CN106069787B - 一种羌活的组织培养繁殖方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种羌活的组织培养繁殖方法，包括如下步骤：S1、无菌基体的预处理：选择羌活萌发的根芽，经灭菌、消毒处理，得到无菌基体；S2、簇生芽培养：将无菌基体接种到初增殖培养基中，进行第一阶段培养；再接种到继代增殖培养基中，进行第二阶段培养，从而在根芽切口出培育出簇生芽；S3、簇生苗培养：将簇生芽接种于胚芽诱导培养基中，继续培养簇生芽20‑30天，得到簇生苗；S4、生根培养：将簇生苗仔细分株，并接种到生根培养基中，培养20‑26天，得到根系完整的独立羌活小苗。所述方法通过特定的培养步骤和特定技术特征的综合选择与协同促进效果，可对羌活进行快速繁殖，满足大规模种植的需求，具有良好的应用前景和潜力。

Description

一种羌活的组织培养繁殖方法

技术领域

本发明涉及羌活的一种繁殖方法，更具体而言，涉及一种羌活的组织培养繁殖方法，属于药用植物繁殖领域。

背景技术

羌活(拉丁学名：Notopterygium incisum Ting ex H.T.Chang)，是一种伞形科、羌活属的药物植物，是我国特有的名贵药材。羌活属于高寒植物，在我国主要分布在四川、青海、甘肃和西藏等地的2500-3700米的高海拔区域，对于生长环境有着严格的要求和依赖。

经过研究发现，羌活的根、茎中含有大量的药学活性成分，主要为挥发油、香豆素类化合物、糖类等化合物。很早以前，我国即使用羌活入药，主要用来治疗感冒、伤风、头疼、风湿、麻痹、关节酸疼、浮肿、各种疮毒等，是一种较为名贵的中药。

正是有羌活的如此显著药物活性，对其需求量也越来越大，价格也日益上涨。但与此相对应的是，由于羌活的野生供应量很小，导致一方面其供应量严重落后于需求量，无法满足正常的需求；另一方面，由于价格的上涨，导致野生羌活资源遭到过度滥采，接近枯竭，使羌活野生资源遭到严重的、难以恢复的破坏，使正常的自然环境和野生资源受到过度破坏，难以正常恢复。

正是基于人工繁殖、人种种植、保护野生资源等考虑，人们对于羌活的繁殖进行了大量的研究，取得了一定的成果。

但另一个方面，羌活具有胚形态后熟特定和生理后熟特性，这导致人工繁殖和培育具有极大的难度，存在发芽率低、重复性差等诸多缺陷。

因此，采用羌活种子进行培育和繁殖，虽然能够在一定程度上缩短自然环境下的后熟时间，但时间仍然较长，对于满足大规模终止仍存在困难。

为了克服这些缺陷，人们对于羌活的组织培养繁殖方法进行了大量研究，并取得了一定的成果，例如：

CN1918972B公开了一种羌活组织培养繁殖方法，以羌活萌发的根芽为外植体，经消毒处理、接种诱导形成愈伤组织后，再经愈伤组织增殖、芽诱导和根诱导，形成完整植株小苗，将完整小苗移栽到育苗基质中，长成正常羌活植株，所用基本培养基均为以MS培养基为基础，辅以6-糠基腺嘌呤、6-苄基腺嘌呤、2,4-二氯苯氧乙酸、萘乙酸、蔗糖和活性炭等成分；所述方法克服了羌活育苗周期太长、繁殖系数低的问题，可进行工厂化快速育苗，以适应市场对羌活的需求。

CN102657085A公开了一种宽叶羌活组织培养离体快速繁殖方法，该方法包括以下步骤：1、外植体的选择和消毒处理：以宽叶羌活的根芽为外植体，经浸泡灭菌、冲洗，即得消毒后的外植体单芽；2、外植体接种：将消毒后的外植体单芽接种在诱导芽分化培养基上形成2-3个丛生芽；3、继代增殖培养：将2-3个丛生芽接种到继代增殖培养基上形成宽叶羌活丛生苗；4、生根诱导：将宽叶羌活丛生苗分株后转入生根培养基中培养，形成完整再生小苗；5、育苗基质消毒；6、植株移栽：将完整再生小苗直接移栽到消毒后的育苗基质中，炼苗后即长成正常宽叶羌活植株。该方法克服了宽叶羌活育苗周期过长、繁殖系数低的问题，易于操作、可进行工厂化快速育苗。

CN102657087A公开了一种羌活组织培养离体快速繁殖方法，该方法包括以下步骤：1、外植体的选择和消毒处理：以羌活的幼叶为外植体，经浸泡灭菌、冲洗，即得消毒后的外植体；2、外植体接种：将消毒后的外植体切块，接种在形成愈伤组织；3、愈伤组织增殖：将愈伤组织接种进行增殖，形成致密的愈伤组织；4、愈伤组织的芽诱导：将致密的愈伤组织接种形成丛生羌活苗；5、生根诱导：将丛生羌活苗分株后接种培养，得完整再生小苗；6、育苗基质消毒；7、植株移栽：将完整再生小苗直接移栽到消毒后的育苗基质中，炼苗后即长成正常羌活植株。所述方法克服了羌活育苗周期过长、繁殖系数低的问题，易于操作、可进行工厂化快速育苗。

如上所述，现有技术中公开了羌活的多种组织培养繁殖方法，但对于新型的组织培养繁殖方法，仍存在继续研究的必要和需求，这正是本发明得以完成的动力所在和基础所倚。

发明内容

为了寻求羌活的新型组织培养繁殖方法，本发明人进行了大量的深入研究，在付出了创造性劳动后，从而完成了本发明。

具体而言，本发明涉及一种羌活的组织培养繁殖方法，所述方法包括如下步骤：

S1：无菌基体的预处理

选择羌活萌发的根芽，并经灭菌、消毒处理，得到无菌基体；

S2：簇生芽培养

将所述无菌基体接种到初增殖培养基中，进行第一阶段培养；然后再接种到继代增殖培养基中，进行第二阶段培养，从而在根芽切口出培育出簇生芽；

S3：簇生苗培养

将所述簇生芽接种于胚芽诱导培养基中，继续培养簇生芽20-30天，从而得到簇生苗；

S4：生根培养

将簇生苗仔细分株，并接种到生根培养基中，培养20-26天，得到根系完整的独立羌活小苗。

在本发明的羌活的组织培养繁殖方法中，所述步骤S1具体如下：选择羌活萌发的嫩根芽，流水冲洗干净，并剪成1-2cm长的片段；将所述片段用质量百分比浓度为75％的酒精消毒20-30秒，然后浸泡于质量百分比浓度为0.05％的高锰酸钾水溶液中2-4分钟，最后捞出，用无菌水冲洗4-5次，得到无菌基体。

在本发明的羌活的组织培养繁殖方法中，所述步骤S2具体如下：

S2-1：将所述无菌基体接种到初增殖培养基中，在温度为16±2℃下，紫外光照射1-2小时，然后以2000-2500lux的光照强度照射8-10小时，最后恢复暗期；如此循环处理15-20天，完成第一阶段培养，得到初增殖基体；

S2-2：完成第一阶段培养后，将初增殖基体接种到继代增殖培养基中，将温度升高至25±1℃，并按照以一天为周期、以小时计的明期(L):暗期(D)＝13-17:7-11交替进行光照和停止光照，光照时的光照强度为2900-3100lux；如此循环处理10-15天，完成第二阶段培养，得到簇生芽。

在本发明的羌活的组织培养繁殖方法中，在所述步骤S2-1中，所述初增殖培养基的pH值为5.5，且每1000ml所述初增殖培养基包含如下含量的各种组分：2,4,5-三氯苯氧乙酸0.5mg、6-苄氨基腺嘌呤0.5-2mg、赤霉素1-2mg、无机物混合液50ml、微量元素水溶液20ml、盐酸吡哆醇20-30mg、柠檬酸8-14mg、L-脯氨酸10-15mg、乙二醇5-9mg、蔗糖8-12mg和琼脂3-4g。

其中，优选6-苄氨基腺嘌呤与2,4,5-三氯苯氧乙酸的质量比优选为2-3:1，最优选为2.5:1。发明人发现，6-苄氨基腺嘌呤与2,4,5-三氯苯氧乙酸的比例关系能够显著影响最后的组织培养结果，当6-苄氨基腺嘌呤与2,4,5-三氯苯氧乙酸的质量比为2.5:1时，能够取得最好的技术效果，这是令人意想不到的。

其中，所述无机物混合液是将10g K₂HPO₄·3H₂O、5g MgCl₂、6g NaH₂PO₄、2g NH₄Cl、3g NH₄NO₃、4g硼酸和3.5g KI加入到1000ml蒸馏水中搅拌溶解而得到的。从中量取50ml，即为1000ml上述初增殖培养基中所包含的50ml无机物混合液。

其中，所述微量元素水溶液是将4g钼酸钠、2g硫酸锌、3g硝酸铜、4g氯化钙、2g氯化钴、7g氯化锰、5g氯化亚铁、2g氯化铁和3g氯化铝溶解于1000ml蒸馏水中而得到的。从中量取20ml，即为1000ml上述初增殖培养基中所包含的20ml微量元素水溶液。

其中，所述初增殖培养基例如可通过将上述各种组分加入到适量双蒸水中进行充分混合，然后用双蒸水定容并调节pH值为5.5而得到，这是本领域技术人员应具备的常规操作能力，在此不再进行详细描述(其它的多个培养基的pH值也均是类似的调节而得到，这些都是组织培养领域中的常规技术手段，不再进行分别的详细描述)。

在本发明的羌活的组织培养繁殖方法中，在所述步骤S2-1中，温度为16±2℃，例如可为14℃、16℃或18℃。

在本发明的羌活的组织培养繁殖方法中，在所述步骤S2-1中，紫外光照射1-2小时，例如可为1小时、1.5小时或2小时。

在本发明的羌活的组织培养繁殖方法中，在所述步骤S2-1中，光照强度为2000-2500lux，例如可为2000lux、2100lux、2200lux、2300lux、2400lux或2500lux。

在本发明的羌活的组织培养繁殖方法中，在所述步骤S2-1中，在2000-2500lux光照强度下照射8-10小时，例如8小时、9小时或10小时。

在本发明的羌活的组织培养繁殖方法中，在所述步骤S2-2中，所述继代增殖培养基是以1/2MS培养基为基本培养基，并添加有维生素C 0.8-1.4mg/L、琼脂1-2g/L、麦芽糖5-8g/L和复合生长素0.4-0.8mg/L而得到的培养基，且其pH值为5.8。

其中，所述复合生长素为质量比3-5:1的6-氨基腺嘌呤与2,4-表油菜素内酯的混合物。

其中，所述1/2MS培养基为公知的基础培养基，也即将常规的MS培养基中的大量元素浓度减少一半后而得到的培养基(下同)。

在本发明的羌活的组织培养繁殖方法中，在所述步骤S2-2中，完成第一阶段培养后，将初增殖基体接种到继代增殖培养基中，将温度升高至25±1℃，例如升高至24℃、25℃或26℃。

在本发明的羌活的组织培养繁殖方法中，在所述步骤S2-2中，按照以一天为周期，以小时计的明期(L):暗期(D)＝13-17:7-11，例如可为13:11、14:10、15:9、16:8或17:7，最优选明期(L):暗期(D)＝15:9。

在本发明的羌活的组织培养繁殖方法中，在所述步骤S2-2中，光照强度为2900-3100lux，例如可为2900lux、3000lux或3100lux。

发明人发现，通过如此的两个阶段培养，尤其是步骤S2-1中的紫外光照射和步骤S2-2中的升温、明期(L)与暗期(D)的时间比以及特定复合生长素等的使用和协同等，可以取得优异的技术效果。

通过步骤S2的培养后，在根芽切口出可以诱导分化出簇生的淡黄色嫩芽，实现了根芽组织的诱导增殖。

在本发明的羌活的组织培养繁殖方法中，所述步骤S3中，每1000ml所述胚芽诱导培养基包含如下含量的各种组分：异戊烯基腺嘌呤2-4mg、吲哚-3-丁酸3-3.5mg、乙二胺四乙酸二钠10-15mg、肌醇8-10mg、蛋白胨5-8mg、无机物混合液40ml、微量元素水溶液25ml、白砂糖2-3g、烟酸1-2mg和琼脂1-2g，且所述胚芽诱导培养基的pH值为5.6。

其中，所述无机物混合液和微量元素水溶液均为步骤S2(更具体为步骤S2-1)中的相应无机物混合液和微量元素水溶液，无非量取的体积不同而已，在此不再进行重复描述。

在本发明的羌活的组织培养繁殖方法中，所述步骤S3中，培养温度为25±1℃。其它环境如湿度、光照等等均为自然环境，在此不再进行详细描述。

经过上述步骤S3的培养后，便可以得到簇生、密集的羌活小苗，从而可继续进行后续的操作处理。

在本发明的羌活的组织培养繁殖方法中，所述步骤S4中，所述生根培养基是以1/2MS培养基为基本培养基，并添加有氯吡苯脲0.4-0.8mg/L、萘乙酸0.1-0.3mg/L、琼脂2-4g/L、蔗糖10-15g/L、多效唑0.1-0.2mg/L而得到的培养基，且所述生根培养基的pH值为5.2。

在本发明的羌活的组织培养繁殖方法中，所述步骤S4中，培养温度为20±2℃。其它环境如湿度、光照等等均为自然环境，在此不再进行详细描述。

当得到独立羌活小苗后，便可进行移栽。移栽的技术属于非常公知的常规知识，例如可根据背景技术中引用的CN1918972A中公开的移栽技术进行操作，在此不再进行详细描述。

在本发明的羌活的组织培养繁殖方法中，所使用的多个培养基可通过常规方法进行灭菌、消毒处理，以保证其无菌、无毒的清洁性，这些处理都是组织培养领域中的常规技术手段，在此不再进行详细描述。

如上所述，本发明提供了一种羌活的组织培养繁殖方法，通过上述步骤S1-S4的处理，可以对羌活进行快速繁殖，经过如此组织培养方法(尤其是其中多个技术特征的限定和综合协同作用)，可得到具有株数多、发根数高、健康良好等诸多优异特点的羌活幼苗，满足了大规模种植的需求，具有良好的应用前景和潜力。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明进行详细说明，但这些例举性实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。

制备例1：无机物混合液的制备

将10g K₂HPO₄·3H₂O、5g MgCl₂、6g NaH₂PO₄、2g NH₄Cl、3g NH₄NO₃、4g硼酸和3.5gKI加入到1000ml蒸馏水中搅拌溶解，从而得到无机物混合液。

制备例2：微量元素水溶液的制备

将4g钼酸钠、2g硫酸锌、3g硝酸铜、4g氯化钙、2g氯化钴、7g氯化锰、5g氯化亚铁、2g氯化铁和3g氯化铝溶解于1000ml蒸馏水中，从而得到微量元素水溶液。

制备例3：初增殖培养基的制备

分别取2,4,5-三氯苯氧乙酸0.5mg、6-苄氨基腺嘌呤1.25mg(即6-苄氨基腺嘌呤与2,4,5-三氯苯氧乙酸的质量比为2.5:1)、赤霉素1.5mg、制备例1得到的无机物混合液50ml、制备例2得到的微量元素水溶液20ml、盐酸吡哆醇25mg、柠檬酸11mg、L-脯氨酸12mg、乙二醇7mg、蔗糖10mg和琼脂3.5g，将这些组分先加入到适量(例如500ml)双蒸水中进行充分混合，然后用双蒸水定容至1000ml同时调节pH值为5.5，从而得到初增殖培养基，将其命名为CZZ。

制备例3-1至3-6：初增殖培养基的制备

除分别将6-苄氨基腺嘌呤用量替换为0.5mg、0.75mg、1mg、1.5mg、1.75mg和2mg外，其它操作均不变，从而重复实施了制备例3，顺次得到制备例3-1、3-2、3-3、3-4、3-5和3-6，将得到的初增殖培养基顺次命名为CZZ1、CZZ2、CZZ3、CZZ4、CZZ5和CZZ6。

制备例4：继代增殖培养基的制备

以1/2MS培养基为基本培养基，添加维生素C 1.1mg/L、琼脂1.5g/L、麦芽糖6.5g/L和复合生长素(为质量比4:1的6-氨基腺嘌呤与2,4-表油菜素内酯的混合物)0.6mg/L，并调节pH值为5.8，从而得到继代增殖培养基，将其命名为JDZZ。

制备例5：胚芽诱导培养基的制备

分别取异戊烯基腺嘌呤3mg、吲哚-3-丁酸3.2mg、乙二胺四乙酸二钠12mg、肌醇9mg、蛋白胨6.5mg、制备例1的无机物混合液40ml、制备例2的微量元素水溶液25ml、白砂糖2.5g、烟酸1.5mg和琼脂1.5g，将这些组分先加入到适量(例如500ml)双蒸水中进行充分混合，然后用双蒸水定容至1000ml同时调节pH值为5.6，从而得到胚芽诱导培养基，将其命名为PYYD。

制备例6：生根培养基的制备

以1/2MS培养基为基本培养基，并添加氯吡苯脲0.6mg/L、萘乙酸0.2mg/L、琼脂3g/L、蔗糖13g/L、多效唑0.15mg/L，并调节pH值为5.2，从而得到生根培养基，将其命名为SG。

除非另有规定和说明，否则在下面的所有实施例中使用的各个培养基均是上述相应制备例中得到的相应培养基。

实施例1：明期(L)与暗期(D)的比例考察

S1：无菌基体的预处理

选择羌活萌发的嫩根芽，流水冲洗干净，并剪成1.5cm长的片段；将所述片段用质量百分比浓度为75％的酒精消毒25秒，然后浸泡于质量百分比浓度为0.05％的高锰酸钾水溶液中3分钟，最后捞出，用无菌水冲洗4-5次，得到无菌基体；

S2：簇生芽培养

S2-1：将所述无菌基体接种到初增殖培养基CZZ中，在温度为16℃下，紫外光照射1.5小时，然后以2200lux的光照强度照射9小时，最后恢复暗期；如此循环处理18天，完成第一阶段培养，得到初增殖基体；

S2-2：完成第一阶段培养后，将初增殖基体接种到继代增殖培养基JDZZ中，将温度升高至25℃，并按照下表1中所示的以一天为周期、以小时计的明期(L)与暗期(D)的比例交替进行光照和停止光照，光照时的光照强度为3000lux；如此循环处理13天，完成第二阶段培养，得到簇生芽；

S3：簇生苗培养

将所述簇生芽接种于胚芽诱导培养基PYYD中，继续在25℃下培养簇生芽25天，从而得到簇生苗；

S4：生根培养

将簇生苗仔细分株，并接种到生根培养基SG中，继续在20℃下培养23天，得到根系完整的独立羌活小苗。

其中，在步骤S2-2中的明期(L)与暗期(D)的比例见下表1中所示，其中发明人发现当以小时计的明期(L)与暗期(D)的比例为15:9时，能够最终得到最大数量的根系完整的独立羌活小苗，将步骤S1中10条1.5cm长的无菌基体在明期(L)与暗期(D)的比例为15:9条件下得到的所有独立羌活小苗数量进行平均，得到每条无菌基体所繁殖出的平均独立羌活小苗(平均为24.6棵)。为了更直观地进行对比，将其作为基准率100，其它明期(L)与暗期(D)比下得到的每条无菌基体(以10条的总数量进行平均取值)所繁殖出的平均独立羌活小苗数量与其进行对比，从而可得到不同明期(L)与暗期(D)比下的得苗数(四舍五入的结果计算到1位小数)，总结果见下表1。

表1

由此可见，步骤S2-2中的明期(L)与暗期(D)的比非常重要，能够显著地影响着最终所得独立羌活小苗的数量，其中当为15:9时能够取得最好的技术效果，而其它比值均导致小苗数量有显著降低，偏离15:9越大，则降低越显著。

实施例2：紫外光照射与否的考察

除将步骤S2-1中的“紫外光照射1.5小时”予以省略外，其它操作均不变(即不进行紫外光照射，而只是进行照射和暗期循环，以及选择最优的明期与暗期比)，从而重复进行了实施例1-1，得到实施例2。

结果见下表2，为了便于对比，仍将实施例1-1的结果一同列出。

表2

由此可见，即使在最优的明期与暗期的比例下，但当步骤S2-1中不进行紫外光照射时，得苗数仍有显著的大幅度降低，这证明紫外光照射能够改善组织增殖、诱发增殖，从而提高了得苗数。

实施例3-4：温度的考察

实施例3：除将步骤S2-1中的温度由16℃替换为步骤S2-2中的25℃外，其它操作均不变(即两个步骤的温度均为步骤S2-2中的温度，以及选择最优的明期与暗期比)，从而重复进行了实施例1-1，得到实施例3。

实施例3：除将步骤S2-2中的温度由25℃替换为步骤S2-1中的16℃外，其它操作均不变(即两个步骤的温度均为步骤S2-1中的温度，以及选择最优的明期与暗期比)，从而重复进行了实施例1-1，得到实施例4。

结果见下表3，为了便于对比，仍将实施例1-1的结果一同列出。

表3

由此可见，步骤S2-1与S2-2中的温度选择能够显著影响最终得苗数，当步骤S2-1的温度低于S2-2，且分别为16℃、25℃时能够取得最好的效果。而当这两个阶段的温度相同时，导致得苗数有显著的降低。

发明人还对步骤S2-1和S-2的温度数值进行了对换，考察了先高温、后低温时的效果，从而得到了对比例(即除将步骤S2-1的温替换为25℃、步骤S2-2的温度替换为16℃外，其它操作均变，从而重复操作了实施李1-1)，结果见下表4，为了对比的方便，将实施例1-1、实施例3-4的结果一并列出。

表4

由此可见，当先高温、后低温时，得苗率降低最为显著，不但要远远低于实施例1-1，而且要显著弱于实施例3-4，这证明反而要弱于温度恒定不变时的情形，这进一步证明了先低温、后高温的必要性和效果上的非显而易见性。

实施例5-10：2,4,5-三氯苯氧乙酸与6-苄氨基腺嘌呤的用量比的考察

除将步骤S2-1中的初增殖培养基由CZZ分别替换为CCZ1、CZZ2、CZZ3、CZZ4、CZZ5和CZZ6外，其它操作均不变，从而重复进行了实施例1-1，顺次得到实施例5-10。

结果见下表5，为了便于对比，仍将实施例1-1的结果一同列出，“两者质量比”即6-苄氨基腺嘌呤与2,4,5-三氯苯氧乙酸的质量比。

表5

由此可见，在初增殖培养基中，6-苄氨基腺嘌呤与2,4,5-三氯苯氧乙酸的质量比对于最终的结果有显著的影响，优选为2-3:1，最优选为2.5:1。而当偏离2.5:1越大，则得苗数越低。

实施例11-12：2,4,5-三氯苯氧乙酸或6-苄氨基腺嘌呤的考察

实施例11：除将步骤S2-1的初增殖培养基中的2,4,5-三氯苯氧乙酸予以省略外，其它操作均不变(即只包含6-苄氨基腺嘌呤)，从而重复进行了实施例1-1，得到实施例11。

实施例12：除将步骤S2-1的初增殖培养基中的6-苄氨基腺嘌呤予以省略外，其它操作均不变(即只包含2,4,5-三氯苯氧乙酸)，从而重复进行了实施例1-1，得到实施例12。

结果见下表6，为了便于对比，仍将实施例1-1的结果一同列出。

表6

由此可见，当初增殖培养基中仅仅包含一种组分时，可导致最终得苗率有显著的降低，尤其是仅仅包含2,4,5-三氯苯氧乙酸时，得苗率急剧降低至36.9，已经失去了大规模繁殖的可能。还可以看出，当同时包含这两种组分时，两者之间能够发挥意想不到的协同分裂促进效果，从而取得了最为优异的得苗率。

实施例13-14：6-氨基腺嘌呤与2,4-表油菜素内酯的考察

实施例13：除将步骤S2-2的复合生长素中的2,4-表油菜素内酯予以省略外，其它操作均不变(即只包含6-氨基腺嘌呤)，从而重复进行了实施例1-1，得到实施例13。

实施例14：除将步骤S2-2的复合生长素中的6-氨基腺嘌呤予以省略外，其它操作均不变(即只包含2,4-表油菜素内酯)，从而重复进行了实施例1-1，得到实施例14。

结果见下表7，为了便于对比，仍将实施例1-1的结果一同列出。

表7

由此可见，当继代增殖培养基的复合生长素中仅仅包含一种组分时，可导致最终得苗率有显著的降低(尤其是仅仅包含2,4-表油菜素内酯时急剧降低至58.3)，而当同时包含这两种组分时，能够取得最为优异的得苗率。

实施例15-17：步骤S3中分裂素的考察

本发明人发现，在本发明的步骤S3中，分裂素的种类能够显著影响最终的得苗率，为了进行考察，将实施例1-1中的异戊烯基腺嘌呤分别替换为6-苄氨基嘌呤、6-糠基腺嘌呤和6-苄基腺嘌呤，其它操作均不变，从而顺次得到了实施例15-17。

结果见下表8，为了便于对比，仍将实施例1-1的结果一同列出。

表8

由此可见，在胚芽诱导培养基的分裂素中，异戊烯基腺嘌呤连同吲哚-3-丁酸一起能发挥最好的技术效果，其它分裂素则有一定程度的降低。

除上述考察了不同条件下的得苗率外，发明人还对上述不同实施例的步骤S4实施后所得到的每株羌活小苗发根数进行了考察，以羌活小苗所生出的长度≥1cm的根作为有效根，计算有效根的总条数(每个实施例取100株的平均数)，并观察根的健康形态，从而考察了不同因素对生根性能的影响。

结果见下表9，为了便于对比，仍将实施例1-1的结果一同列出。

表9

其中，实施例3-4的“5.32、5.37”表示实施例3的100株羌活小苗的平均发根数为5.32条，而实施例4的100株羌活小苗的平均发根数为5.37条，其它例如实施例11-12、实施例13-14的发根数也有着相同的对应关系，在此不再详细描述。而实施例1-2至1-5的“5.13-5.35”则表示这4个实施例中的某一个实施例的100株羌活小苗的平均发根数为5.13条，另一个实施例的100株羌活小苗的平均发根数为5.35条，另外两个实施例的各自100株小苗的平均发根数则介于5.13和5.35之间，其它例如实施例5-10、实施例5-17也具有先同的含义，同样不再一一赘述。

由此可见，在步骤S2-S3中，上述诸多技术特征的改变都可导致发根数有一定程度的降低，这证明上述诸多技术特征不但影响了得苗数，而且也影响到了最后的生根结果，但都能得到形态良好的根。

实施例18-19：生根培养基的考察

实施例18：除将步骤S4的生根培养基SG中的氯吡苯脲予以省略外，其它操作均不变，从而重复进行了实施例1-1，得到实施例18。

实施例19：除将步骤S4的生根培养基SG中的多效唑予以省略外，其它操作均不变，从而重复进行了实施例1-1，得到实施例19。

结果见下表10，为了便于对比，仍将实施例1-1的结果一同列出。

表10

其中，“×”表示存在5-10％的病变褐色根。

由此可见，当不使用氯吡苯脲时，发根数有显著的降低，这证明氯吡苯脲能够显著地促进生根效果，从而得到最为优异的生根数。还可以看出，多效唑的存在，可以使得根健康良好，保证了后续炼苗、移栽等的成活率，而当不存在多效唑时，则出现了一些病变褐色根，从而增大了后续操作的小苗死亡率。

综上所述，本发明提供了一种羌活的组织培养繁殖方法，所述方法通过特定的培养步骤和特定技术特征的综合选择与协同促进效果，可以对羌活进行快速繁殖，经过如此组织培养方法(尤其是其中多个技术特征的限定和综合协同作用)，可得到具有株数多、发根数高、健康良好等诸多优异特点的羌活幼苗，满足了大规模种植的需求，具有良好的应用前景和潜力。

应当理解，这些实施例的用途仅用于说明本发明而非意欲限制本发明的保护范围。此外，也应理解，在阅读了本发明的技术内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改和/或变型，所有的这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种羌活的组织培养繁殖方法，所述方法包括如下步骤：

S1：无菌基体的预处理

选择羌活萌发的根芽，并经灭菌、消毒处理，得到无菌基体；

S2：簇生芽培养

将所述无菌基体接种到初增殖培养基中，进行第一阶段培养；然后再接种到继代增殖培养基中，进行第二阶段培养，从而在根芽切口处培育出簇生芽；

S3：簇生苗培养

将所述簇生芽接种于胚芽诱导培养基中，继续培养簇生芽20-30天，从而得到簇生苗；

S4：生根培养

将簇生苗仔细分株，并接种到生根培养基中，培养20-26天，得到根系完整的独立羌活小苗；

所述步骤S2具体如下：

S2-1：将所述无菌基体接种到初增殖培养基中，在温度为16±2℃下，紫外光照射1-2小时，然后以2000-2500lux的光照强度照射8-10小时，最后恢复暗期；如此循环处理15-20天，完成第一阶段培养，得到初增殖基体；

S2-2：完成第一阶段培养后，将初增殖基体接种到继代增殖培养基中，将温度升高至25±1℃，并按照以一天为周期、以小时计的明期:暗期＝15:9交替进行光照和停止光照，光照时的光照强度为2900-3100lux；如此循环处理10-15天，完成第二阶段培养，得到簇生芽；

在所述步骤S2-1中，所述初增殖培养基的pH值为5.5，且每1000ml所述初增殖培养基包含如下含量的各种组分：2,4,5-三氯苯氧乙酸0.5mg、6-苄氨基腺嘌呤1.25mg、赤霉素1-2mg、无机物混合液50ml、微量元素水溶液20ml、盐酸吡哆醇20-30mg、柠檬酸8-14mg、L-脯氨酸10-15mg、乙二醇5-9mg、蔗糖8-12mg和琼脂3-4g；

所述无机物混合液是将10g K₂HPO₄·3H₂O、5g MgCl₂、6g NaH₂PO₄、2g NH₄Cl、3g NH₄NO₃、4g硼酸和3.5g KI加入到1000ml蒸馏水中搅拌溶解而得到的，从中量取50ml，即为1000ml所述初增殖培养基中所包含的50ml无机物混合液；

所述微量元素水溶液是将4g钼酸钠、2g硫酸锌、3g硝酸铜、4g氯化钙、2g氯化钴、7g氯化锰、5g氯化亚铁、2g氯化铁和3g氯化铝溶解于1000ml蒸馏水中而得到的；

在所述步骤S2-2中，所述继代增殖培养基是以1/2MS培养基为基本培养基，并添加有维生素C 0.8-1.4mg/L、琼脂1-2g/L、麦芽糖5-8g/L和复合生长素0.4-0.8mg/L而得到的培养基，且其pH值为5.8；

所述复合生长素为质量比3-5:1的6-氨基腺嘌呤与2,4-表油菜素内酯的混合物；

所述步骤S3中，每1000ml所述胚芽诱导培养基包含如下含量的各种组分：异戊烯基腺嘌呤2-4mg、吲哚-3-丁酸3-3.5mg、乙二胺四乙酸二钠10-15mg、肌醇8-10mg、蛋白胨5-8mg、无机物混合液40ml、微量元素水溶液25ml、白砂糖2-3g、烟酸1-2mg和琼脂1-2g，且所述胚芽诱导培养基的pH值为5.6；

所述步骤S4中，所述生根培养基是以1/2MS培养基为基本培养基，并添加有氯吡苯脲0.4-0.8mg/L、萘乙酸0.1-0.3mg/L、琼脂2-4g/L、蔗糖10-15g/L、多效唑0.1-0.2mg/L而得到的培养基，且所述生根培养基的pH值为5.2。