CN110972938A - 一种快速繁殖黄精试管苗的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速繁殖黄精试管苗的方法,具体步骤如下:以黄精授粉后15~20d的花朵为外植体,实验室消毒后取出幼胚,置于愈伤组织诱导培养基上,将诱导出的愈伤组织进一步增殖后,转入分化培养基分化出不定芽,最后将不定芽进行壮苗生根培养,形成黄精组培苗。本发明可直接用于工厂化规模化的种苗生产,具有污染少,增殖速度快,变异率低,种苗整齐健壮,生产成本低,运输方便,移栽成活率高等优势。
Description
技术领域
本发明属于植物栽培技术,具体涉及一种快速繁殖黄精试管苗的方法。
背景技术
黄精(Polygonatum sibiricum),又名:鸡头黄精、黄鸡菜、笔管菜、为百合科黄精属植物,黄精的根状茎富含多种甾体皂甙和黄精低聚糖,具有养阴补气、润肺、益肾、健脾等功效,常用于脾胃虚弱、体倦乏力、口干食少、肺虚燥咳、精血不足、内热消渴的作用,同时,黄精性味甘甜,食用爽口。其肉质根状茎肥厚,含有大量淀粉、糖分、脂肪、蛋白质、胡萝卜素、维生素和多种其他营养成分,生食、炖服既能充饥,又有健身之用,可令人气力倍增、肌肉充盈、骨髓坚强,对身体十分有益。黄精根状茎形状有如山芋,山区老百姓常把它当作蔬菜食用,另外,黄精还具有较好的观赏价值,因此黄精集药用、食用、观赏于一身,具有极高的市场前景,随着多花黄精的药用价值和保健价值被人们认识,对于多花黄精原料的需求量也越来越大,价格也不断上扬,从而导致了山区农民对野生多花黄精的大量掠夺性的采挖,使得多花黄精自然资源迅速枯竭,给多花黄精的开发利用和可持续发展带来不利影响。
与此同时,由于多花黄精在生产上大多采用了分根繁殖,繁殖系数低,种根茎用量大,既不经济又限制了多花黄精的规模化种植,而且长期的分根繁殖很容易引起多花黄精品种的退化,尤其是其活性有效成分的改变。种苗生产的问题已经成为多花黄精人工大面积种植的一大瓶颈。利用植物组织培养的方式进行黄精种苗快速繁殖,具有很好的市场前景。
发明内容
发明目的:针对上述现有技术,本发明提供一种快速繁殖黄精试管苗的方法。
技术方案:本发明所述的一种快速繁殖黄精试管苗的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)采集黄精开花的花朵,清洗后带入接种室,超净工作台上,去除花瓣,仅保留子房部分,消毒待用;
(2)将步骤(1)得到的无菌子房在超净工作台上,用解剖刀切出幼胚,接入愈伤组织诱导培养基,前10~15天给予暗培养,之后光照度为1000-1500勒克斯、光照时间11~13h/d,25-30d后幼胚萌发并被诱导成愈伤组织;
(3)将步骤(2)得到的黄精幼胚诱导形成的愈伤组织接种到固体增殖培养基中,在25~28℃、光照度1000~1500勒克斯、光照时间11~13h/d的条件下培养20-25d;
(4)将步骤(3)中得到的黄精愈伤组织接种到分化培养基中,在25~28℃、光照度1000~1500勒克斯、光照时间11~13h/d的条件下培养60~70天,黄精愈伤组织分化形成完整的不定芽;
(5)将步骤(4)得到的黄精的完整不定芽在超净工作台上单个分开,转接到壮苗培养基中培养50~60d,不定芽形成完整健壮的小苗,根茎膨大,直径达2~3mm;
(6)于春季3-5月,将步骤(5)得到的黄精小苗移入温室内驯化培养10d,然后将其从瓶内取出用清水冲洗去除培养基后,移置铺有栽培基质的苗床上。
一般情况下,经过步骤(3)培养后,愈伤组织达到0.6-0.8cm,且质地较硬,表面呈现绿色,易于分化。
经过步骤(4)培养后,黄精愈伤组织分化形成完整的不定芽,每个愈伤组织块形成5~8个不定芽。
经过步骤(5)培养后,不定芽形成完整健壮的小苗,苗高5~7cm,根茎膨大至直径2~3mm,根4~5条,可以用于驯化移栽。
作为另一个技术方案,为了缩短黄精组培苗的获取时间,省略步骤(3)。
作为另一个技术方案,为了获取更多的黄精组培苗,重复步骤(3)。
步骤(1)中,所述黄精开花的花朵是指开花15~20d的花朵。
步骤(1)中,所述花朵的清洗是指:先用去污剂清洗再用流水冲洗。其中,所述去污剂是指浓度为2%的NaClO。具体可以先用去污剂清洗10min,再用流水冲洗10min。
步骤(1)中,所述子房部分的消毒是指:先用75%酒精浸泡45~60s,再用消毒剂浸泡5min,无菌水冲洗3~5次。其中,所述消毒剂是2%的NaClO。
步骤(2)中,所述愈伤组织诱导培养基组成为:2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)0.5~1.0mg/L+蔗糖25~30g/L+1/2MS培养基+琼脂5~7g/L+pH 5.4~5.8。优选的,所述的愈伤组织诱导培养基组成为:2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)0.8mg/L+蔗糖30g/L+1/2MS培养基+琼脂6g/L+pH 5.6。
步骤(3)中,所述愈伤组织继代增殖培养基组成为:吲哚丁酸(IBA)0.5~1.0mg/L+6-苄氨基嘌呤(6-BA)1~2mg/L+蔗糖25~30g/L+1/2MS培养基+麦芽提取物1~2g/L+琼脂5~7g/L+pH 5.4~5.8。优选的,所述的增殖培养基组成为:吲哚丁酸(IBA)0.8mg/L+6-苄氨基嘌呤(6-BA)1.5mg/L+蔗糖30g/L+1/2MS培养基+麦芽提取物1g/L+琼脂6g/L+pH 5.6。
步骤(4)中,所述的分化培养基组成为:吲哚丁酸(IBA)0.2~0.4mg/L+6-苄氨基嘌呤(6-BA)1.5~2.5mg/L+蔗糖25~30g/L+1/2MS培养基+琼脂5~7g/L+pH5.4~5.8。优选的,所述的愈伤组织分化培养基为:吲哚丁酸(IBA)0.3mg/L+6-苄氨基嘌呤(6-BA)2.0mg/L+蔗糖30g/L+1/2MS培养基+琼脂6g/L+pH 5.6。
步骤(5)中,所述的壮苗培养基组成为:萘乙酸(NAA)0.1~0.3mg/L+香蕉汁60~80g/L+white培养基+琼脂5~7g/L+pH5.4~5.8。优选的,所述的壮苗生根培养基组成为:萘乙酸(NAA)0.2mg/L+香蕉汁80g/L+white培养基+琼脂6g/L+pH5.6。
有益效果:本发明针对现有技术中黄精种苗常规繁殖通常采用根茎繁殖,长期采用根茎繁殖易感染病毒,通过根茎组培繁苗不能去除病毒,同时以根茎为外植体进行组培消毒困难,污染率高,以种子为外植体进行组培快繁可以去除病毒,但黄精种子休眠严重,需通过低温沙藏才能打破体眠,而沙藏时种子又易腐烂等等技术问题,本发明以黄精幼胚为外植体,在愈伤组织诱导培养基上诱导愈伤组织,将诱导出的愈伤组织进一步增殖后,转入愈伤组织分化培养基上培养分化出黄精不定芽,再将黄精不定芽进行壮苗生根培养,最后形成黄精组培苗。本发明利用黄精幼胚作为外植体可以去除黄精因长期营养繁殖积累的病毒,同时又不受种子休眠的影响,在壮苗培养阶段,又使黄精根茎膨大,大幅度提高了黄精组培苗移栽成活率,因此本发明可直接用于黄精种苗工厂化规模化生产。
具体实施方式
根据下述实施例,可以更好地理解本发明。
实施例1:一种快速繁殖黄精试管苗的方法,该方法包括以下步骤:
(1)采集开花15~20d的花朵,用去污剂清洗10min,再用流水冲洗10min,带入接种室,超净工作台上,去除花瓣,仅保留子房部分,75%酒精浸泡45~60s,用消毒剂浸泡5min,无菌水冲洗3次。
(2)将步骤(1)得到的无菌子房在超净工作台上,用解剖刀切出幼胚,接入愈伤组织诱导培养基,前15天给予暗培养,以后光照度为1000-1500勒克斯、光照时间12h/d;30d后幼胚萌发并被诱导成愈伤组织,在所述的固体培养基组成为:2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)0.5~1.0mg/L+蔗糖25~30g/L+1/2MS培养基+琼脂5~7g/L+pH 5.4~5.8。
(3)将步骤(2)得到的由黄精幼胚诱导形成的愈伤组织接种到固体增殖培养基中,在25~28℃、光照度1000~1500勒克斯、光照时间12h/d的条件下培养25d,愈伤组织达到0.6-0.8cm,且质地较硬,表面呈现绿色,易于分化;其中,所述的愈伤组织继代增殖培养基组成为:吲哚丁酸(IBA)0.5~1.0mg/L+6-苄氨基嘌呤(6-BA)1~2mg/L+蔗糖25~30g/L+1/2MS培养基+麦芽提取物1~2g/L+琼脂5~7g/L+pH 5.4~5.8。
(4)将步骤(3)中得到的黄精愈伤组织接种到分化培养基中,在25~28℃、光照度1000~1500勒克斯、光照时间12h/d的条件下培养60天,黄精愈伤组织分化形成完整的不定芽,每个愈伤组织块形成5~8个不定芽,其中,所述的分化培养基组成为:吲哚丁酸(IBA)0.2~0.4mg/L+6-苄氨基嘌呤(6-BA)1.5~2.5mg/L+蔗糖25~30g/L+1/2MS培养基+琼脂5~7g/L+pH 5.4~5.8。
(5)将步骤(4)得到的黄精的完整不定芽在超净工作台上单个分开,转接到壮苗培养基中进行培养60d,不定芽形成完整健壮的小苗,苗高5~7cm,根茎膨大至直径2~3mm,根4~5条,可以用于驯化移栽,其中所述的壮苗培养基组成为:萘乙酸(NAA)0.1~0.3mg/L+香蕉汁60~80g/L+white培养基+琼脂5~7g/L+pH5.4~5.8。
(6)春季3-5月,将步骤(4)得到的黄精小苗移入温室内驯化培养10d,然后将其从瓶内取出用清水冲洗去除培养基后,移置铺有栽培基质的苗床上。
实施例2:
与实施例1基本相同,步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)、步骤(5)中愈伤组织诱导,愈伤组织增殖培养、愈伤组织分化、壮苗生根培养四个阶段分别以表1所列培养基组合进行筛选,以优选最适培养基组合配方。表1说明如下:
针对生产,不同的培养阶段设计了培养基配方,幼胚愈伤组织诱导阶段主要观察愈伤组织诱导的快慢、质地、颜色(浅绿为佳)等指标判断配方是否合理;愈伤组织增殖阶段主要观察愈伤组织增不停地的快慢、质地、颜色(浅绿为佳)等指标判断配方是否合理;愈伤组织分化阶数段主要观察愈伤组织分化不定芽的能力、不定芽的粗壮度、玻璃化程度(越低越好)、颜色等指标来判断配方的好坏;壮苗生根培养阶段,主要通过观察黄精小苗的生长势、生根效率,根的粗壮度、根茎膨大程度(越大越好)、玻璃化程度(越低越好)、颜色等指标来判断配方的好坏。通过观察和各项指标的测定,并用“★”和“☆”的多少代表配方的好坏,★越多表示越好,☆比★要低一个等次。
表1培养基配方筛选
试验表明,种子愈伤组织诱导阶段(步骤2)9种配方组合中,基础培养基和激素组合范围为2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)0.5~1.0mg/L+蔗糖25~30g/L+1/2MS培养基+琼脂5~7g/L+pH 5.4~5.8;在此范围内,培养25~30d,超过80%幼胚诱导出愈伤组织,愈伤组织诱导率率高、生长快且整齐性好,是较适宜的配方组合;愈伤组织增殖培养阶段(步骤3)18种配方组合中,基础培养基、激素组合范围为吲哚丁酸(IBA)0.5~1.0mg/L+6-苄氨基嘌呤(6-BA)1~2mg/L+蔗糖25~30g/L+1/2MS培养基+麦芽提取物1-2g/L+琼脂5~7g/L+pH 5.4~5.8,在此范围内,愈伤组织长势良好、生长速度快,培养20~25d,大部分愈伤组织直径达到0.6~0.8cm;愈伤组织分化阶段(步骤4)27种配方组合中,基础培养基、激素组合范围为吲哚丁酸(IBA)0.2~0.4mg/L+6-苄氨基嘌呤(6-BA)1.5~2.5mg/L+蔗糖25~30g/L+1/2MS培养基+琼脂5~7g/L+pH 5.4~5.8,在此范围内培养,愈伤组织不定芽分化率高,不定芽粗壮,颜色翠绿,是比较适宜的组合配方。壮苗生根培养阶段(步骤5),结果表明,萘乙酸(NAA)0.1~0.3mg/L+香蕉汁60~80g/L+white培养基+琼脂4.5~6g/L+pH5.4~5.8为优选培养基配方组合,培养50~60d后,苗长至高5~7cm,带有4~5条健壮的根,同时根茎膨大直径达2~3mm,可进行移栽。
实施例3:与实施例1基本相同,为了更快获得黄精组培苗,可以省略步骤3,即步骤2中培养得到的愈伤组织可以直接通过步骤4分化成苗。
实施例4:与实施例1基本相同,为了获得更多黄精组培苗,可以多次重复步骤3,即黄精愈伤组织可以通过重复步骤3的培养获得到更多愈伤组织,然后再通过步骤4分化成苗,便可以获得更多黄精种苗。
实施例5:实施例4为更好验证本方案的有益效果,将本方案与传统方案进行实验比较。
(1)在愈伤组织诱导阶段,采用相同消毒方法对外植体进行消毒,消毒后进行接种,每种培养基接种100个外植体,每瓶1个外植体,接种后,7d后统计污染率,40d后统计愈伤诱导率,同时记录出愈时间,本方案与传统方案对照结果如下:
表2不同方案对污染率和愈伤组织诱导的影响
序号 | 外植体 | 污染率 | 出愈时间 | 愈伤诱导率 |
本发明方案 | 幼胚 | 73% | 26 | 40.7% |
传统方案 | 块茎 | 34% | 19 | 63.6% |
(2)在壮苗生根阶段,将黄精分化苗接入本方案壮苗生根培养基和传统壮苗生根培养基,每种培养基接种10瓶,每瓶接种8株,培养60d,统计根茎直径,然后将小苗采用相同的方式驯化,并移栽入相同栽培基质,温室内统一管理,40d后统计成活率,两种方案的对照结果如下:
表3不同方案对黄精根茎膨大和移栽成活率的影响
序号 | 根茎平均直径 | 平均株高 | 移栽后成活率 |
本发明方案 | 3.4mm | 5.3cm | 88.75% |
传统方案 | 1.1mm | 3.7cm | 58.75% |
Claims (10)
1.一种快速繁殖黄精试管苗的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)采集黄精开花的花朵,清洗后带入接种室,超净工作台上,去除花瓣,仅保留子房部分,消毒待用;
(2)将步骤(1)得到的无菌子房在超净工作台上,用解剖刀切出幼胚,接入愈伤组织诱导培养基,前10~15天给予暗培养,之后光照度为1000-1500勒克斯、光照时间11~13h/d,25-30d后幼胚萌发并被诱导成愈伤组织;
(3)将步骤(2)得到的黄精幼胚诱导形成的愈伤组织接种到固体增殖培养基中,在25~28℃、光照度1000~1500勒克斯、光照时间11~13h/d的条件下培养20-25d;
(4)将步骤(3)中得到的黄精愈伤组织接种到分化培养基中,在25~28℃、光照度1000~1500勒克斯、光照时间11~13h/d的条件下培养60~70天,黄精愈伤组织分化形成完整的不定芽;
(5)将步骤(4)得到的黄精的完整不定芽在超净工作台上单个分开,转接到壮苗培养基中培养50~60d,不定芽形成完整健壮的小苗;
(6)于春季3-5月,将步骤(5)得到的黄精小苗移入温室内驯化培养10d,然后将其从瓶内取出用清水冲洗去除培养基后,移置铺有栽培基质的苗床上。
2.根据权利要求1所述的快速繁殖黄精试管苗的方法,其特征在于,为了缩短黄精组培苗的获取时间,省略步骤(3)。
3.根据权利要求1所述的快速繁殖黄精试管苗的方法,其特征在于,为了获取更多的黄精组培苗,重复步骤(3)。
4.根据权利要求1所述的快速繁殖黄精试管苗的方法,其特征在于,步骤(1)中,所述黄精开花的花朵是指开花15~20d的花朵。
5.根据权利要求1所述的快速繁殖黄精试管苗的方法,其特征在于,步骤(1)中,所述花朵的清洗是指:先用去污剂清洗再用流水冲洗,其中,所述去污剂是指浓度为2%的NaClO。
6.根据权利要求1所述的快速繁殖黄精试管苗的方法,其特征在于,步骤(1)中,所述子房部分的消毒是指:先用75%酒精浸泡45~60s,再用消毒剂浸泡5min,无菌水冲洗3~5次。
7.根据权利要求1所述的快速繁殖黄精试管苗的方法,其特征在于,步骤(2)中,所述愈伤组织诱导培养基组成为:2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)0.5~1.0mg/L+蔗糖25~30g/L+1/2MS培养基+琼脂5~7g/L+pH 5.4~5.8。
8.根据权利要求1所述的快速繁殖黄精试管苗的方法,其特征在于,步骤(3)中,所述愈伤组织继代增殖培养基组成为:吲哚丁酸(IBA)0.5~1.0mg/L+6-苄氨基嘌呤(6-BA)1~2mg/L+蔗糖25~30g/L+1/2MS培养基+麦芽提取物1~2g/L+琼脂5~7g/L+pH 5.4~5.8。
9.根据权利要求1所述的快速繁殖黄精试管苗的方法,其特征在于,步骤(4)中,所述的分化培养基组成为:吲哚丁酸(IBA)0.2~0.4mg/L+6-苄氨基嘌呤(6-BA)1.5~2.5mg/L+蔗糖25~30g/L+1/2MS培养基+琼脂5~7g/L+pH 5.4~5.8。
10.根据权利要求1所述的快速繁殖黄精试管苗的方法,其特征在于,步骤(5)中,所述的壮苗培养基组成为:萘乙酸(NAA)0.1~0.3mg/L+香蕉汁60~80g/L+white培养基+琼脂5~7g/L+pH5.4~5.8。
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YIN HONG等: ""Establishment of asexual line of Polygonaturm sibiricum Redoute."", 《SOUTHWEST CHINA JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCES》 * |
李莺等: ""黄精的组织培养与植株再生"", 《西北农业学报》 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JP2022160084A (ja) * | 2021-04-06 | 2022-10-19 | 懐化学院 | 黄精の急速繁殖方法 |
JP7274233B2 (ja) | 2021-04-06 | 2023-05-16 | 懐化学院 | 黄精の急速繁殖方法 |
CN115589949A (zh) * | 2022-11-24 | 2023-01-13 | 江西师范大学(Cn) | 一种多花黄精种子一步成苗及扩繁的组织培养方法 |
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CN110972938B (zh) | 2022-03-11 |
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