CN108834893B - 一种红根野蚕豆组培快繁新方法 - Google Patents

一种红根野蚕豆组培快繁新方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种红根野蚕豆组培快繁新方法，包括外植体的选择、外植体的清洁与消毒、丛生芽诱导、丛生芽增殖及生根等步骤。本发明对红根野蚕豆的组培快繁技术展开了探索，确立了无菌材料的获得、丛生芽的诱导、丛生芽的增殖、丛生芽的生根等理想培养条件，最终成功建立了红根野蚕豆的组培快繁体系，为实现对红根野蚕豆野生资源的保护、栽培、对种苗的需求以及基因库的建立奠定了技术基础，解决野生红根野蚕豆野生资源过度开发、药材供应少和种植不成规模等问题。

Description

一种红根野蚕豆组培快繁新方法
技术领域
本发明涉及一种中药材的组培快繁方法，属于植物组织培养及中药材种植领域，特别涉及红根野蚕豆的组培快繁方法。
背景技术
红根野蚕豆(Centranthera grandiflora Benth)为玄参科胡麻草属草本植物，以全草入药，有散瘀止血；消肿止痛的功效，主要用于咯血；咳血；吐血；妇女闭经；内伤瘀血；中老年人风湿痹痛；筋骨痛；脑血栓；脑溢血；酒精肝；肠胃炎；咽喉炎；口腔溃疡；跌打损伤；妇科炎症；胃癌；肝癌等。主要分布于云南、贵州、广西等地，生于海拔800～1400m的石山灌丛草坡、路旁岩石处。目前本植物作为药材的来源基本为野生资源，少有人工种植。至2014年其红根野蚕豆就因市场药材供不应求价格迅猛增长，而野生资源以种子进行繁殖，其发芽周期长，发芽率极低，导致野生资源被过度采伐。虽然近年来不断有企事业单位进行人工种植，但限于种苗以及种植技术瓶颈，仍不能满足市场需求，本发明利用现代生物技术，对红根野蚕豆进行无性繁殖，可充分体现母本性状的优质性状，一方面可为种植市场提供充足的优质种苗，另一方面在一定程度保护野生资源被过度采挖，降低濒危风险。
发明内容
本发明针对以上所述现有技术的不足，发明了一种组分简单、操作简便、生产周期短、可为规模化种植短期内快速提供红根野蚕豆优质种苗的组培技术繁育方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
1.外植体的选择：将健壮植株，栽植于实验室内，每隔3天用75％多菌灵500倍液，于早上十点左右喷施5次以上，选取健壮无病虫害茎端10-20cm作为外植体；
2.外植体的清洁：将选取的外植体剪成约2-3cm大小的带芽(腋芽或顶芽)茎段，用饱和肥皂水溶液涮洗10-15min，后用自来水冲洗3-4次至无肥皂液残留，加适量水，再加2-3滴吐温-80，振摇10-15min，用自来水冲淋50-60min。
3.外植体的消毒：将清洗好的外植体倒出全部流动水，转移至超净工作台内，加入75％酒精振摇10-25s，无菌水涮洗2-3次，再加入饱和漂白粉溶液振摇15-20min，无菌水涮洗2-3次，最后加入0.1％升汞溶液+1滴吐温-80振摇7-8min，无菌水涮洗5-6次，用无菌纸吸去外植体表面水分。
4.丛生芽诱导培养：将消毒好的外植体剪去两端伤口至0.5-1.0cm大小带芽茎段，斜插于1/2WPM或1/4MS+NAA 0-0.1mg/L+6-BA 0.5-2.0mg/L+ZT0.01-0.1mg/L+活性炭0.5-1.0g/L的诱导培养基中，培养环境为温度25±2℃，光照强度1000-2000lux，单日光照时间为培养前15天为6h，15天后为12h的条件下培养，50天后丛生芽诱导率为70％-80％。
5.增殖培养：红根野蚕豆经诱导产生丛生芽后，将其丛生芽按节间剪成带芽小段，斜插于1/2WPM或1/4MS+6-BA 1.0-2.0mg/L+KT 2.0-4.0mg/L+硝酸银1.0μg/L+马铃薯30-50g/L+香蕉30-50g/L+活性炭0.5-1.0g/L的增殖培养基中，培养环境为温度25±2℃，光照强度3000-4000lux，单日光照时间为12h的条件下培养40天，丛生芽增殖倍数可达25-30倍。
6.生根培养：将增殖后的丛生芽切成具2-3芽茎段，直立插于1/2WPM+NAA0.5-2.0mg/L+IBA 0-2.0mg/L+烯效唑0.01-0.1mg/L+马铃薯30-50g/L+活性炭0.5-1.0g/L的生根培养基中，培养环境为温度25±2℃，光照强度3000-4000lux，单日光照时间为12h的环境下培养30天后，生根率为95％以上。
上述步骤4、5、6中，所用培养基均添加有25-30g/L的糖，和4.5-5g/L的琼脂，PH值5.8-6.0。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明所述的一种红根野蚕豆组培快繁新方法，外植体的采集时间为4月至10月，可采集周期长，经采集后可继续生长，到收获季节亦可同其他未采集的植株同时收获且不影响产量及品质；
(2)本发明所述的一种红根野蚕豆组培快繁新方法，组分简单，操作简便，成本低廉，繁育过程不受地域及季节限制；
(3)本发明所述的一种红根野蚕豆组培快繁新方法，繁殖速度快、繁殖率高。按一株红根野蚕豆植株计算，一株植株可采集20-40个外植体，经诱导培养50天，每代40天的增殖培养5代，以及30天的生根培养，可获得约300万组培生根苗，历时不到一年，若继续增殖培养，将可获得上千万甚至上亿株组培生根苗，可为规模化种植短期内提供大量种苗；(4)本发明所述的一种红根野蚕豆组培快繁新方法，属于用体细胞繁殖的无性繁殖范畴，能最大程度的保持亲本性状，相比传统的种子繁殖存在杂交变异的情况，更有利于药材优良性状的保存。
具体实施方式
实施例1
1.选择健康无病虫害的红根野蚕豆植株为外植体，剪取茎端10-20cm，剪成约2-3cm大小的带芽(腋芽或顶芽)茎段，用饱和肥皂水溶液涮洗15min，后用自来水冲洗3-4次至无肥皂液残留，加适量水，再加2-3滴吐温-80，振摇10min，用自来水冲淋60min。
2.将清洗好的外植体转至超净工作台内的无菌瓶中，加入75％酒精振摇15s，无菌水涮洗2次，再加入饱和漂白粉溶液振摇15min，无菌水涮洗2次，最后加入0.05％升汞溶液和1滴吐温-80，振摇8min，无菌水涮洗6次。
3.用无菌纸吸去外植体表面水分，剪去两端伤口至0.5-1.0cm大小带芽茎段，斜插于1/2WPM+NAA 0.05mg/L+6-BA 2.0mg/L+ZT 0.1mg/L+活性炭0.5g/L+糖25g/L+琼脂4.5g/L诱导培养基中，培养环境为温度25±2℃，光照强度1000-2000lux，单日光照时间为培养前15天为6h，15天后为12h，培养30天后，统计外植体灭菌率和丛生芽诱导率。
4.红根野蚕豆经诱导产生丛生芽后，将其丛生芽按节间剪成带芽小段，斜插于1/2WPM+6-BA 2.0mg/L+KT 2.0mg/L+硝酸银1.0μg/L+马铃薯50g/L+香蕉50g/L+活性炭0.5g/L+糖25g/L+琼脂4.5g/L的增殖培养基中，培养环境为温度25±2℃，光照强度3000-4000lux，单日光照时间为12h的条件下培养30天后，统计增殖倍数。
5.将增殖后的丛生芽切成具2-3芽茎段，直立插于1/2WPM+NAA1.0mg/L+IBA0.5mg/L+烯效唑0.05mg/L+马铃薯50g/L+活性炭0.5g/L+糖25g/L+琼脂4.5g/L的生根培养基中，培养环境为温度25±2℃，光照强度3000-4000lux，单日光照时间为12h的环境下培养30天后，统计生根率。
实施例2
1.选择健康无病虫害的红根野蚕豆植株为外植体，剪取茎端10-20cm，剪成约2-3cm大小的带芽(腋芽或顶芽)茎段，用饱和肥皂水溶液涮洗15min，后用自来水冲洗3-4次至无肥皂液残留，加适量水，再加2-3滴吐温-80，振摇10min，用自来水冲淋60min。
2.将清洗好的外植体转至超净工作台内的无菌瓶中，加入75％酒精振摇15s，无菌水涮洗2次，再加入饱和漂白粉溶液振摇15min，无菌水涮洗2次，最后加入0.05％升汞溶液和1滴吐温-80，振摇8min，无菌水涮洗6次。
3.用无菌纸吸去外植体表面水分，剪去两端伤口至0.5-1.0cm大小带芽茎段，斜插于1/4MS+NAA 0.02mg/L+6-BA 1.0mg/L+ZT 0.1mg/L+活性炭0.8g/L+糖30g/L+琼脂5.0g/L诱导培养基中，培养环境为温度25±2℃，光照强度1000-2000lux，单日光照时间为培养前15天为6h，15天后为12h，培养30天后，统计外植体灭菌率和丛生芽诱导率。
4.红根野蚕豆经诱导产生丛生芽后，将其丛生芽按节间剪成带芽小段，斜插于1/4MS+6-BA 1.0mg/L+KT 3.0mg/L+硝酸银1.0μg/L+马铃薯45g/L+香蕉45g/L+活性炭0.8g/L+糖30g/L+琼脂5.0g/L的增殖培养基中，培养环境为温度25±2℃，光照强度3000-4000lux，单日光照时间为12h的条件下培养30天后，统计增殖倍数。
5.将增殖后的丛生芽切成具2-3芽茎段，直立插于1/2WPM+NAA 0.5mg/L+IBA1.0mg/L+烯效唑0.05mg/L+马铃薯45g/L+活性炭0.8g/L+糖30g/L+琼脂5.0g/L的生根培养基中，培养环境为温度25±2℃，光照强度3000-4000lux，单日光照时间为12h的环境下培养30天后，统计生根率。
对比例1
本实施例的一种红根野蚕豆的组培方法，其基本步骤同专利CN107047320A中实施例1，具体为：
(1)外植体选择和预处理步骤：挑选种荚未开裂的大花胡麻草种子为起始材料，用75％酒精擦拭表面，将种子破壳取出后用作组织培养繁殖的外植体。将该外植体置于灭菌的1.5ml离心管中，加入1ml无菌水浸泡1-2h，待种子吸足水分后，1000rpm离心3-5min，倒掉上清液，在75％的酒精溶液中进行30-60s消毒处理，然后在重量体积比浓度为0.1％的升汞溶液中进行8-10min的杀菌处理，再用无菌水冲洗6-8次，完成对所述大花胡麻草种子的消毒灭菌处理。
(2)种子萌发培养步骤：在超净工作台上将种子接种于种子萌发培养基进行培养，培养在每天光照10-12h，光照强度为1500-2000LX以及温度为25℃±2℃的条件下进行，培养2-3周，获得无菌实生苗，其中种子培养基为在MS基本培养基中添加有蔗糖25g/L、活性炭0.6g/L、琼脂粉6.5g/L，并调节pH为5.8所得的培养基。
(3)实生苗分化增殖培养步骤：将萌发后1-2cm高的大花胡麻草无菌实生苗接种于增殖培养基，培养3-4周，获得组培丛芽，其中，增殖培养基为在WPM培养基中添加有6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)0.5mg/L、萘乙酸(NAA)0.05mg/L、活性炭0.6g/L、蔗糖25g/L以及琼脂粉6.5g/L，并调节PH至5.8所得的培养基。
(4)分割苗诱导生根培养步骤：将获得的组培丛芽中4-6cm长苗分割后接种于生根培养基中进行生根培养，其中所述生根培养基为在WPM培养基中添加萘乙酸(NAA)0.2mg/L，蔗糖25g/L以及活性炭0.6g/L、琼脂粉6.5g/L，并调节PH至5.8所得的培养基。
对比例2
本实施例一种红根野蚕豆组培快繁方法，其步骤包括：
(1)外植体选择与消毒：选择当年生健壮、无病虫害萌条为外植体，将外植体用0.3％洗衣粉浸泡10min，经自来水冲洗1h，然后在超净工作台上用75％的乙醇溶液浸泡30s，用无菌水冲洗2-3次，最后放入0.1％升汞溶液中消毒10min，用无菌水冲洗4次。
(2)丛生芽诱导：外植体消毒后，用无菌吸水纸吸干表明水分，切分并接种于诱导培养基WPM+ZT 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L+LH 500mg/L+蔗糖20g/L+琼脂粉4.5g/L中，培养温度25±2℃，光照强度3000-4000lux，单日光照时间为12h，培养30天后统计丛生芽诱导率，并将丛生芽切下进行转接培养增殖。
(3)丛生芽增殖培养：将诱导出的丛芽剪成1-2芽/节的小段，接种在增殖培养基WPM+ZT 1.5mg/L+NAA 0.15mg/L+LH 500mg/L+蔗糖20g/L+琼脂粉4.5g/L上，培养温度25±2℃，光照强度3000-4000lux，单日光照时间为12h，培养30天后统计丛生芽增殖倍数，并将丛生芽剪下转接至生根培养基。
(4)壮苗生根培养：丛生芽壮苗生根培养基为1/2WPM+IBA 1.0mg/L+AC 0.5g/L+蔗糖20g/L+琼脂粉4.5g/L，培养温度25±2℃，光照强度3000-4000lux，单日光照时间为12h，培养30天后统计生根率。
实施例1-2与对比例1-2培养结果如下：
Figure GDA0001723108900000071
对比以上结果可知，本发明具有较高的消毒灭菌率和丛生芽诱导率，本发明的丛生芽诱导率、增殖倍数显著优于现有技术，极大地降低成本，缩短组培时间。

Claims (2)

1.一种红根野蚕豆组培快繁新方法，其特征在于以下步骤和方法进行的：
(1)外植体的选择：将健壮植株，栽植于实验室内，每隔3天用75％多菌灵500倍液喷施5次以上，选取幼嫩带芽茎段；
(2)外植体的清洁消毒：将选取的外植体剪成带芽小段后用饱和肥皂水溶液涮洗后冲淋，在超净工作台上依次用酒精、漂白粉溶液及升汞溶液消毒；
(3)丛生芽诱导培养：将消毒好的外植体，去掉两端切至0.5-1.0cm带芽茎段，接种在以1/2WPM或1/4MS为基本培养基，添加NAA、6-BA、ZT、硝酸银、活性炭的诱导培养基上，在一定温度、光照强度和光周期环境下培养；
(4)丛生芽增殖培养：将诱导出的丛生芽剪成单芽，接种在以1/2WPM或1/4MS为基本培养基，添加6-BA、KT、马铃薯、香蕉、活性炭的增殖培养基上，在一定温度、光照强度和光周期的环境下培养；
(5)丛生芽生根培养：将增殖的无根苗，接种在以1/2WPM为基本培养基，添加NAA、IBA、烯效唑、活性炭和马铃薯的生根培养基上，在一定温度、光照强度和光周期的环境下培养；
其中，
步骤(2)中所述的外植体的最佳消毒方法为75％酒精消毒10-25s，饱和漂白粉溶液消毒20-30min，0.05％升汞溶液消毒7-8min；
步骤(3)中所述的丛生芽诱导培养基为1/2WPM或1/4MS+NAA 0.02-0.1mg/L+6-BA 0.5-2.0mg/L+ZT 0.01-0.1mg/L+活性炭0.5-1.0g/L，培养环境为温度25±2℃，光照强度1000-2000lux，单日光照时间为培养前15天为6h，15天后为12h的条件下培养；所述步骤(3)的培养基添加有糖25-30g/L，琼脂4.5-5g/L，PH值5.8-6.0；
步骤(4)中所述的丛生芽增殖培养基为1/2WPM或1/4MS+6-BA 1.0-2.0mg/L+KT 2.0-4.0mg/L+硝酸银1.0μg/L+马铃薯50-80g/L+香蕉40-60g/L+活性炭0.5-1.0g/L，培养环境为温度25±2℃，光照强度3000-4000lux，单日光照时间为12h的条件下培养；所述步骤(4)的培养基添加有糖25-30g/L，琼脂4.5-5g/L，PH值5.8-6.0；
步骤(5)中所述的丛生芽生根培养基为1/2WPM+NAA 0.5-2.0mg/L+IBA 0.5-2.0mg/L+烯效唑0.01-0.1mg/L+马铃薯30-50g/L+活性炭0.5-1.0g/L，培养环境为温度25±2℃，光照强度3000-4000lux，单日光照时间为12h的环境下培养；所述步骤(5)的培养基添加有糖25-30g/L，琼脂4.5-5g/L，PH值5.8-6.0。
2.根据权利要求1所述的一种红根野蚕豆组培快繁新方法，其特征在于步骤(1)所述的幼嫩带芽茎段为顶端健壮无病虫害植株顶端10-20cm，剪成2-3cm带芽茎段。
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Address after: No.2238, Beijing Road, Panlong District, Kunming City, Yunnan Province

Applicant after: INSTITUTE OF MEDICINAL PLANTS, YUNNAN ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES

Applicant after: Yunnan HaoChen Agriculture Co.,Ltd.

Address before: No.2238, Beijing Road, Panlong District, Kunming City, Yunnan Province

Applicant before: INSTITUTE OF MEDICINAL PLANTS, YUNNAN ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES

Applicant before: Yunnan Haochen Agricultural Technology Co.,Ltd.

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