CN111328714A

CN111328714A - 一种虎舌红愈伤诱导及增殖方法

Info

Publication number: CN111328714A
Application number: CN202010268960.1A
Authority: CN
Inventors: 付双彬; 杨燕萍; 周庄; 应震; 徐婉
Original assignee: ZHEJIANG SUBTROPICAL CROPS RESEARCH INSTITUTE
Current assignee: ZHEJIANG SUBTROPICAL CROPS RESEARCH INSTITUTE
Priority date: 2020-04-08
Filing date: 2020-04-08
Publication date: 2020-06-26

Abstract

本发明涉及植物培养技术领域，具体设计一种虎舌红愈伤诱导的方法，以虎舌红成熟种子为材料接种于特定的诱导培养基和增殖培养基，6个月平均诱导率可达60%，1个月平均增殖率达200%。本发明为虎舌红的愈伤诱导和增殖提供了一种新的方法，该方法污染率低、效率高为虎舌红的保存、转化、生理生化等相关研究以及后续培养分化获得大量健壮组培苗奠定了基础。

Description

一种虎舌红愈伤诱导及增殖方法

技术领域

本发明涉及植物培养领域，具体地涉及一种虎舌红愈伤组织的诱导及增殖方法。

背景技术

虎舌红( Ardisia mamillata Hance) 是紫金牛科紫金牛属多年生常绿小灌木，其叶花果并美，通体长满了茸毛，在阳光的照射下，紫红色的叶和鲜红的果相映，折射出太阳七色光彩，给人带来喜庆吉祥的气氛，曾荣获“中国99昆明世界园艺博览会单项竞赛室内观叶植物大奖”。此外，虎舌红也是一种罕见的药用植物，全草有清热利湿、活血、止血止痛、祛腐生肌等功效。

虎舌红的常规繁殖有有性繁殖和无性繁殖两种。有性繁殖主要是种子繁殖，虎舌红虽能种子繁殖，但实生苗性状不稳定，易变异，难于保持母本的优良种质特性，也难于形成品种或品系。无性繁殖主要包括扦插繁殖和嫁接繁殖。但由于紫金牛属植物生长较缓慢，主、侧枝年生长量极其有限，因此用此方法扩大繁殖系数受到较大制约。所以常规繁殖无法满足当今虎舌红市场需要，而进行虎舌红的组织培养研究目前来说不失为一种最有效的途径，而有关虎舌红利用成熟种子诱导愈伤及增殖的技术还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种虎舌红愈伤组织的诱导方法，以解决现有技术中存在的上述问题。

本发明提供的技术方案如下：

1）采种：10月中旬或翌年4月底采集虎舌红成熟种子；

2）处理及消毒：取虎舌红种子水中清洗用手揉搓去掉外种皮，清洗干净后转至超净工作台依次用酒精、升汞灭菌处理，其中用75%(V/V)酒精浸泡1 min，转至0.1%(W/V) HgCl₂10 min后，无菌水漂洗3-5次，每次无菌水漂洗时间为1-3 min，而后获得消毒的虎舌红外植体。

3）愈伤组织诱导：取步骤2）已消毒的外植体接种于诱导培养基中，诱导培养基为MS添加4.0 mg·L^-1 2, 4-D、1.0 mg·L^-1 6-BA、30.0 g·L^-1蔗糖、7.5 g·L^-1琼脂，培养条件为：光照强度1200-2000 Lux，光照时间16 h·d^-1，温度 25±2 °C，pH=5.8。

4）愈伤组织增殖：取步骤3）所得的初代愈伤组织转接于继代增殖培养基中，继代增殖培养基为MS添加0.4 mg·L^-1 2, 4-D、0.1 mg·L^-1 6-BA、20.0 g·L^-1蔗糖、7.5 g·L^-1琼脂，培养条件为：光照强度1200-2000 Lux，光照时间16 h·d^-1，温度 25±2 °C，pH=5.8。

本发明的显著优点：

一、本发明方法以虎舌红成熟种子为外植体，在材料选取上较易获得，不会对母株产生伤害。

二、相对与芽、茎段等其它外植体，种子消毒成功率高，接种容易快捷，从而使污染率大大降低。

三、本发明采用的培养基构成使得愈伤组织诱导成功率及增殖率大大提高，6个月平均诱导率可达60%，1个月平均增殖率达200%，为虎舌红组培快繁和品种改良奠定基础，本发明方法可以为虎舌红的遗传转化及工厂化育苗提供技术支持。

附图说明

图1 虎舌红成熟种子。

图2 虎舌红成熟果实和搓去外种皮的种子。

图3 虎舌红愈伤诱导的启动，愈伤从种子珠孔出喷出实物图之一。

图 4 虎舌红愈伤愈伤诱导的启动，愈伤从种子珠孔出喷出实物图之二。

图 5 虎舌红愈伤组织的增殖实物图之一。

图 6 虎舌红愈伤组织的增殖实物图之二。

具体实施方式

实施例1外植体采集、处理及消毒；

培养基：MS基本培养基采用1986，北京高等教育出版社，陈正华主编的《木本植物组织培养及其应用》中的配方进行配制的；

培养基配制：基本培养基为MS，将蔗糖Su 30.0 g·L^-1和琼脂Ag 7.5 g·L^-1加热溶解，加入生长调节剂2, 4-D和6-BA，用温度测试范围0-80°C的pH仪和1 mol·L^-1 NaoH、1 mol·L^-1 HCl调节pH值为5.8，倒入250 mL规格的组培玻璃瓶（每瓶约100 mL）；

愈伤诱导培养基：MS + 2, 4-D 4.0 mg·L^-1 + 6-BA 1.0 mg·L^-1 + Su 30.0 g·L^-1+ Ag 7.5 g·L^-1；

虎舌红种子接种及愈伤诱导培养：取经上述处理好的种子接入培养基，利用无菌镊子将种子稍稍按入培养基中，保证珠孔平行且露出培养基。每瓶接种3粒，重复5次，在温度25±2 °C，光照强度2000 Lux，光照时间16 h·d^-1条件下培养，以6个月为周期统计愈伤诱导率。愈伤诱导率=发生愈伤组织的外植体数/接种外植体数×100%；

按照以上方法进行，虎舌红成熟种子愈伤诱导率达60%；

愈伤增殖培养基：MS + 2, 4-D 0.4 mg·L^-1 + 6-BA 0.1 mg·L^-1 + Su 20.0 g·L^-1+ Ag 7.5 g·L^-1；

愈伤的增殖培养：利用消毒的百分之一天平和无菌培养皿在超净工作台中称取2.0 g左右的愈伤组织（记录准确读数），而后放入增殖培养基上，每瓶接种1个，重复5次，在温度25±2 °C，光照强度2000 Lux，光照时间16 h·d^-1条件下培养，以1个月为周期统计愈伤增殖率。愈伤增殖率=（愈伤增殖后的质量-愈伤增殖前的质量）/愈伤增殖前的质量×100%；

按照以上方法进行，虎舌红成熟种子愈伤增殖率达200% ；

具体实施例的说明（非对本发明的限制）

愈伤诱导培养基激素浓度的选择

由于带有坚硬的种皮，愈伤的出现约在接种后6个月出现，愈伤从珠孔处喷出，呈白色透明状，有些后续的还会有植株出现；在所有处理中只有2, 4-D 4 mg·L^-1 + 6-BA 1mg·L^-1的组合中出现了愈伤，平均为60%，而几乎所有的组合都有萌发（未产生愈伤，而出现种子萌发）的出现。

表1 不同激素浓度对于虎舌红种子愈伤诱导和萌发

注：/表示未有愈伤产生。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明，因此无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

Claims

1.一种虎舌红愈伤诱导及增殖方法，其特征在于：所述诱导方法包括如下步骤：

（1）材料选取：采取生长健壮植株上无病害虫害的成熟种子；

（2）材料处理：取虎舌红种子水中清洗用手揉搓去掉外种皮，清洗干净后转至超净工作台依次用酒精、升汞灭菌处理，其中用75% (V/V)酒精浸泡1 min，转至0.1% (W/V) HgCl₂10 min后，无菌水漂洗3-5次，每次无菌水漂洗时间为1-3 min，而后获得消毒的虎舌红外植体；

（3）配制愈伤诱导培养基：以MS为基本培养基，添加4.0 mg·L^-12. 4-D、1.0 mg·L^-1 6-BA、30.0 g·L^-1蔗糖、7.5 g·L^-1琼脂；

（4）配制愈伤增殖培养基：以MS为基本培养基，添加0.4 mg·L^-1 2, 4-D、0.1 mg·L^-16-BA、20.0 g·L^-1蔗糖、7.5 g·L^-1琼脂。