+6-BA 0.5-5.0mg/L+NAA 0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0-9.0g/L，pH 5.7-5.8；或MS+6-BA 1.0-5.0mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0-9.0g/L，pH 5.7-5.8；或MS+6-BA 1.0-1.5mg/L+NAA 0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0-9.0g/L，pH 5.7-5.8；
不定芽增殖培养基配方为：MS+6-BA 0.2-2.0mg/L+NAA 0.05-0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0-9.0g/L，pH 5.7-5.8；
鳞茎诱导培养基配方为：MS+6-BA 0.2-2.0mg/L+NAA 0.05-0.2mg/L+蔗糖40-60g/L+琼脂7.0-9.0g/L，pH 5.7-5.8；
鳞茎膨大及生根培养基配方为：MS+NAA 0.1-0.5mg/L+蔗糖40-60g/L+活性炭0.1-0.5g/L+琼脂7.0-9.0g/L，pH 5.7-5.8。
优选的是，所述大花葱鳞茎剥开外部1-2层鳞片，切除其他部分，保留鳞茎下部带茎盘1/3部分为外植体。
优选的是，所述外植体从中间纵向剖开，以茎盘相连2-3层相邻鳞片为单元，将材料分割成高1-2cm，鳞片上部宽0.8-1.2cm的组织，接种培养。
更优选的是，所述外植体进行消毒处理，包括70-75％酒精浸泡20-40s，0.5-1.0％次氯酸钠溶液浸泡8-15min，无菌水冲洗3-4遍。
优选的是，所述初代培养包括：切去外植体鳞片上部1-2mm组织，侧卧接种在初代培养基培养。
优选的是，所述不定芽诱导及增殖培养包括：初代培养腋芽长至1-3cm后从基部与母体材料分开，切去上部绿色部分，将白色部分从中间切破，横卧接种到不定芽诱导培养基中进行培养；诱导形成丛生芽以3-5个丛生芽为单位，从基部纵向分开，短切至不定芽高度2-3cm，接种到不定芽增殖培养基中进行培养。
优选的是，所述鳞茎诱导培养包括：增殖培养的丛生不定芽以3-5个丛生芽为单位，从基部纵向分开，接种到鳞茎诱导培养基中进行培养。
优选的是，所述鳞茎膨大及生根培养包括：选择直径不小于3mm的鳞茎，从基部纵向单个与丛生鳞茎分开，接种到鳞茎膨大及生根培养基中进行培养。
优选的是，所述组织培养过程温度20±2℃，光照周期10-12h/d，光照强度20-35μmol·m-2·s-1。
优选的是，还包括组培苗的驯化移栽：选择直径大于5mm、基部长出2-3条1-2cm不定根的鳞茎进行温室育球；移栽鳞茎保留2-3cm高，剪去上部叶片后，栽入基质中，相对湿度60％以上，培养温度15-25℃，光照强度2000-4000Lx培养
相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
1、通过组织培养技术进行大花葱种苗规模化生产，可以不受地区限制，周年进行大花葱种苗生产，便于大花葱种苗工厂化繁育，可根据订单进行计划生产，生产时间及规模可控，为大花葱的推广应用提供充足的优质种苗保障，目前还未见到关于大花葱种苗生产完整组织培养的报道。
2、不定芽繁殖系数3.0以上，鳞茎膨大率90％以上，组培苗生根率90％以上，完全达到植物种苗工厂化育苗生产的要求。
3、本发明采用营养器官经由直接不定芽诱导的植株再生技术，无愈伤组织诱导及愈伤组织分化诱导环节，减少植物组培过程中后代变异的发生，后代种苗遗传背景一致，最大限度保持母本的优良性状。
4、本发明采用瓶内直接诱导鳞茎进行后期种苗移栽，极大提高大花葱组培苗移栽成活率。
5、建立良好的基于直接不定芽诱导和增殖的大花葱组培快繁体系，为今后利用植物生物技术对该品种进行新品种培育、遗传改良等研究工作奠定基础，也为该属其他植物品种组培快繁技术建立提供技术指导和参考。
附图说明
图1：本发明大花葱组织培养流程图；
图2：初代腋芽伸长培养；
图3：不定芽诱导培养；
图4：不定芽增殖培养；
图5：鳞茎诱导培养；
图6：鳞茎膨大及生根培养。
具体实施方式
本发明提供了一种大花葱组织培养方法，包括以下步骤：以大花葱鳞茎为起始材料采集外植体，经初代培养、不定芽诱导培养、不定芽增殖培养、鳞茎诱导、鳞茎膨大及生根培养，获得鳞茎生根组培苗。
本发明利用大花葱鳞茎为起始材料。优选剥开鳞茎外部1-2层鳞片，切除鳞茎基部多余部分，保证基部表面平整，无伤痕，对鳞茎进行清洗，清洗干净后，切去鳞茎上部2/3高度的组织，仅留下部带茎盘的1/3部分为起始外植体。
本发明优选对起始外植体进行处理，包括将带茎盘的材料从中间纵向剖开，再以茎盘相连2-3层相邻鳞片为单元，将材料分割成高1.0-2.0cm，鳞片上部宽0.8-1.2cm的组织，接种培养；进一步优选包括：切好后的组织材料先用体积比70-75％酒精溶液震荡清洗10-20s，再用洗洁精溶液震荡清洗外植体8-10min，最后用流水冲洗干净外植体表面残留洗洁精溶液。
本发明优选对外植体进行消毒，包括：清洗干净的外植体在准备好的超净工作台上，转入无菌锥形瓶中，加入体积比为70-75％酒精溶液，液面没过植物材料表面0.5cm，浸泡时间30s，期间轻微水平晃动锥形瓶，然后倒出酒精溶液，再加入有效氯浓度为0.5-1％的次氯酸钠溶液，液面没过植物材料表面0.5cm，轻微水平晃动锥形瓶8-15min，倒出次氯酸钠溶液，最后用无菌水清洗经次氯酸钠溶液消毒的植物材料3-4遍。
本发明优选经过表面消毒的外植体从无菌水中取出，每次取出5-8个，切去鳞片上部1-2mm的组织，然后以侧卧方式接种培养。
接种于初代培养基进行初代腋芽伸长培养，如图1所示。本发明初代培养基配方为：MS+6-BA 0.1-0.5mg/L+NAA 0.02-0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0-9.0g/L，pH 5.7-5.8；进一步优选MS+6-BA0.5mg/L+NAA 0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0-9.0g/L，pH 5.7-5.8。
干净成活腋芽长至1-3cm后从基部与母体材料分开，切去上部绿色部分，将白色部分从中间切破，横卧接种到不定芽诱导培养基中进行不定芽诱导，如图2所示。本发明不定芽诱导培养基配方为：MS+6-BA 0.5-5.0mg/L+NAA 0.05-0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0-9.0g/L，pH 5.7-5.8；进一步优选MS+6-BA2.0mg/L+NAA 0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0-9.0g/L，pH5.7-5.8。
经诱导形成丛生芽以3-5个丛生芽为单位，从基部纵向分开，切去过长叶片，保持不定芽高度2-3cm，接种到增殖培养基中进行增殖培养，如图3所示。本发明不定芽增殖培养基配方为：MS+6-BA 0.2-2.0mg/L+NAA 0.05-0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0-9.0g/L，pH5.7-5.8；进一步优选MS+6-BA 0.8mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0-9.0g/L，pH 5.7-5.8。
增殖培养的丛生不定芽以3-5个丛生芽为单位，从基部纵向分开，接种到鳞茎诱导培养基中进行培养，如图4所示。本发明鳞茎诱导培养基配方为：MS+6-BA 0.2-2.0mg/L+NAA0.05-0.2mg/L+蔗糖40-60g/L+琼脂7.0-9.0g/L，pH 5.7-5.8；进一步优选MS+6-BA 0.4mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖45g/L+琼脂7.0-9.0g/L，pH 5.7-5.8。
选择直径不小于3mm的鳞茎，从基部纵向单个与丛生鳞茎分开，接种到鳞茎膨大及生根诱导培养基中进行膨大和生根培养，如图5所示。本发明鳞茎膨大及生根培养基配方为：MS+NAA 0-0.5mg/L+蔗糖40-60g/L+活性炭0.1-0.5g/L+琼脂7.0-9.0g/L，pH 5.7-5.8；进一步优选MS+NAA 0.1mg/L+蔗糖45g/L+活性炭0.1g/L+琼脂7.0-9.0g/L，pH 5.7-5.8。
本发明优选组织培养环境为：培养室温度为20±2℃，光照时间为10-12h/d，光照强度为20-35μmol·m-2·s-1，进一步优选照明光源为5000K色温LED管状光源。
本发明优选还包括组培苗驯化移栽：选择直径大于5mm、基部长出2-3条1-2cm不定根的鳞茎进行温室育球。将大花葱组培鳞茎移至温室，洗净鳞茎表面培养基，于阴凉处稍晾干，移栽鳞茎保留2-3cm高，剪去上部叶片后将鳞茎栽入基质(泥炭：椰糠＝1:1)中，相对湿度80％以上，培养温度15-25℃，光照强度2000-4000Lx培养30d，然后在温室中正常培养。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种大花葱组织培养方法，步骤如下：
1、准备培养基
基本培养基均为MS培养基，凝固剂为琼脂粉，用量为8.0g/L，培养基pH分装前调整为5.7-5.8；
初代培养基为MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L+蔗糖30g/L；
不定芽诱导培养基为MS+6-BA2.0mg/L+NAA 0.2mg/L+蔗糖30g/L；
不定芽增殖培养基为MS+6-BA 0.8mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L；
鳞茎诱导培养基为MS+6-BA 0.4mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖45g/L；
鳞茎膨大及生根培养基为MS+NAA 0.1mg/L+蔗糖45g/L+活性炭0.1g/L。
2、培养环境
培养室温度为20±2℃，光照时间为10-12h/d，光照强度为20-35μmol·m-2·s-1，照明光源为5000K色温LED管状光源。
3、外植体选取
利用大花葱鳞茎为起始材料。剥开鳞茎外部1-2层鳞片，切除鳞茎基部多余部分，保证基部表面平整，无伤痕。对鳞茎进行清洗，清洗干净后，切去鳞茎上部2/3高度的组织，仅留下部带茎盘的1/3部分为起始外植体。
4、外植体处理
将带茎盘的材料从中间纵向剖开，再以茎盘相连2-3层相邻鳞片为单元，将材料分割成高约1.5cm，鳞片上部宽约1cm大小组织。切好后的材料先用体积比70-75％酒精溶液震荡清洗10-20s，再用洗洁精溶液震荡清洗外植体810min，最后用流水冲洗干净外植体表面残留洗洁精溶液。
5、外植体表面消毒
清洗干净的外植体在准备好的超净工作台上，转入无菌锥形瓶中，加入体积比为70-75％酒精溶液，液面没过植物材料表面0.5cm，浸泡时间30s，期间轻微水平晃动锥形瓶，然后倒出酒精溶液，再加入有效氯浓度为0.5-1％的次氯酸钠溶液，液面没过植物材料表面0.5cm，轻微水平晃动锥形瓶8-15min，倒出次氯酸钠溶液，最后用无菌水清洗经次氯酸钠溶液消毒的植物材料3-4遍。
6、外植体接种
经过表面消毒的外植体从无菌水中取出，每次取出5-8个，切去鳞片上部1-2mm的组织，然后以侧卧方式接种在初代培养基中进行培养。
7、不定芽诱导及增殖
干净成活腋芽长至2cm左右后从基部与母体材料分开，切去上部绿色部分，将白色部分从中间切破，横卧接种到不定芽诱导培养基中进行不定芽诱导。经诱导形成丛生芽以3-5个丛生芽为单位，从基部纵向分开，切去过长叶片，保持不定芽高度2-3cm，接种到增殖培养基中进行增殖培养。
8、鳞茎诱导
增殖培养的丛生不定芽以3-5个丛生芽为单位，从基部纵向分开，接种到鳞茎诱导培养基中进行培养。
9、鳞茎膨大及生根
选择直径不小于3mm的鳞茎，从基部纵向单个与丛生鳞茎分开，接种到鳞茎膨大及生根诱导培养基中进行膨大和生根培养。
10、组培苗驯化移栽
选择直径大于5mm、基部长出2-3条1-2cm不定根的鳞茎进行温室育球。将大花葱组培鳞茎移至温室，洗净鳞茎表面培养基，于阴凉处稍晾干，移栽鳞茎保留2-3cm高，剪去上部叶片后将鳞茎栽入基质(泥炭：椰糠＝1:1)中，相对湿度80％以上，培养温度15-25℃，光照强度2000-4000Lx培养30d，然后在温室中正常培养。
实施例2
与实施例1的区别在于：
基本培养基均为MS培养基，凝固剂为琼脂粉，用量为7.0g/L，培养基pH分装前调整为5.7-5.8；
初代培养基为MS+6-BA 0.25mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L；
不定芽诱导培养基为MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L+蔗糖30g/L；
不定芽增殖培养基为MS+6-BA 0.2mg/L+NAA 0.05mg/L+蔗糖30g/L；
鳞茎诱导培养基为MS+6-BA 0.2mg/L+NAA 0.05mg/L+蔗糖40g/L；
鳞茎膨大及生根培养基为MS+蔗糖40g/L+活性炭0.25g/L。
实施例3
与实施例1的区别在于：
基本培养基均为MS培养基，凝固剂为琼脂粉，用量为9.0g/L，培养基pH分装前调整为5.7-5.8；
初代培养基为MS+6-BA 0.1mg/L+NAA 0.02mg/L+蔗糖30g/L；
不定芽诱导培养基为MS+6-BA 5.0mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L；
不定芽增殖培养基为MS+6-BA2.0mg/L+NAA 0.2mg/L+蔗糖30g/L；
鳞茎诱导培养基为MS+6-BA2.0mg/L+NAA 0.2mg/L+蔗糖60g/L；
鳞茎膨大及生根培养基为MS+NAA 0.5mg/L+蔗糖60g/L+活性炭0.5g/L。
实施例4
不同培养基对大花葱初代腋芽生长的影响
试验设计：
初代培养基：基本培养基为MS培养基，凝固剂为琼脂粉，用量为7.0-9.0g/L，蔗糖30g/L，培养基pH分装前调整为5.7-5.8，添加不同浓度6-BA和NAA，如表1所示。接种大花葱外植体进行培养，观察腋芽诱导生长情况。
培养室温度为20±2℃，光照时间为10-12h/d，光照强度为20-35μmol·m-2·s-1，照明光源为5000K色温LED管状光源。
表1不同浓度6-BA和NAA对大花葱腋芽生长的影响
| 处理 | 6-BA(mg/L) | NAA(mg/L) | 腋芽生长情况 |
| 1 | 0 | 0 | 长势细弱，矮，无绿 |
| 2 | 0.1 | 0.02 | 长势细弱，矮，无绿 |
| 3 | 0.1 | 0.05 | 长势细弱，矮，黄绿 |
| 4 | 0.1 | 0.1 | 长势细弱，矮，无绿 |
| 5 | 0.1 | 0.2 | 长势细弱，矮，无绿 |
| 6 | 0.1 | 0.5 | 长势细弱，矮，愈伤 |
| 7 | 0.2 | 0.02 | 长势稍好，无绿 |
| 8 | 0.2 | 0.05 | 长势稍好，无绿 |
| 9 | 0.2 | 0.1 | 长势稍好，无绿 |
| 10 | 0.2 | 0.2 | 长势稍好，无绿 |
| 11 | 0.2 | 0.5 | 长势稍好，愈伤 |
| 12 | 0.5 | 0.02 | 粗壮，较高，叶绿 |
| 13 | 0.5 | 0.05 | 粗壮，高，叶绿、少根 |
| 14 | 0.5 | 0.1 | 粗壮，矮，根多 |
| 15 | 0.5 | 0.2 | 粗壮，矮，愈伤 |
| 16 | 0.5 | 0.5 | 粗壮，矮，愈伤 |
根据表1可以看出，对于大花葱外植体初代腋芽诱导培养，培养基成分为MS+6-BA0.5mg/L+NAA 0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0-9.0g/L，腋芽长势最好，利于后续组织培养。
实施例5
不同培养基对大花葱不定芽诱导的影响
试验设计：
不定芽诱导培养基：基本培养基为MS培养基，凝固剂为琼脂粉，用量为7.0-9.0g/L，蔗糖30g/L，培养基pH分装前调整为5.7-5.8，添加不同浓度6-BA和NAA，如表2所示。初代培养后，干净成活腋芽长至2cm左右后从基部与母体材料分开，切去上部绿色部分，将白色部分从中间切破，横卧接种到不定芽诱导培养基中进行不定芽诱导，统计诱导率，观察不定芽生长情况。
培养室温度为20±2℃，光照时间为10-12h/d，光照强度为20-35μmol·m-2·s-1，照明光源为5000K色温LED管状光源。
表2不同浓度6-BA和NAA对大花葱不定芽诱导的影响
| 处理 | 6-BA(mg/L) | NAA(mg/L) | 诱导率(％) |
| 1 | 0.5 | 0.05 | 0，芽正常 |
| 2 | 1.0 | 0.05 | ～50，不定芽数量少 |
| 3 | 1.5 | 0.05 | ～50，不定芽数量少 |
| 4 | 2.0 | 0.05 | ～100，不定芽较高 |
| 5 | 3.0 | 0.05 | ～100，芽矮小 |
| 6 | 5.0 | 0.05 | ～100，芽矮小 |
| 7 | 0.5 | 0.1 | 0，芽正常，有根 |
| 8 | 1.0 | 0.1 | ～56，芽数量少 |
| 9 | 1.5 | 0.1 | ～70，芽数量少 |
| 10 | 2.0 | 0.1 | ～100，芽较高高 |
| 11 | 3.0 | 0.1 | ～100，芽矮小 |
| 12 | 5.0 | 0.1 | ～100，芽矮小 |
| 13 | 0.5 | 0.2 | 0，芽矮，有愈伤 |
| 14 | 1.0 | 0.2 | ～50，芽数量少 |
| 15 | 1.5 | 0.2 | ～60，芽数量少 |
| 16 | 2.0 | 0.2 | >90，芽正常，少愈伤 |
| 17 | 3.0 | 0.2 | ～100，芽矮小，有愈伤 |
| 18 | 5.0 | 0.2 | ～100，芽矮小，有愈伤 |
| 19 | 0.5 | 0.5 | 0，芽矮，有愈伤 |
| 20 | 1.0 | 0.5 | ～50，芽少，有愈伤 |
| 21 | 1.5 | 0.5 | ～50，芽少，有愈伤 |
| 22 | 2.0 | 0.5 | >90，有愈伤 |
| 23 | 3.0 | 0.5 | ～100，芽小，有愈伤 |
| 24 | 5.0 | 0.5 | ～100，芽矮小，有愈伤 |
根据表2可以看出，在不定芽诱导培养阶段，综合不定芽诱导率及长势，培养基成分为MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0-9.0g/L，诱导率较高，不定芽生长正常，且愈伤组织少。
实施例6
不同培养基对大花葱不定芽增殖的影响
试验设计：
不定芽增殖培养基：基本培养基为MS培养基，凝固剂为琼脂粉，用量为7.0-9.0g/L，蔗糖30g/L，培养基pH分装前调整为5.7-5.8，添加不同浓度6-BA和NAA，如表3所示。不定芽诱导完成后，形成丛生芽以3-5个丛生芽为单位，从基部纵向分开，切去过长叶片，保持不定芽高度2-3cm，接种到不定芽增殖培养基中进行增殖培养，统计增殖率，观察不定芽生长情况。
培养室温度为20±2℃，光照时间为10-12h/d，光照强度为20-35μmol·m-2·s-1，照明光源为5000K色温LED管状光源。
表3不同浓度6-BA和NAA对大花葱不定芽增殖的影响
根据表3可以看出，在不定芽增殖培养阶段，综合增殖系数、芽长势以及后续产业化生产成本，不定芽增殖培养基成分为MS+6-BA0.8mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0-9.0g/L，pH 5.7-5.8，即可达到最佳效果。
实施例7
不同培养基对大花葱鳞茎诱导的影响。
试验设计：
鳞茎诱导培养基：基本培养基为MS培养基，凝固剂为琼脂粉，用量为7.0-9.0g/L，培养基pH分装前调整为5.7-5.8，添加不同浓度6-BA、NAA和蔗糖，如表4所示。增殖培养的丛生不定芽以3-5个丛生芽为单位，从基部纵向分开，接种到鳞茎诱导培养基中进行培养，统计鳞茎诱导率，观察鳞茎大小。
培养室温度为20±2℃，光照时间为10-12h/d，光照强度为20-35μmol·m-2·s-1，照明光源为5000K色温LED管状光源。
表4不同浓度6-BA、NAA和糖对大花葱鳞茎诱导的影响
根据表4数据记载并结合正交分析及生产成本分析，在鳞茎诱导培养阶段，培养基成分为MS+6-BA 0.4mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖45g/L+琼脂7.0-9.0g/L，鳞茎诱导效果最佳，诱导率高，且生长性状良好。
实施例8
不同培养基对大花葱鳞茎膨大和生根的影响
试验设计：
鳞茎膨大和生根培养基：基本培养基为MS培养基，凝固剂为琼脂粉，用量为7.0-9.0g/L，培养基pH分装前调整为5.7-5.8，添加不同浓度6-BA、NAA和蔗糖，如表5所示。鳞茎诱导完成后，选择直径不小于3mm的鳞茎，从基部纵向单个与丛生鳞茎分开，接种到鳞茎膨大及生根诱导培养基中进行膨大和生根培养，统计生根率及生根数。
培养室温度为20±2℃，光照时间为10-12h/d，光照强度为20-35μmol·m-2·s-1，照明光源为5000K色温LED管状光源。
表5不同浓度NAA、活性炭和糖对大花葱鳞茎生根的影响
根据表5数据记载并结合正交分析及生产成本分析，以及后期组培苗移栽过程中清洗难易程度及移栽成活率，得出在鳞茎膨大和生根培养阶段，培养基成分为MS+NAA0.1mg/L+蔗糖45g/L+活性炭0.1g/L+琼脂7.0-9.0g/L，生根效果最好。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种大花葱组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
以大花葱鳞茎为起始材料采集外植体，经初代培养、不定芽诱导及增殖培养、鳞茎诱导培养、鳞茎膨大及生根培养，获得鳞茎生根组培苗；
所述大花葱鳞茎剥开外部1-2层鳞片，切除其他部分，保留鳞茎下部带茎盘1/3部分为外植体；所述外植体从中间纵向剖开，以茎盘相连2-3层相邻鳞片为单元，将材料分割成高1-2cm，鳞片上部宽0.8-1.2cm的组织，接种培养；
初代培养基配方为：MS+6-BA 0.1-0.2mg/L+NAA 0.02-0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0-9.0g/L，pH 5.7-5.8；或MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.02-0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0-9.0g/L，pH 5.7-5.8；
不定芽诱导培养基配方为：MS+6-BA 1.0-5.0mg/L+NAA 0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0-9.0g/L，pH 5.7-5.8；或MS+6-BA 1.0-5.0mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0-9.0g/L，pH 5.7-5.8；或MS+6-BA 1.0-1.5mg/L+NAA 0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0-9.0g/L，pH 5.7-5.8；
不定芽增殖培养基配方为：MS+6-BA 0.2-2.0mg/L+NAA 0.05-0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0-9.0g/L，pH 5.7-5.8；
鳞茎诱导培养基配方为：MS+6-BA0.2-2.0mg/L+NAA0.05-0.2mg/L+蔗糖40-60g/L+琼脂7.0-9.0g/L，pH 5.7-5.8；
鳞茎膨大及生根培养基配方为：MS+NAA 0.1-0.5mg/L+蔗糖40-60g/L+活性炭0.1-0.5g/L+琼脂7.0-9.0g/L，pH 5.7-5.8。
2.根据权利要求1所述的大花葱组织培养方法，其特征在于，所述外植体进行消毒处理，包括70-75％酒精浸泡20-40s，0.5-1.0％次氯酸钠溶液浸泡8-15min，无菌水冲洗3-4遍。
3.根据权利要求1所述的大花葱组织培养方法，其特征在于，所述初代培养包括：切去外植体鳞片上部1-2mm组织，侧卧接种在初代培养基培养。
4.根据权利要求1所述的大花葱组织培养方法，其特征在于，所述不定芽诱导及增殖培养包括：初代培养腋芽长至1-3cm后从基部与母体材料分开，切去上部绿色部分，将白色部分从中间切破，横卧接种到不定芽诱导培养基中进行培养；诱导形成丛生芽以3-5个丛生芽为单位，从基部纵向分开，短切至不定芽高度2-3cm，接种到不定芽增殖培养基中进行培养。
5.根据权利要求1所述的大花葱组织培养方法，其特征在于，所述鳞茎诱导培养包括：增殖培养的丛生不定芽以3-5个丛生芽为单位，从基部纵向分开，接种到鳞茎诱导培养基中进行培养。
6.根据权利要求1所述的大花葱组织培养方法，其特征在于，所述鳞茎膨大及生根培养包括：选择直径不小于3mm的鳞茎，从基部纵向单个与丛生鳞茎分开，接种到鳞茎膨大及生根培养基中进行培养。
7.根据权利要求1所述的大花葱组织培养方法，其特征在于，所述组织培养过程温度20±2℃，光照周期10-12h/d，光照强度20-35μmol·m-2·s-1。
8.根据权利要求1所述的大花葱组织培养方法，其特征在于，还包括组培苗的驯化移栽：选择直径大于5mm、基部长出2-3条1-2cm不定根的鳞茎进行温室育球；移栽鳞茎保留2-3cm高，剪去上部叶片后，栽入基质中，相对湿度60％以上，培养温度15-25℃，光照强度2000-4000Lx培养。
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