CN112042537B - 一种白芨植株再生体系的建立方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物组织培养技术领域，涉及一种白芨植株再生体系建立的方法。其中包含以白芨成熟种子作为外植体，依次经过诱导种子萌发、诱导增殖、壮苗培养及诱导生根的建立白芨植株再生体系的过程。所述诱导种子萌发所用培养基为1/2MS基础中添加NAA和6‑BA；所述诱导增殖培养基是在1/2MS基础上添加GA3、NAA和活性炭；所述壮苗培养基是在改良MS基本培养基上添加了土豆泥和活性炭；所述诱导生根培养基是MS培养基上添加了NAA。本发明可解决白芨育苗周期长、组培育苗移栽成活率不高的问题，为降低成本、培育高品质、高产量、次生代谢产物含量高的药用植物品种奠定基础。

Description

一种白芨植株再生体系的建立方法

技术领域

本发明属于植株组织培养技术领域，涉及一种白芨植株再生体系的建立方法。

背景技术

白芨(Bletilla striata (Thunb. ex A. Murray) Rchb. f.)是兰科(Orchidaceae)白芨属(Bletilla)植物，是我国一种重要的珍稀药用植物。目前我国该属植物有4种，分别为白芨、小白芨、黄花白芨和华白芨，主要分布于我国长江流域及其以南各省区，全国主产地有贵州、四川、湖南、湖北、安徽、浙江、江苏等地。白芨药用部分为其干燥块茎，具有收敛止血、消肿生肌等功效，可用于治疗皮肤皲裂，疮疡肿毒，吐血、咳血，外伤出血等症状,从白芨中提取的天然多糖聚合物也可应用于医药活性材料。另外，由于白芨内含多糖活性成分可用于活血润肤，且作用温和、刺激小、安全性高等特点，目前已逐步成为化妆品新产品开发的热点。随着白芨应用市场的不断扩大，其市场供需矛盾也日益显著。

白芨能产生大量种子，其单个果荚内约有10~30万粒，然而白芨种子小且无胚乳，无法在自然状态下萌发，一般自然条件下靠分株繁殖。由于营养繁殖并非基于遗传意义上的重新开始，而是母体生长的延续，长此以往必然引起白芨资源品质退化。因此，适当采用种子繁殖尤为重要。

2002年，白芨已列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》附录一，属国家野生植物保护名录二级保护植物区系(第二批)。而目前药用植物中以生物技术为依托建立快繁体系的药用植物品种已有200-100种。以白芨种子为外植体，运用植物组织培养等生物技术进行白芨快繁实验研究受到越来越多研究人员的关注，白芨种子量大，繁殖系数可观，且用种子繁殖利于其优良品种选育及驯化，目前白芨植株再生体系建立研究结果较多，但在其品质质量、培养周期上无法突破。通过对白芨再生体系过程中大量元素及其添加物等的探究，优化集成白芨育苗壮苗两步培养法，提高后期炼苗驯化成活率，为兰科植物育苗质量低下、栽培成活率不高等问题提供技术理论参考依据，促进以生物技术为基础的生物多样性保护及生物种质资源的推广应用。

发明内容

本发明提供一种白芨植株再生体系的建立方法，通过植物组织培养的方法建立育苗周期短、高品质高质量的白芨植株再生体系。

本发明技术方案：

一种白芨植株再生体系的建立方法，包括以下步骤：

1）外植体灭菌及种子萌发的诱导：取授粉后20周的白芨蒴果，经灭菌后，切开蒴果取白芨种子，将所取的白芨种子接种于诱导萌发培养基中培养，获得萌发的白芨小苗；

2）白芨增殖诱导：将步骤1）获得的萌发白芨小苗转接到增殖培养基中进行培养，得到白芨丛生芽苗；

3）白芨壮苗培养：将步骤2）获得的白芨小苗转接于壮苗培养基中培养，得到白芨壮苗；

4）白芨生根诱导培养：将步骤3）获得的白芨壮苗转接于生根诱导培养基中培养，得到完整白芨植株；

完成白及植株再生体系的建立。

优选地，所述步骤1）中诱导种子萌发的培养基为1/2MS基础上添加了NAA（0.01mg/L ~2 mg/L）和6-BA（0.01 mg/L ~2 mg/L）。

进一步优选地，所述步骤1）中诱导种子萌发培养基中NAA浓度为1 mg/L，6-BA浓度为2 mg/L。

优选地，所述步骤2）诱导增殖培养基为1/2MS培养基添加了GA3(0.01~1.5mg/L)和NAA（0.01~1mg/L）及活性炭AC 0.2%。

进一步优选地，所述步骤2）诱导增殖培养基中NAA浓度为1.0 mg/L、GA3浓度1.0mg/L。

优选地，所述步骤3）壮苗培养基为MS基本培养基中的铵根离子（5 mmol/L~21mmol/L）、硝酸根离子(10 mmol/L~40 mmol/L、钾离子（0.01 mmol/L~40 mmol/L）、磷酸根离子（0.01 mmol/L~2.4 mmol/L）进行调整的改良MS培养基。

进一步优选地，所述步骤3）壮苗培养基中硝酸根离子浓度为19.72 mmol/L，铵根离子浓度为5.16 mmol/L，钾离子浓度为5 mmol/L，磷酸根离子浓度为1.2mmol/L。

所述的改良MS培养基中还添加有稀土元素硝酸铈（Ce(NO₃)₃），添加量为3μmol/L~60μmmol/L。

优选地，所述步骤改良MS壮苗培养基中Ce(NO3)3的添加量为30μmol/L 。

优选地，所述步骤3）壮苗培养基中添加了0. 1~15%土豆泥。

进一步优选地，所述步骤3）壮苗培养基中土豆泥质量浓度为10%。

使用厨用搅拌机将去皮土豆破碎，配制时按照实验设计加入培养基中。土豆泥中富含丰富的有机物质，如细胞分裂素、细胞生长素、酶、氨基酸等，其主要作用为植物生长提供一些生理活性物质，对离体植物培养中细胞分裂分化和生长发育有明显促进作用。

优选地，所述步骤3）壮苗培养基为MS培养基添加了0.01~0.1%活性炭。

进一步优选地，所述步骤3）壮苗培养基中活性炭浓度为0.03%。

优选地，所述步骤4）生根诱导培养基为MS培养基中添加NAA浓度为0.01mg/L~0.4mg/L。

进一步优选地，所述步骤4）生根培养基中添加NAA浓度 0.2 mg/L。

所述步骤2）中增殖诱导培养时间为30-40天，白芨小苗诱导增殖形成具有原球茎组织块的白芨丛生芽苗；

所述步骤3）中壮苗培养时间为40~50天，白芨小苗培养形成球茎膨大、叶片浓绿的白芨苗，球茎平均可达4mm；

所述步骤4）中生根诱导时间为30~40天，白芨生根率可达95%，根粗苗壮。

本发明有益效果：

1、本发明提供了一种白芨再生体系的建立方法。该方法以白芨成熟种子为外植体，通过细胞分裂素和生长素的优化组合，使白芨种胚直接诱导获得丛生植株。通过壮苗培养基中大量元素氮磷钾含量的优化调整，微量稀土元素和土豆泥的添加，能够提高白芨组培再生植株原球茎的生长量、缩短壮苗时间及育苗周期，且具有再生植株变异小及遗传稳定性高的优点。本发明缩短了白芨育苗周期，提高了白芨组培育苗品质和繁殖系数，也为该物种的遗传改良奠定了良好的基础。

2、本发明白芨培育周期在120-160天左右，再生植株移栽成活率达90%。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明：

图1 白芨种子诱导萌发。

图2 白芨小苗的丛生芽诱导。

图3不同形态氮对白芨壮苗的影响。

注：①铵态氮浓度 5.16Lmmol/L、硝态氮浓度 19.72 mmol/L处理下培养白芨苗生长状态；②：铵态氮浓度 10.31mmol/L，硝态氮浓度 19.72mmol/L处理下培养白芨苗生长状态；③：铵态氮浓度 15.47mmol/L，硝态氮浓度 29.58mmol/L处理下培养白芨苗生长状态；④：铵态氮浓度 20.63mmol/L，硝态氮浓度 9.86mmol/L处理下培养白芨苗生长状态。

图4 不同浓度钾离子对壮苗的影响。

注：①为在钾离子浓度为 5 mmol/L处理下培养白芨苗生长形态；②在钾离子浓度10 mmol/L处理下培养白芨苗生长形态；③为在钾离子浓度30 mmol/L处理下中培养白芨苗生长状态。

图5不同浓度磷酸根对壮苗的影响。

注：①为在磷元素含量0.01mmol/L培养基上白芨苗生长状态；②为在磷元素含量为 1.2mmol/L培养基上培养的白芨苗生长状态；③在磷元素含量2.4mmol/L培养基上培养的白芨苗生长状态。

图6 不同浓度土豆泥和活性炭对壮苗影响。

注：①为土豆泥添加量为0.1%，活性碳AC的添加0.01%处理下白芨苗的生长状态；②为土豆泥添加量为10%，活性碳AC的添加0.03%处理下白芨苗的生长状态。

图7 0.2mg/L处理下NAA诱导生根。

具体实施方式

下面结合实施例来进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。

实施例1

MS基本培养基：可参照文献（Murashige T, Skoog F. A revised medium forrapid grouth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant,1962, 15: 473-497）配制。

一种白芨植株再生体系的建立方法，包含以下步骤：

(1) 外植体的灭菌：采摘白芨授粉20周未开裂的蒴果作为无菌组织培养的外植体材料，首先用流水冲洗30 min，后于超净工作台用75%酒精和0.1%升汞溶液进行消毒处理。具体方法为：75%酒精浸泡蒴果1 min后，无菌水冲洗3次；0.1%升汞溶液先浸泡消毒18 min(先浸泡10 min后，在换新的升汞溶液浸泡8 min)，后用无菌水冲洗6次。

（2）白芨种子萌发的诱导

在超净工作台内，将灭菌后的蒴果置于无菌吸水纸上吸干残留水分，在无菌平皿内用解剖刀划开蒴果外壳，使蒴果一分为二，用镊子沾取灭菌的白芨种子于添加有NAA(0.01~2.0 mg/L)和6-BA(0.01~2.0 mg/L)的1/2MS培养基上，蔗糖浓度3%，琼脂浓度7%，pH5.8，培养温度25±2℃，光照强度2000 LX，光照时间14 h/d。

在优选的NAA 1.0mg/L和6-BA 2.0mg/L的组合中，授粉20周后采收的种子在接种14d左右开始萌发转绿，20d左右萌发率达95%以上，20d-30d萌发小苗可达5mm-10mm（如图1）。

(3) 白芨萌发小苗的增殖诱导

将步骤(2)萌发的白芨小苗接种至诱导增殖培养基中培养，所述增殖培养基为1/2MS培养基添加了GA3(0.01~1.5mg/L)和NAA（0.01~1mg/L）及活性炭AC 0.2%。

在优选的NAA的浓度1.0 mg/L和GA3的浓度1 .0mg/L组合的诱导增殖培养基中，白芨幼苗的原球茎增殖效果最好，75%幼苗能够诱导出健壮的丛生芽（图2）。

（4）白芨组培苗的壮苗培养

所述壮苗培养基是将MS基本培养基中氮、磷、钾含量调整为铵根离子（5 mmol/L~21 mmol/L）、硝酸根离子(10 mmol/L~40 mmol/L)、钾离子（0.01 mmol/L~40 mmol/L）、磷酸根离子（0.01 mmol/L~2.4 mmol/L），并在此基础上添加土豆泥（0.01~15%）和活性炭（0.001-0.1%）的改良MS培养基。

将步骤（3）中获得的丛生芽苗接种至壮苗培养基中，以白芨芽苗和原球茎的生长量为主要评价指标，优选硝酸根离子最佳浓度约为19.72 mmol/L，铵根离子最佳浓度约为5.16 mmol/L，此条件下白芨苗球茎生长量可达4 mm左右，平均株高达40~50 mm，生根量平均为5（如图3）。

优选钾离子附加浓度为5 mmol/L，此条件下白芨苗平均株高71 mm，球茎生长量均值为5.0 mm（如图4）。

优选的磷酸根离子附加浓度为1.2mmol/L。在此浓度下白芨株高平均可达30 mm以上，球茎可达1.9~3.5 mm（如图5）。

附加不同浓度土豆泥和活性碳的壮苗培养基中培养30d，。优选的最适于白芨壮苗培养阶段的土豆泥添加浓度为10％，活性炭浓度为0.03％。此时白芨地下球茎生长速度较快，丛生芽接种后生长状态良好，叶片浓绿，生根状态较好（如图6）度。

（5）白芨的生根诱导

所述生根培养基是在MS基础上添加NAA0.01~0.4mg/L。

将经过壮苗培养的白芨苗转入诱导生根培养基中，当优选的NAA为0.2 mg/L时，白芨生根效果最好，此时白芨根苗粗壮，长势好，且再生植株生长整齐(图7)。

（6）炼苗和移栽

将步骤（5）中得到的再生植株进行炼苗，移植。炼苗方法为：待再生植株球茎达到5mm及以上、株高达到5cm以上，将再生植株从培养瓶中移至缓冲间培养，逐步打开组培瓶盖，使再生植苗与空气接触，在20-25℃下炼苗5天，取出再生苗，移栽至装有混合基质的花盆中，浇透水置于温棚中培养。

上述的实施例仅为本发明的优选技术方案之一，而不应视为对于本发明的限制，本申请中的实施例及实施例中的特征在不冲突的情况下，可以相互任意组合。本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围。即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种白芨植株再生体系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）外植体灭菌及种子萌发的诱导：将灭菌后的蒴果置于无菌吸水纸上吸干残留水分，在无菌平皿内用解剖刀划开蒴果外壳，使蒴果一分为二，用镊子沾取灭菌的白芨种子于添加有NAA 1.0 mg/L和6-BA 2.0 mg/L的1/2MS培养基上，蔗糖浓度3%，琼脂浓度7%，pH 5.8，培养温度25±2℃，光照强度2000 LX，光照时间14 h/d，授粉20周后采收的种子在接种14d左右开始萌发转绿，20d-30d获得萌发的白芨小苗；

（2）白芨增殖诱导：将步骤（1）获得的萌发白芨小苗转接到增殖培养基中进行培养，诱导增殖培养基是在1/2MS培养基添加了1.0 mg/L的NAA、1 .0mg/L的GA3、0.2% 的AC，得到白芨丛生芽苗；

（3）白芨壮苗培养：将步骤（2）获得的白芨小苗转接于壮苗培养基中培养，得到白芨壮苗；壮苗培养基是对MS基本培养基配方中的铵根离子的浓度为5.16mmol/L、硝酸根离子的浓度为19.72 mmol/L、钾离子的浓度为5 mmol/L、磷酸根离子的浓度为1.2 mmol/L，硝酸铈Ce(NO₃)₃的浓度为30μmol/L，并在此基础上添加10%的土豆泥和0.03%的活性炭改良MS培养基；

（4）白芨生根诱导培养：将步骤（3）获得的白芨壮苗转接于生根诱导培养基中培养，生根诱导培养基为MS培养基中添加NAA的浓度为0.2 mg/L，得到完整白芨植株；完成白及植株再生体系的建立。

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