CN108719058A - 沙棘组培快繁培养基及组培快繁方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供沙棘组培快繁培养基,包括诱导培养基,增殖培养基和生根培养基;其中,诱导培养基的配方为:1/2 MS+蔗糖30g/L+6g/L琼脂+2,4‑D 1.0‑4.0mg/L+NAA 0.1‑0.4mg/L;增殖培养基的配方为:1/2MS+蔗糖30g/L+6g/L琼脂+6‑BA 0.5‑3.0mg/L+NAA 0.1‑0.3mg/L;生根培养基的配方为:1/2 B5+蔗糖30g/L+6g/L琼脂+NAA 0.1‑0.4mg/L。本发明还提供相应的沙棘组培快繁方法。应用本发明的培养基和快繁方法,带休眠芽的茎段诱导率在87%‑100%之间,增殖率在85%‑96%之间,生根率在92%‑97%之间。
Description
技术领域
本发明属于通过组织培养技术的植物再生技术领域,具体涉及沙棘组培快繁培养基及组培快繁方法。
背景技术
沙棘(拉丁学名:Hippophae rhamnoides Linn.)为多年生落叶果树,灌木或小乔木。其果实、果皮、叶片、树皮及其加工制品含有280多种生理活性物质,具有强烈的消炎、杀菌、止痛和促进组织再生的特殊功效。其中许多成分在杀死和抑制肿瘤细胞、抗辐射、抗凝血、降血压、防止血管栓塞、抗衰老、抗疲劳、增强机体活力和免疫力等方面都显示出神奇的治疗效果。
沙棘枝叶茂盛、侧根发达、根蘖性极强,能迅速串根自蘖形成密集的群体,并能与放线菌、细菌、分枝杆菌等共生形成大量根瘤,具有比大豆更强的固氮能力(每公顷可固氮180kg)。此外,具有生长迅速,耐干旱,耐盐碱瘠薄,御严寒酷暑,具有保持水土、防风固沙、改良土壤和适应性强等促进生态平衡的明显作用,不仅是干旱风沙地区造林绿化的先锋树种,也是重要的薪炭林和饲料林树种。所以,在当前的退耕还林、农林产业结构调整中,种植沙棘具有重要的营养价值、生态价值和经济价值。
沙棘雌雄异株,靠种子繁殖在生产上难以保持优良品种的特性;根蘖繁殖繁殖系数较低。目前生产上采用的扦插繁殖成活率也不高,还容易传播病害。利用组织培养方法工厂化的繁育种苗不仅能大大提高繁殖系数,还可以建立离体无性种质资源库,替代占用大量土地面积的资源圃。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题,本发明提供了沙棘组培快繁培养基及组培快繁方法。
本发明的第一个目的是提供沙棘组培快繁培养基,包括诱导培养基,增殖培养基和生根培养基,其中,
所述诱导培养基的配方为:1/2MS+蔗糖30g/L+6g/L琼脂+2,4-D 1.0-4.0mg/L+NAA0.1-0.4mg/L;
所述增殖培养基的配方为:1/2MS+蔗糖30g/L+6g/L琼脂+6-BA 0.5-3.0mg/L+NAA0.1-0.3mg/L;
所述生根培养基的配方为:1/2B5+蔗糖30g/L+6g/L琼脂+NAA 0.1-0.4mg/L。
作为优选,所述诱导培养基的配方为:1/2MS+蔗糖30g/L+6g/L琼脂+2,4-D 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L。
作为优选,所述增殖培养基的配方为:1/2MS+蔗糖30g/L+6g/L琼脂+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.2mg/L。
作为优选,所述生根培养基的配方为:1/2B5+蔗糖30g/L+6g/L琼脂+NAA 0.2mg/L。
本发明的第二个目的是提供应用上述任一项的沙棘组培快繁培养基进行沙棘组培快繁方法,包括以下步骤:
(1)植物材料的选取及处理:以带休眠芽的茎段作为试材,将其进行消毒;
(2)带休眠芽茎段的诱导:将消毒后的带休眠芽的茎段接种到诱导培养基中进行培养;
(3)带休眠芽茎段的增殖:将诱导获得的无菌苗接种到增殖培养基中进行培养;
(4)带休眠芽茎段的生根:将增殖培养获得的丛生苗接种到生根培养基中进行诱导生根;
(5)植株再生:待根部长到3.5-4.5cm时,先闭瓶炼苗2d,然后再开瓶炼苗3d,洗净根部后,移入灭菌后的基质中培养,混得再生植株。
作为优选,步骤(2)中所述培养的培养条件为:温度:25±2℃,光照强度:500-800lx,光周期为10h/d。
作为优选,步骤(3)中所述培养的培养条件为:温度:25±2℃,光照强度:1500-2000lx,光周期为16h/d。
作为优选,步骤(4)中所述培养的培养条件为:温度:25±2℃,光照强度:2500-3000lx,光周期为14-16h/d。
作为优选,步骤(5)中所述基质由蛭石和草炭土按照体积比1:3混合制备而成。
本发明公开了一种沙棘组培快繁培养基及组培快繁方法,以带休眠芽的茎段作为试材,通过不同生长调节物质对愈伤组织的诱导、增殖、生根等步骤的影响,进行各种培养基的筛选,获得以下最佳培养基以及最佳培养条件,提供了一种有效的沙棘组织培养方法。其中,诱导率在87%-100%之间,增殖率在85%-96%之间,生根率在92%-97%之间。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为市售。
本发明的沙棘组培快繁方法为:
(1)植物材料的选取及处理:以带休眠芽的茎段作为试材,先用自来水冲洗,再用洗涤剂溶液浸泡10-15min,期间不断搅拌,并用软毛刷轻轻的刷洗表面,然后用自来水冲洗干净,再在流水下冲洗2-3h。之后装入消毒烧杯中立即置于超净工作台上,先用浓度为75%的酒精浸泡消毒30s,然后用无菌水冲洗2-3次,再用浓度为0.1%的氯化汞浸泡消毒3-5min,期间不断震荡,最后用无菌水冲洗5-6次。
(2)带休眠芽茎段的诱导:将消毒后的带休眠芽的茎段放在灭菌的滤纸上将水分吸干,切成0.5-1.1cm带单芽茎段接种到诱导培养基上,每瓶接种1-2个茎段。培养条件为:温度:(25±2)℃,光照强度:500-800lx,光周期为10h/d。每10天继代一次,继代三次后,统计诱导率。
诱导培养基以1/2MS+蔗糖30g/L+6g/L琼脂为基础培养基,并添加6-BA、2,4-D或NAA中的一种或几种。
设计方案为:
①基础培养基+6-BA 0.3mg/L;
②基础培养基+2,4-D 2.0mg/L;
③基础培养基+NAA 0.4mg/L;
④基础培养基+6-BA 0.3mg/L+2,4-D 2.0mg/L;
⑤基础培养基+6-BA 0.3mg/L+NAA 0.4mg/L;
⑥基础培养基+2,4-D 2.0mg/L+NAA 0.4mg/L;
⑦基础培养基+6-BA 0.3mg/L+2,4-D 2.0mg/L+NAA 0.4mg/L。
实验发现,当采用第⑥组配方时,诱导率最高,长势最好。接下来调整2,4-D和NAA的浓度以获得最佳诱导率:设置2,4-D浓度为1.0mg/L、3.0mg/L、4.0mg/L;NAA的浓度为0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L。
经试验:在上述浓度范围内,诱导率在87%-100%之间,当2,4-D的浓度为1.0mg/L,NAA的浓度为0.2mg/L时,诱导率最高为100%,且长势最好。
其中,1/2MS为本领域技术人员知晓的公知常识,其为大量元素减半的MS培养基。MS培养基同样为本领域技术人员知晓的公知常识。
(3)带休眠芽茎段的增殖:将诱导获得的2-3cm无菌苗切成1cm长并带有2-3个叶片的茎段,然后接种到增殖培养基中,进行增殖培养。培养条件为:温度:25±2℃,光照强度:1500-2000lx,光周期为16h/d。每2周继代一次,继代三次后,统计增殖率。
增殖培养基以1/2MS+蔗糖30g/L+6g/L琼脂为基础培养基,并添加6-BA和NAA。设置6-BA的浓度为0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L、2.5mg/L、3.0mg/L;NAA的浓度为0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L。
经试验,在上述浓度范围内,增殖率在85%-96%之间,当6-BA的浓度为1.5mg/L,NAA的浓度为0.2mg/L时,增殖率最高(为96%),丛生芽点数最多,长势最好,同时褐化率最低,在12%以下。
(4)带休眠芽茎段的生根:将增殖培养获得的丛生苗单株切下,接种到生根培养基中诱导生根。培养条件为:温度:25±2℃,光照强度:2500-3000lx,光周期为14-16h/d。每2周继代一次,继代三次后,统计生根率。
生根培养基分别以1/2B5+蔗糖30g/L+6g/L琼脂和1/2MS+蔗糖30g/L+6g/L琼脂为基础培养基,并添加6-BA和/或NAA。设置6-BA的浓度为0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L、2.5mg/L、3.0mg/L;NAA的浓度为0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L、0.4mg/L。
经试验,当在两种基础培养基中分别同时添加6-BA和NAA时,生根率并不高,而单独添加NAA,且使用1/2B5+蔗糖30g/L+6g/L琼脂作为基础培养基时,生根率最高,生根率在92%-97%之间,当NAA的浓度为0.2mg/L时,生根率最高,为97%。
其中,1/2B5为本领域技术人员知晓的公知常识,其为大量元素减半的B5培养基。B5培养基同样为本领域技术人员知晓的公知常识。
(5)植株再生:待根长到4cm左右时,先闭瓶炼苗2d,然后再开瓶炼苗3d,洗净根部后,移入灭菌后的基质中培养,基质可以选用草炭土,优选由蛭石和草炭土按照体积比1:3混合制备而成,获得完整的再生植株。选用上述优选基质时成活率最高,成活率在70%以上。
实施例1
本发明的沙棘组培快繁方法为:
(1)植物材料的选取及处理:以带休眠芽的茎段作为试材,先用自来水冲洗,再用洗涤剂溶液浸泡15min,期间不断搅拌,并用软毛刷轻轻的刷洗表面,然后用自来水冲洗干净,再在流水下冲洗3h。之后装入消毒烧杯中立即置于超净工作台上,先用浓度为75%的酒精浸泡消毒30s,然后用无菌水冲洗3次,再用浓度为0.1%的氯化汞浸泡消毒4min,期间不断震荡,最后用无菌水冲洗6次。
(2)带休眠芽茎段的诱导:将带休眠芽的茎段放在灭菌的滤纸上将水分吸干,切成0.8cm带单芽茎段接种到诱导培养基上,每瓶接种1个茎段进行诱导。培养条件为:温度:25℃,光照强度:600lx,光周期为10h/d。每10天继代一次,继代三次后,统计诱导率。
诱导培养基以1/2MS+蔗糖30g/L+6g/L琼脂为基础培养基,并添加2,4-D 1.0mg/L和NAA 0.2mg/L。诱导率最高为100%,且长势好。
(3)带休眠芽茎段的增殖:将诱导获得的2-3cm无菌苗切成1cm长并带有3个叶片的茎段,然后接种到增殖培养基中,进行增殖培养。培养条件为:温度:25℃,光照强度:1800lx,光周期为16h/d。每2周继代一次,继代三次后,统计增殖率。
增殖培养基以1/2MS+蔗糖30g/L+6g/L琼脂为基础培养基,并添加6-BA 1.5mg/L和NAA 0.2mg/L。增殖率为96%,丛生芽点数多,长势好,褐化率为10%。
(4)带休眠芽茎段的生根:将增殖培养获得的丛生苗单株切下,接种到生根培养基上诱导生根。培养条件为:温度:25℃,光照强度:2800lx,光周期为15h/d。每2周继代一次,继代三次后,统计生根率。
生根培养基以1/2B5+蔗糖30g/L+6g/L琼脂为基础培养基,并添加NAA 0.2mg/L。生根率为97%。
(5)植株再生:待根长到4cm左右时,先闭瓶炼苗2d,然后再开瓶炼苗3d,洗净根部后,移入灭菌后的基质中培养,基质由蛭石和草炭土按照体积比1:3混合制备而成,获得完整的再生植株,成活率为73%。
实施例2
本发明的沙棘组培快繁方法为:
(1)植物材料的选取及处理:以带休眠芽的茎段作为试材,先用自来水冲洗,再用洗涤剂溶液浸泡10min,期间不断搅拌,并用软毛刷轻轻的刷洗表面,然后用自来水冲洗干净,再在流水下冲洗2h。之后装入消毒烧杯中立即置于超净工作台上,先用浓度为75%的酒精浸泡消毒30s,然后用无菌水冲洗2次,再用浓度为0.1%的氯化汞浸泡消毒3min,期间不断震荡,最后用无菌水冲洗5次。
(2)带休眠芽茎段的诱导:将带休眠芽的茎段放在灭菌的滤纸上将水分吸干,切成0.5cm带单芽茎段接种到诱导培养基上,每瓶接种1个茎段。培养条件为:温度:23℃,光照强度:500lx,光周期为10h/d。每10天继代一次,继代三次后,统计诱导率。
诱导培养基以1/2MS+蔗糖30g/L+6g/L琼脂为基础培养基,并添加2,4-D 3.0mg/L和NAA 0.1mg/L。诱导率为92%,长势较好。
(3)带休眠芽茎段的增殖:将诱导获得的2-3cm无菌苗切成1cm长并带有2个叶片的茎段,然后接种到增殖培养基中,进行增殖培养。培养条件为:温度:27℃,光照强度:1500lx,光周期为16h/d。每2周继代一次,继代三次后,统计增殖率。
增殖培养基以1/2MS+蔗糖30g/L+6g/L琼脂为基础培养基,并添加6-BA 0.5mg/L和NAA 0.1mg/L。增殖率为91%,丛生芽点数较多,长势好,褐化率为11%。
(4)带休眠芽茎段的生根:将增殖培养获得的丛生苗单株切下,接种到生根培养基上诱导生根。培养条件为:温度:23℃,光照强度:3000lx,光周期为14h/d。每2周继代一次,继代三次后,统计生根率。
生根培养基以1/2B5+蔗糖30g/L+6g/L琼脂为基础培养基,并添加NAA 0.1mg/L。生根率为92%。
(5)植株再生:待根长到4cm左右时,先闭瓶炼苗2d,然后再开瓶炼苗3d,洗净根部后,移入灭菌后的基质中培养,基质由蛭石和草炭土按照体积比1:3混合制备而成,获得完整的再生植株,成活率为71%。
实施例3
本发明的沙棘组培快繁方法为:
(1)植物材料的选取及处理:以带休眠芽的茎段作为试材,先用自来水冲洗,再用洗涤剂溶液浸泡15min,期间不断搅拌,并用软毛刷轻轻的刷洗表面,然后用自来水冲洗干净,再在流水下冲洗2.5h。之后装入消毒烧杯中立即置于超净工作台上,先用浓度为75%的酒精浸泡消毒30s,然后用无菌水冲洗3次,再用浓度为0.1%的氯化汞浸泡消毒5min,期间不断震荡,最后用无菌水冲洗6次。
(2)带休眠芽茎段的诱导:将带休眠芽的茎段放在灭菌的滤纸上将水分吸干,切成1.1cm带单芽茎段接种到诱导培养基上,每瓶接种2个茎段。培养条件为:温度:27℃,光照强度:800lx,光周期为10h/d。每10天继代一次,继代三次后,统计诱导率。
诱导培养基以1/2MS+蔗糖30g/L+6g/L琼脂为基础培养基,并添加2,4-D 2.0mg/L和NAA 0.3mg/L。诱导率为91%,长势较好。
(3)带休眠芽茎段的增殖:将诱导获得的2-3cm无菌苗切成1cm长并带有3个叶片的茎段,然后接种到增殖培养基中,进行增殖培养。培养条件为:温度:23℃,光照强度:2000lx,光周期为16h/d。每2周继代一次,继代三次后,统计增殖率。
增殖培养基以1/2MS+蔗糖30g/L+6g/L琼脂为基础培养基,并添加6-BA 3.0mg/L和NAA 0.3mg/L。增殖率为85%,丛生芽点数较多,长势较好,褐化率为12%。
(4)带休眠芽茎段的生根:将增殖培养获得的丛生苗单株切下,接种到生根培养基上诱导生根。培养条件为:温度:27℃,光照强度:2500lx,光周期为16h/d。每2周继代一次,继代三次后,统计生根率。
生根培养基以1/2B5+蔗糖30g/L+6g/L琼脂为基础培养基,并添加NAA 0.4mg/L。生根率为94%。
(5)植株再生:待根长到4cm左右时,先闭瓶炼苗2d,然后再开瓶炼苗3d,洗净根部后,移入灭菌后的基质中培养,基质由蛭石和草炭土按照体积比1:3混合制备而成,获得完整的再生植株,成活率为70%。
最后应说明的是:以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.沙棘组培快繁培养基,其特征在于:包括诱导培养基,增殖培养基和生根培养基,其中,
所述诱导培养基的配方为:1/2MS+蔗糖30g/L+6g/L琼脂+2,4-D 1.0-4.0mg/L+NAA0.1-0.4mg/L;
所述增殖培养基的配方为:1/2MS+蔗糖30g/L+6g/L琼脂+6-BA 0.5-3.0mg/L+NAA 0.1-0.3mg/L;
所述生根培养基的配方为:1/2B5+蔗糖30g/L+6g/L琼脂+NAA 0.1-0.4mg/L。
2.根据权利要求1所述的沙棘组培快繁培养基,其特征在于:所述诱导培养基的配方为:1/2MS+蔗糖30g/L+6g/L琼脂+2,4-D 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L。
3.根据权利要求1所述的沙棘组培快繁培养基,其特征在于:所述增殖培养基的配方为:1/2MS+蔗糖30g/L+6g/L琼脂+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.2mg/L。
4.根据权利要求1所述的沙棘组培快繁培养基,其特征在于:所述生根培养基的配方为:1/2B5+蔗糖30g/L+6g/L琼脂+NAA 0.2mg/L。
5.应用权利要求1-4任一项所述的沙棘组培快繁培养基进行沙棘组培快繁方法,其特征在于:包括以下步骤:
(1)植物材料的选取及处理:以带休眠芽的茎段作为试材,将其进行消毒;
(2)带休眠芽茎段的诱导:将消毒后的带休眠芽的茎段接种到诱导培养基中进行培养;
(3)带休眠芽茎段的增殖:将诱导获得的无菌苗接种到增殖培养基中进行培养;
(4)带休眠芽茎段的生根:将增殖培养获得的丛生苗接种到生根培养基中进行诱导生根;
(5)植株再生:待根部长到3.5-4.5cm时,先闭瓶炼苗2d,然后再开瓶炼苗3d,洗净根部后,移入灭菌后的基质中培养,混得再生植株。
6.根据权利要求5所述的沙棘组培快繁方法,其特征在于:步骤(2)中所述培养的培养条件为:温度:25±2℃,光照强度:500-800lx,光周期为10h/d。
7.根据权利要求5所述的沙棘组培快繁方法,其特征在于:步骤(3)中所述培养的培养条件为:温度:25±2℃,光照强度:1500-2000lx,光周期为16h/d。
8.根据权利要求5所述的沙棘组培快繁方法,其特征在于:步骤(4)中所述培养的培养条件为:温度:25±2℃,光照强度:2500-3000lx,光周期为14-16h/d。
9.根据权利要求5所述的沙棘组培快繁方法,其特征在于:步骤(5)中所述基质由蛭石和草炭土按照体积比1:3混合制备而成。
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