CN105028208A - 一种走马胎愈伤组织诱导及组培苗快繁方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种走马胎愈伤组织诱导及组培苗快繁方法,采用走马胎种子无菌播种获得无菌植株,以无菌植株的茎段和芽进行愈伤组织诱导,通过愈伤组织分化成芽的途径可以快速获得大量芽,从而弥补一些植物组织培养阶段的丛生芽增殖系数低的缺陷。采用本发明方法可以在愈伤组织分化阶段快速增加走马胎的芽数,可在短时间内获得大量走马胎组培苗,从而降低培养成本,节约能耗。而且本方法操作简单,生产成本低,可工厂化生产走马胎的种苗,为走马胎可持续利用和保护生态环境多样性奠定基础。

Description

一种走马胎愈伤组织诱导及组培苗快繁方法
技术领域
本发明涉及植物生物技术领域,具体涉及一种走马胎愈伤组织诱导及组培苗快繁方法。
背景技术
走马胎(ArdisiagigantifoliaStapf)又名大叶紫金牛、走马风、豆收,为紫金牛科紫金牛属植物。全株药用,民间有“两脚行不开,不离走马胎”之说,具有活血化瘀、祛风湿、壮筋骨、止血生肌等功效,治疗风湿筋骨疼痛、跌打损伤、产后血瘀、痈疽溃疡等症。近年来,随着对走马胎化学成分和药理研究的不断深入,还含有显著的抗恶性肿瘤、抗血栓、抗炎、抗氧化等疗效的生物活性成分。走马胎的药用价值不断被挖掘,应用也越来越广,市场需求量不断增加。
走马胎为常绿小灌木,根茎粗壮,主要分布在广西、广东、江西等地,多生于海拔1300m以下的山谷、溪旁的疏、密林下潮湿处。目前,走马胎药材主要来源于野生资源,需要生长三年以上,周期长,且产量不高。在走马胎野生分布区,药农长期的采而不种,造成野生自然资源过度采挖,使得走马胎分布点越来越少,资源日渐匮乏。
随着走马胎供需矛盾日益尖锐,人工栽培势在必行。然而苗木供应紧张制约了走马胎的人工栽培。目前,走马胎的繁殖方式为扦插繁殖和种子繁殖,都难以提供大量种苗。主要由于以下两方面的原因:扦插繁殖存在母本数量少和繁殖系数低等问题;而种子繁殖则存在野生资源分散、成熟时间不一致造成种子采集困难等问题,且种子萌芽需要的时间长。植物组织培养具有不受时间和地点限制、繁殖系数高、可保持母本优良性状等特点,在植物种苗繁育上广泛应用。在走马胎组织培养研究过程中,由于走马胎为木本植物,取嫩芽为外植体时存在灭菌难等问题,而通过灭菌的种子在培养基上萌芽获得无菌植株,以其芽繁殖芽进行丛生芽诱导,存在增殖系数低、继代时间长等问题,造成培养成本高,严重阻碍了走马胎组培苗在人工栽培中的应用。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足,而提供一种走马胎愈伤组织诱导及组培苗快繁方法,通过走马胎愈伤组织诱导、分化成芽来提高走马胎出芽数量,该方法操作简单、稳定高效,并能大大降低组培苗的培养成本。
实现本发明目的的技术方案是:
一种走马胎愈伤组织诱导及组培苗快繁方法,包括以下步骤:
(1)在超净工作台上,将走马胎种子用75%乙醇溶液灭菌1min,无菌水清洗1次,再用0.1%升汞(HgCL2)溶液灭菌10min,无菌水清洗5次,放到灭菌过的滤纸上吸干水分,接入MS培养基上培养30~50d,种子萌芽,得到无菌植株;将无菌植株的茎段和芽接入愈伤组织诱导培养基上培养35~45d,诱导率为100%;
所述愈伤组织诱导培养基为:MS+2,4-D0.5mg/L+6-BA0.1mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5g/L,pH值为5.8;
(2)在超净工作台上,将走马胎的茎段和芽诱导得到愈伤组织切分成0.2cm×0.2cm小块,接入增殖培养基中培养30d,增殖系数为3.7~6.2;
所述增殖培养基为:MS+2,4-D0.5~2.0mg/L+6-BA0.1~0.5mg/L+TDZ0.5~2.0mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5g/L,pH值为5.8;
(3)在超净工作台上,取出步骤(2)中得到的愈伤组织切分成0.5cm×0.5cm小块,接入分化培养基中培养30d,分化率为100%,分化系数为4.2~13.7;
所述分化培养基为:MS+ZT0.5~3.0mg/L+IBA0.1~0.5mg/L+TDZ0.5~2.0mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5g/L,pH值为5.8;
(4)将步骤(3)中得到的芽切分成单芽,接入壮芽培养基中培养30~40d,芽长到2~5cm;
所述壮芽培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5g/L,pH值为5.8;
(5)将步骤(4)中得到的壮芽的基部切掉,接入生根培养基中培养45~55d,得到走马胎组培苗;
所述生根培养基为1/2MS+NAA2.0mg/L+6-BA0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5g/L,pH值为5.8。
所述愈伤组织诱导、增殖培养、分化培养、壮芽培养及生根培养阶段的培养条件是:培养温度为25±3℃,光照时间为12h/d,光照强度为2000Lx。
所述培养基中,2,4-D为2,4-二氯苯氧乙酸,6-BA为苄氨基嘌呤,TDZ为噻重氮苯基脲,ZT为玉米素,IBA为吲哚-3-丁酸,NAA为a-萘乙酸,试剂均为分析纯,水为超纯水。
所述培养基中附加TDZ对走马胎愈伤组织增殖和分化具有促进作用,在研究细胞分裂素(6-BA、KT、ZT)对走马胎愈伤组织分化影响试验中发现,ZT效果显著。
所述增殖系数为增殖后的体积与增殖前的体积的比值。
所述分化率是分化出芽的愈伤组织块数与总的愈伤组织块数比值;所述分化系数是愈伤组织分化出的芽数与愈伤组织块数的比值。
本发明走马胎愈伤组织诱导及组培苗快繁方法,采用走马胎种子无菌播种获得无菌植株,以无菌植株的茎段和芽进行愈伤组织诱导。愈伤组织为植物器官、组织脱分化的分生细胞经持续分裂增生成细胞团,是植物快繁的新手段。通过愈伤组织分化成芽的途径可以快速获得大量芽,从而弥补一些植物组织培养阶段的丛生芽增殖系数低的缺陷。
本发明的优点:采用本发明方法可以在愈伤组织分化阶段快速增加走马胎的芽数,可在短时间内获得大量走马胎组培苗,从而降低培养成本,节约能耗。而且本方法操作简单,生产成本低,可工厂化生产走马胎的种苗,为走马胎可持续利用和保护生态环境多样性奠定基础。
具体实施方式
实施例1
一种走马胎愈伤组织诱导及组培苗快繁方法,包括以下步骤:
(1)在超净工作台上,将走马胎种子用75%乙醇溶液灭菌1min,无菌水清洗1次,再用0.1%升汞(HgCL2)溶液灭菌10min,无菌水清洗5次,放到灭菌过的滤纸上吸干水分,接入MS培养基上培养40d,种子萌芽,得到无菌植株;将无菌植株的茎段和芽接入愈伤组织诱导培养基上培养40d,诱导率为100%;
所述愈伤组织诱导培养基为:MS+2,4-D0.5mg/L+6-BA0.1mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5g/L,pH值为5.8;
(2)在超净工作台上,将走马胎的茎段和芽诱导得到愈伤组织切分成0.2cm×0.2cm小块,接入增殖培养基中培养30d,增殖系数为3.7,愈伤组织为青色致密组织;
所述增殖培养基为:MS+2,4-D0.5mg/L+6-BA0.1mg/L+TDZ0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5g/L,pH值为5.8;
(3)在超净工作台上,取出步骤(2)中得到的愈伤组织切分成0.5cm×0.5cm小块,接入分化培养基中培养30d,分化率为100%,分化系数为4.2,芽较壮,叶色翠绿;
所述分化培养基为:MS+ZT0.5mg/L+IBA0.1mg/L+TDZ0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5g/L,pH值为5.8;
(4)将步骤(3)中得到的芽切分成单芽,接入壮芽培养基中培养30d,芽长到2~5cm;
所述壮芽培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5g/L,pH值为5.8;
(5)将步骤(4)中得到的壮芽的基部切掉,接入生根培养基中培养45d,得到走马胎组培苗;
所述生根培养基为1/2MS+NAA2.0mg/L+6-BA0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5g/L,pH值为5.8;
所述愈伤组织诱导、增殖培养、分化培养、壮芽培养及生根培养阶段的培养条件是:培养温度为25±3℃,光照时间为12h/d,光照强度为2000Lx。
实施例2
一种走马胎愈伤组织诱导及组培苗快繁方法,包括以下步骤:
(1)在超净工作台上,将走马胎种子用75%乙醇溶液灭菌1min,无菌水清洗1次,再用0.1%升汞(HgCL2)溶液灭菌10min,无菌水清洗5次,放到灭菌过的滤纸上吸干水分,接入MS培养基上培养40d,种子萌芽,得到无菌植株;将无菌植株的茎段和芽接入愈伤组织诱导培养基上培养40d,诱导率为100%;
所述愈伤组织诱导培养基为:MS+2,4-D0.5mg/L+6-BA0.1mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5g/L,pH值为5.8;
(2)在超净工作台上,将走马胎的茎段和芽诱导得到愈伤组织切分成0.2cm×0.2cm小块,接入增殖培养基中培养30d,增殖系数为6.2,愈伤组织为淡青色的稍疏松组织;
所述增殖培养基为:MS+2,4-D1.5mg/L+6-BA0.5mg/L+TDZ2.0mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5g/L,pH值为5.8;
(3)在超净工作台上,取出步骤(2)中得到的愈伤组织切分成0.5cm×0.5cm小块,接入分化培养基中培养30d,分化率为100%,分化系数为13.7,芽多,但芽很细小,叶色为青黄色;
所述分化培养基为:MS+ZT3.0mg/L+IBA0.5mg/L+TDZ2.0mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5g/L,pH值为5.8;
(4)将步骤(3)中得到的芽切分成单芽,接入壮芽培养基中培养40d,芽长到2~5cm;
所述壮芽培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5g/L,pH值为5.8;
(5)将步骤(4)中得到的壮芽的基部切掉,接入生根培养基中培养55d,得到走马胎组培苗;
所述生根培养基为1/2MS+NAA2.0mg/L+6-BA0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5g/L,pH值为5.8;
所述愈伤组织诱导、增殖培养、分化培养、壮芽培养及生根培养阶段的培养条件是:培养温度为25±3℃,光照时间为12h/d,光照强度为2000Lx。
实施例3
一种走马胎愈伤组织诱导及组培苗快繁方法,包括以下步骤:
(1)在超净工作台上,将走马胎种子用75%乙醇溶液灭菌1min,无菌水清洗1次,再用0.1%升汞(HgCL2)溶液灭菌10min,无菌水清洗5次,放到灭菌过的滤纸上吸干水分,接入MS培养基上培养40d,种子萌芽,得到无菌植株;将无菌植株的茎段和芽接入愈伤组织诱导培养基上培养40d,诱导率为100%;
所述愈伤组织诱导培养基为:MS+2,4-D0.5mg/L+6-BA0.1mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5g/L,pH值为5.8;
(2)在超净工作台上,将走马胎的茎段和芽诱导得到愈伤组织切分成0.2cm×0.2cm小块,接入增殖培养基中培养30d,增殖系数为5.8,愈伤组织为青黄色的紧密组织;
所述增殖培养基为:MS+2,4-D1.0mg/L+6-BA0.3mg/L+TDZ1.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5g/L,pH值为5.8;
(3)在超净工作台上,取出步骤(2)中得到的愈伤组织切分成0.5cm×0.5cm小块,接入分化培养基中培养30d,分化率为100%,分化系数为10.1,芽一般壮,叶色青绿色;
所述分化培养基为:MS+ZT2.0mg/L+IBA0.3mg/L+TDZ1.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5g/L,pH值为5.8;
(4)将步骤(3)中得到的芽切分成单芽,接入壮芽培养基中培养35d,芽长到2~5cm;
所述壮芽培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5g/L,pH值为5.8;
(5)将步骤(4)中得到的壮芽的基部切掉,接入生根培养基中培养50d,得到走马胎组培苗;
所述生根培养基为1/2MS+NAA2.0mg/L+6-BA0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5g/L,pH值为5.8;
所述愈伤组织诱导、增殖培养、分化培养、壮芽培养及生根培养阶段的培养条件是:培养温度为25±3℃,光照时间为12h/d,光照强度为2000Lx。

Claims (2)

1.一种走马胎愈伤组织诱导及组培苗快繁方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)在超净工作台上,将走马胎种子经灭菌处理后接入MS培养基上培养30~50d,种子萌芽,得到无菌植株;将无菌植株的茎段和芽接入愈伤组织诱导培养基上培养35~45d;
所述愈伤组织诱导培养基为:MS+2,4-D0.5mg/L+6-BA0.1mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5g/L,pH值为5.8;
(2)在超净工作台上,将走马胎的茎段和芽诱导得到愈伤组织切分成小块,接入增殖培养基中培养30d;
所述增殖培养基为:MS+2,4-D0.5~2.0mg/L+6-BA0.1~0.5mg/L+TDZ0.5~2.0mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5g/L,pH值为5.8;
(3)在超净工作台上,取出步骤(2)中得到的愈伤组织切分成小块,接入分化培养基中培养30d;所述分化培养基为:MS+ZT0.5~3.0mg/L+IBA0.1~0.5mg/L+TDZ0.5~2.0mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5g/L,pH值为5.8;
(4)将步骤(3)中得到的芽切分成单芽,接入壮芽培养基中培养30~40d;
所述壮芽培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5g/L,pH值为5.8;
(5)将步骤(4)中得到的壮芽的基部切掉,接入生根培养基中培养45~55d,得到走马胎组培苗;
所述生根培养基为1/2MS+NAA2.0mg/L+6-BA0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5g/L,pH值为5.8。
2.根据权利要求1所述的走马胎愈伤组织诱导及组培苗快繁方法,其特征在于:所述愈伤组织诱导、增殖培养、分化培养、壮芽培养及生根培养阶段的培养条件是:培养温度为25±3℃,光照时间为12h/d,光照强度为2000Lx。
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