CN117561982B - 一种用于腐生兰毛萼山珊瑚无菌培养的培养基组及其应用和培养方法 - Google Patents
一种用于腐生兰毛萼山珊瑚无菌培养的培养基组及其应用和培养方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于植物组织培养技术领域，涉及一种用于腐生兰毛萼山珊瑚无菌培养的培养基组及其应用和培养方法，所述培养基组包括萌发培养基、增殖培养基和壮苗培养基，并具体限定了各培养基的组分。本发明提供的培养基组，能够为腐生兰毛萼山珊瑚培养提供充足材料，促进其快速增殖。本发明提供了上述培养基组在山珊瑚属腐生兰无菌培养中的应用，利用上述培养基组培养山珊瑚属植物，有助于根状茎的形成和发育，解决了山珊瑚属植物野外资源稀少，难以人工繁育的问题。本发明还提供了利用上述培养基组培养腐生兰毛萼山珊瑚的方法，腐生兰毛萼山珊瑚的生长速度较使用常规培养基显著提高，增殖生长所需时间由12个月缩短至3~6个月，显著提高了增殖效率。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种用于腐生兰毛萼山珊瑚无菌培养的培养基组及其应用和培养方法。
背景技术
腐生兰是与菌根菌共生的完全异养型兰科植物，体内没有叶绿素，不能像普通兰科植物一样进行光合作用，依靠共生真菌提供营养生存。腐生兰因为没有叶绿素，在进化过程中退化丢失很多功能基因，因此其生长过程和对各种生长调节剂的反应不同于普通兰科植物，具有独特性。腐生兰因平时踪迹难寻，除药用的天麻外，其他腐生兰相关研究主要集中在分类学和少量的植物化学研究，培养方法的研究甚少。
山珊瑚属植物具有丰富的生物碱类成分，《全国中草药汇编》中记载其具有类似天麻的功用，还有治疗淋病和疥疮等作用。毛萼山珊瑚是山珊瑚属的一种植株高大的腐生兰科植物，被列入IUCN名录，国家Ⅱ级保护，因野外资源稀少，难以人工繁育，无法开展深入的科学研究。因此，亟待提供一种用于腐生兰无菌培养的培养基组，用于培养山珊瑚属腐生兰，促进研究工作开展和相关产品的开发。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于腐生兰毛萼山珊瑚无菌培养的培养基组及其应用和培养方法。本发明提供的用于腐生兰毛萼山珊瑚无菌培养的培养基组，能够在较短时间内为腐生兰毛萼山珊瑚无菌培养提供充足材料，促进腐生兰的快速增殖。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种用于腐生兰毛萼山珊瑚无菌培养的培养基组，所述培养基组包括萌发培养基、增殖培养基和壮苗培养基，其中：
所述萌发培养基以WPM培养基为基础培养基，还包括以下原料：6-苄氨基腺嘌呤0.05~1mg/L和萘乙酸0.05~0.5mg/L；
所述增殖培养基以改良的1/2MS培养基为基础培养基，还包括以下原料：6-苄氨基腺嘌呤0.05~1mg/L和萘乙酸3~10mg/L；
所述壮苗培养基以改良的1/2MS培养基为基础培养基，还包括以下原料：赤霉素31~8mg/L和萘乙酸0.05~0.5mg/L；
所述改良的1/2MS培养基包括以下原料：硝酸铵140~160mg/L，硝酸钾880~920mg/L，二水氯化钙850~900mg/L，七水硫酸镁350~400mg/L，磷酸二氢钾1300~1500mg/L，碘化钾0.5~1.5mg/L，硼酸4~8mg/L，硫酸锰20~25mg/L，硫酸锌5~10mg/L，钼酸钠0.1~0.5mg/L，硫酸铜0.01~0.05mg/L，氯化钴0.01~0.05mg/L，乙二胺四乙酸钠铁30~40mg/L，肌醇90~110mg/L，盐酸0.1~1.0mg/L，维生素B6 0.1~1.0mg/L，维生素B1 0.1~1.0mg/L和甘氨酸1~5mg/L。
本发明提供了上述培养基组在山珊瑚属腐生兰无菌培养中的应用。
优选的，所述山珊瑚属腐生兰包括毛萼山珊瑚。
本发明还提供了利用上述培养基组培养腐生兰毛萼山珊瑚的方法，所述方法包括以下步骤：
将种子进行消毒，接入所述萌发培养基，经萌发培养，得到幼苗；
将所述幼苗转入所述增殖培养基，经增殖培养，得到幼嫩丛生芽；
将所述幼嫩丛生芽转入所述壮苗培养基，经壮苗培养，得到长成的植株。
优选的，所述增殖培养时，每50~70天转接一次。
优选的，所述消毒方式为浸泡消毒，所述浸泡消毒的试剂为次氯酸钠水溶液，浸泡消毒时间为10~30min。
优选的，所述消毒前还包括去除种子的翅。
优选的，所述去除方法包括添加研磨颗粒进行研磨，所述研磨颗粒与种子的体积比为1~3:0.5~2，研磨时间为20~40min。
优选的，所述萌发培养、增殖培养和壮苗培养独立为黑暗环境培养，培养温度独立为温度20~30℃。
有益效果：本发明提供了一种用于腐生兰毛萼山珊瑚无菌培养的培养基组，所述培养基组包括萌发培养基、增殖培养基和壮苗培养基，调整了基础培养基中6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）、萘乙酸（NAA）和赤霉素3（GA3）的使用配比，满足腐生兰因没有叶绿素而形成的对调节剂的特有需求，能够在较短时间内为腐生兰毛萼山珊瑚无菌培养提供充足材料，促进其快速增殖。
本发明提供了上述培养基组在山珊瑚属腐生兰无菌培养中的应用，利用上述培养基组培养山珊瑚属植物，有助于根状茎的形成和发育，有效解决了山珊瑚属植物野外资源稀少，难以人工繁育的问题。
本发明还提供了利用上述培养基组培养腐生兰毛萼山珊瑚的方法，使用的改良的1/2MS培养基质和培养方法，调整了基础培养基中铵氮：磷钾、6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）和萘乙酸（NAA）的使用配比，改良的1/2MS培养基中铵氮与磷钾的比例大大降低，且调节了生长调节剂中6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）和萘乙酸（NAA）的比例，NAA的剂量远高于6-BA。本发明提供的培养方法，山珊瑚属腐生兰的生长速度较使用常规培养基显著提高，增殖生长所需时间由12个月缩短至3~6个月，显著提高了增殖效率。
附图说明
图1为毛萼山珊瑚培养120天的对比图；其中，左图为对比例1，右图为实施例1；
图2为毛萼山珊瑚培养6个月的对比图；其中，左图为对比例1，右图为实施例1。
具体实施方式
本发明提供了一种用于腐生兰毛萼山珊瑚无菌培养的培养基组，所述培养基组包括萌发培养基、增殖培养基和壮苗培养基，其中：
所述萌发培养基以WPM培养基为基础培养基，还包括以下原料：6-苄氨基腺嘌呤0.05~1mg/L和萘乙酸0.05~0.5mg/L；
所述增殖培养基以改良的1/2MS培养基为基础培养基，还包括以下原料：6-苄氨基腺嘌呤0.05~1mg/L和萘乙酸3~10mg/L；
所述壮苗培养基以改良的1/2MS培养基为基础培养基，还包括以下原料：赤霉素31~8mg/L和萘乙酸0.05~0.5mg/L。
如无特殊说明，本发明对所述制备原料没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的市售商品即可。
本发明所述培养基中，所述萌发培养基以WPM培养基为基础培养基，还包括以下原料：6-苄氨基腺嘌呤0.05~1mg/L和萘乙酸0.0.5~0.5mg/L，进一步优选还仅包括以下原料：6-苄氨基腺嘌呤0.05~1mg/L和萘乙酸0.0.5~0.5mg/L；其中，6-苄氨基腺嘌呤更优选为0.1~0.5mg/L，最优选为0.2mg/L；萘乙酸更优选为0.1~0.2mg/L，最优选为0.2mg/L。
本发明所述培养基中，所述增殖培养基以改良的1/2MS培养基为基础培养基，优选还包括以下原料：6-苄氨基腺嘌呤0.05~1mg/L和萘乙酸3~10mg/L，进一步优选还仅包括以下原料：6-苄氨基腺嘌呤0.05~1mg/L和萘乙酸3~10mg/L；其中，所述6-苄氨基腺嘌呤更优选为0.1~0.5mg/L，最优选为0.2mg/L；所述萘乙酸更优选为5~8mg/L，最优选为5mg/L；在增殖过程中萘乙酸（NAA）的使用剂量浓度高于6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）的使用剂量浓度，通过调整配比能够显著提高腐生兰的增殖效率。
本发明所述培养基中，所述壮苗培养基以改良的1/2MS培养基为基础培养基，优选还包括以下原料：赤霉素3 1~8mg/L和萘乙酸0.05~0.5mg/L，进一步优选还仅包括以下原料：赤霉素3 1~8mg/L和萘乙酸0.05~0.5mg/L；其中，所述赤霉素3更优选为2~5mg/L，最优选为2.5mg/L；所述萘乙酸更优选为0.1~0.2mg/L，最优选为0.2mg/L。
本发明所述改良的1/2MS培养基优选包括以下原料：硝酸铵140~160mg/L，硝酸钾880~920mg/L，二水氯化钙850~900mg/L，七水硫酸镁350~400mg/L，磷酸二氢钾1300~1500mg/L，碘化钾0.5~1.5mg/L，硼酸4~8mg/L，硫酸锰20~25mg/L，硫酸锌5~10mg/L，钼酸钠0.1~0.5mg/L，硫酸铜0.01~0.05mg/L，氯化钴0.01~0.05mg/L，乙二胺四乙酸钠铁30~40mg/L，肌醇90~110mg/L，盐酸0.1~1.0mg/L，维生素B6 0.1~1.0mg/L，维生素B1 0.1~1.0mg/L和甘氨酸1~5mg/L，进一步优选还仅包括以下原料：硝酸铵140~160mg/L，硝酸钾880~920mg/L，二水氯化钙850~900mg/L，七水硫酸镁350~400mg/L，磷酸二氢钾1300~1500mg/L，碘化钾0.5~1.5mg/L，硼酸4~8mg/L，硫酸锰20~25mg/L，硫酸锌5~10mg/L，钼酸钠0.1~0.5mg/L，硫酸铜0.01~0.05mg/L，氯化钴0.01~0.05mg/L，乙二胺四乙酸钠铁30~40mg/L，肌醇90~110mg/L，盐酸0.1~1.0mg/L，维生素B6 0.1~1.0mg/L，维生素B1 0.1~1.0mg/L和甘氨酸1~5mg/L。
其中，所述硝酸铵更优选为145~155mg/L，最优选为150mg/L；所述硝酸钾更优选为890~910mg/L，最优选为900mg/L；所述二水氯化钙更优选为870~890mg/L，最优选为880mg/L；所述七水硫酸镁更优选为360~380mg/L，最优选为370mg/L；所述磷酸二氢钾更优选为1350~1450mg/L，最优选为1400mg/L；硝酸铵、硝酸钾、二水氯化钙、七水硫酸镁和磷酸二氢钾为大量元素。本发明大幅降低了培养基中硝酸铵的使用量，避免了铵态氮在使用浓度较高时会对植物的生长形成应激，导致植物生长缓慢或死亡；同时显著增加了磷酸二氢钾和钙离子用量，磷钾和钙离子有助于腐生兰的健壮成长，且能够促进其根状茎或根的形成和发育。
其中，所述碘化钾更优选为0.7~1mg/L，最优选为0.83mg/L；所述硼酸更优选为6~7mg/L，最优选为6.2mg/L；所述硫酸锰更优选为22~23mg/L，最优选为22.3mg/L；所述硫酸锌更优选为8~9mg/L，最优选为8.6mg/L；所述钼酸钠更优选为0.2~0.3mg/L，最优选为0.25mg/L；所述硫酸铜更优选为0.02~0.03mg/L，最优选为0.025mg/L；所述氯化钴更优选为0.02~0.03mg/L，最优选为0.025mg/L；所述乙二胺四乙酸钠铁更优选为36~37mg/L，最优选为36.7mg/L；碘化钾，硼酸，硫酸锰，硫酸锌，钼酸钠，硫酸铜，氯化钴和乙二胺四乙酸钠铁为微量元素。
其中，所述肌醇更优选为95~105mg/L，最优选为100mg/L；所述盐酸更优选为0.3~0.8mg/L，最优选为0.5mg/L；所述维生素B6更优选为0.3~0.8mg/L，最优选为0.5mg/L；所述维生素B1更优选为0.3~0.8mg/L，最优选为0.5mg/L；所述甘氨酸更优选为2~3mg/L，最优选为2mg/L；肌醇，盐酸，维生素B6，维生素B1和甘氨酸为有机成分。本发明在改良的1/2MS培养基中添加了微量元素和有机成分，能够在短时间内为腐生兰的繁殖提供充足的营养，显著提高了增殖速率。
本发明提供了上述培养基组在山珊瑚属腐生兰无菌培养中的应用。本发明提供的培养基组能够用于培养山珊瑚属植物，增殖效率高，增长速度快，能够显著提高山珊瑚属植物在医药领域的应用价值。
本发明所述山珊瑚属腐生兰优选包括毛萼山珊瑚。本发明提供的培养基组能够用于培养毛萼山珊瑚，显著加快了毛萼山珊瑚的无性繁殖和生物量增长的速度，能够解决毛萼山珊瑚的野外资源稀少，难以人工繁育的问题。
本发明还提供了利用上述培养基组培养腐生兰毛萼山珊瑚的方法，所述方法包括以下步骤：
将种子进行消毒，接入所述萌发培养基，经萌发培养，得到幼苗；
将所述幼苗转入所述增殖基培养，经增殖培养，得到幼嫩丛生芽；
将所述幼嫩丛生芽转入所述壮苗培养基，经壮苗培养，得到长成的植株。
本发明所述消毒前优选还包括去除种子的翅。本发明所述去除方法优选包括添加研磨颗粒进行研磨，所述研磨颗粒与种子的体积比优选为1~3:0.5~2，更优选为1.5~2.5:0.5~1最优选为2:1；研磨时间优选为20~40min，更优选为25~35min，最优选为30min。本发明所述研磨颗粒优选为石英砂，在本发明实施例中选用60目石英砂。
本发明优选将去除翅的种子进行消毒，所述消毒方式优选为浸泡消毒，所述浸泡消毒的试剂优选为次氯酸钠水溶液，所述浸泡消毒时间优选为10~30min，更优选为15~25min，最优选为20min。
本发明优选将消毒后的种子接入所述萌发培养基，经萌发培养，得到幼苗。本发明所述萌发培养优选为黑暗环境培养，所述培养温度优选为20~30℃，更优选为23~27℃，最优选为25℃，培养约180天后，获得米黄色幼苗。
本发明优选将上述经萌发培养后的幼苗转入所述增殖培养基中，经增殖培养，得到幼嫩丛生芽。本发明所述增殖培养优选为黑暗环境培养，所述培养温度优选为20~30℃，更优选为23~27℃，最优选为25℃。本发明所述增殖培养时，每50~70天转接一次，优选为每55~65天，更优选为每60天，避光培养约120天后，获得幼嫩丛生芽，同时有愈伤组织形成。
本发明优选将上述幼嫩丛生芽转入所述壮苗培养基，经壮苗培养，得到长成的植株。本发明所述幼嫩丛生芽优选体积较大的。本发明所述壮苗培养优选为黑暗环境培养，所述培养温度优选为20~30℃，更优选为23~27℃，最优选为25℃，壮苗培养约120天，植株养成，培育得到的根状茎呈现鲜黄色活力旺盛生长的状态。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种用于腐生兰毛萼山珊瑚无菌培养的培养基组及其应用和培养方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
（1）用于腐生兰毛萼山珊瑚无菌培养的培养基组，由萌发培养基、增殖培养基和壮苗培养基组成，其中：
萌发培养基：添加了植物生长调节剂0.2mg/L 6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）和0.2mg/L萘乙酸（NAA）的WPM培养基。
增殖培养基：添加了植物生长调节剂0.2mg/L 6-BA和5.0mg/L NAA的改良的1/2MS培养基；
壮苗培养基：添加了植物生长调节剂2.5mg/L赤霉素3（GA3）和0.2mg/L NAA的改良的1/2MS培养基培养。
改良的1/2MS培养基质组分为：
大量元素：硝酸铵150mg/L，硝酸钾900mg/L，二水氯化钙880mg/L，七水硫酸镁370mg/L，磷酸二氢钾1400mg/L；
微量元素：碘化钾0.83mg/L，硼酸6.2mg/L，硫酸锰22.3mg/L，硫酸锌8.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，乙二胺四乙酸钠铁36.7mg/L；
有机成分：肌醇100mg/L，盐酸0.5mg/L，维生素B6 0.5mg/L，维生素B1 0.5mg/L，甘氨酸2mg/L。
（2）毛萼山珊瑚培养方法具体如下步骤：
种子的萌发：
60目石英砂与种子体积比2:1混合后，旋涡振荡器震荡研磨30min，1%浓度的次氯酸钠水溶液浸泡消毒20min后，接入萌发培养基培养，在温度25℃的黑暗环境培养180天，获得米黄色萌发幼苗；
种苗的增殖：
所获幼苗转入增殖培养基培养，每60天转接一次，在温度25℃的黑暗环境培养120天，获得米黄色幼嫩丛生芽；
壮苗：
将生长体积较大的组织转入壮苗培养基培养，在温度25℃的黑暗环境培养120天，植株养成。
实施例2
按照实施例1的方式进行，区别在于，萌发培养基中，添加了0.5mg/L 6-BA和0.2mg/L NAA；增殖培养基中，添加了0.5mg/L 6-BA和5.0mg/L NAA；壮苗培养基中，添加了2.0mg/L GA3和0.2 mg/L NAA。
实施例3
按照实施例1的方式进行，区别在于，增殖培养基中，添加了0.1 mg/L 6-BA和7.0mg/L NAA；壮苗培养基中，添加了5.0mg/L GA3和0.1mg/L NAA。
对比例1
按照实施例1的方式进行，区别在于，增殖培养基为添加了1.0mg/L 6-BA和0.2mg/L NAA的1/2MS培养基，其中1/2MS培养基为未经改良的培养基；壮苗培养基为添加了0.2mg/L萘乙酸 NAA的1/2MS培养基培养。
试验例1
观察壮苗培养120天的根状茎的情况，见图1。
从图1中可以看出，发现实施例1的根状茎保持活力旺盛生长的状态，而对比例1的根状茎生长缓慢，新生的部分芽体变色不明显，随培养时间延长茎段变色严重。
试验例2
观察培养6个月的实施例1~3和对比例1培植得到的幼嫩丛生芽的生长情况（实施例1和对比例1的比较图见图2），并记录不定芽的数，并以下式计算增殖率，进行了3组平行试验，求平均值得到的结果见表1。
增殖率（丛生芽增殖系数）=增殖后不定芽数/接种前不定芽数×100%
表1 不同培养基培养的毛萼山珊瑚的增殖率
| 接种前不定芽数 | 增殖后不定芽数 | 增殖率（%） | |
| 实施例1 | 3.45±0.98 | 11.03±1.17 | 300 |
| 实施例2 | 3.27±1.02 | 7.13±0.77 | 220 |
| 实施例3 | 2.77±0.89 | 12.14±1.33 | 430 |
| 对比例1 | 3.32±0.77 | 3.55±0.68 | 105 |
从表1中可以看出，实施例1的增殖率达300%，实施例2的增殖率达220%，实施例3的增殖率最高，达到了430%；而对比例1调整了6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）和萘乙酸（NAA）的用量，且用未改良的1/2MS培养基培养，增殖率仅为105%。
由此可见，本发明改良的增殖培养基和改良的壮苗培养基很大程度上加快了毛萼山珊瑚的无性繁殖成功率，且生物量增长的速度，生长状态良好。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (8)
1.一种用于腐生兰毛萼山珊瑚无菌培养的培养基组，其特征在于，所述培养基组包括萌发培养基、增殖培养基和壮苗培养基，其中：
所述萌发培养基以WPM培养基为基础培养基，还添加以下原料：6-苄氨基腺嘌呤0.2~0.5mg/L和萘乙酸0.2mg/L；
所述增殖培养基以改良的1/2MS培养基为基础培养基，还添加以下原料：6-苄氨基腺嘌呤0.1~0.5mg/L和萘乙酸5~7mg/L；
所述壮苗培养基以改良的1/2MS培养基为基础培养基，还添加以下原料：赤霉素3 2~5mg/L和萘乙酸0.1~0.2mg/L；
所述改良的1/2MS培养基包括以下原料：硝酸铵150mg/L，硝酸钾900mg/L，二水氯化钙880mg/L，七水硫酸镁370mg/L，磷酸二氢钾1400mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.2mg/L，硫酸锰22.3mg/L，硫酸锌8.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，乙二胺四乙酸钠铁36.7mg/L，肌醇100mg/L，盐酸0.5mg/L，维生素B6 0.5mg/L，维生素B1 0.5mg/L和甘氨酸2mg/L。
2.权利要求1所述培养基组在山珊瑚属腐生兰无菌培养中的应用，所述山珊瑚属腐生兰包括毛萼山珊瑚。
3.利用权利要求1所述培养基组培养腐生兰毛萼山珊瑚的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
将种子进行消毒，接入所述萌发培养基，经萌发培养，得到幼苗；
将所述幼苗转入所述增殖培养基，经增殖培养，得到幼嫩丛生芽；
将所述幼嫩丛生芽转入所述壮苗培养基，经壮苗培养，得到长成的植株；
所述增殖培养时，每50~70天转接一次。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述消毒方式为浸泡消毒，所述浸泡消毒的试剂为次氯酸钠水溶液，浸泡消毒时间为10~30min。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述消毒前还包括去除种子的翅。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述去除方法包括添加研磨颗粒进行研磨，所述研磨颗粒与种子的体积比为1~3:0.5~2，研磨时间为20~40min。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述研磨颗粒与种子的体积比为2:1。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述萌发培养、增殖培养和壮苗培养均为黑暗环境培养，培养温度为20~30℃。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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