CN108901858A - 一种凤头姜富硒原原种快繁方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及凤头姜繁殖技术领域，具体而言，涉及一种凤头姜富硒原原种快繁方法，主要包括外植体培育、培养基筛选、组织培养、病毒检测与扩繁、硒富集栽培等环节。所述组织培养方法是以MS培养基为基础，添加一定激素，经脱分化、再分化、生根培育而成试管苗，具有成活率高、生长旺盛、根系发达、成本低等优点；所述富硒原原种快繁方法为使用上述试管苗，结合病毒检测和硒富集栽培技术生产富硒原原种，不仅繁殖周期短、操作简便、成本较低、性状稳定、繁殖系数高，还提高了凤头姜的营养保健功能及商品附加值。

Description

一种凤头姜富硒原原种快繁方法

技术领域

本发明涉及凤头姜组织培养技术领域，具体而言，涉及一种凤头姜富硒原原种快繁方法。

背景技术

生姜为姜科属多年生宿根植物，有健脾开胃、温中止呕、止咳祛痰、提神活血之功能，有祛寒御湿、延缓衰老、防癌美容之功效。近年来，以生姜为原料的保鲜生姜及生姜加工制品，如脱水姜片、红生姜(片、丝、粒)、酸姜芽、盐渍姜、姜汁、姜油和姜粉等，大量出口日本及东南亚诸国，成为我国出口创汇的重要产品。凤头姜块根肥脆，白嫩的块根紧连成扇形，顶上还有点点红蒂，像传说中凤凰的头，因此得名“凤头姜”。其鲜子姜无筋脆嫩、富硒多汁、辛辣适中、美味可口，远销东南亚市场。

由于生姜不易开花结实，不能利用有性繁殖进行大批量育种，生产上长期以成熟根状茎为种源进行无性繁殖，不仅繁殖系数低、多种病毒积累，且易通过带病种姜传播病害，造成优良种性退化、产量降低、品质下降。目前，国内外对生姜病毒的防治仍没特效药，只能通过种姜药剂消毒、合理轮作、药物防控，但效果均不理想。常规种植都是选用已萌芽的种姜切块繁殖，不仅用种量大，而且需要用大量留种田生产种姜，这不仅增加了种姜生产成本高，还增加了生姜感病的机率。同时，由于多年来生姜品种得不到更新、改良，致使生姜多种病害加重，大大阻碍了生姜产业的发展。硒是人和动物必须的营养元素，是谷胱甘肽过氧化物酶的重要组成部分，具有抗衰老、防癌抗癌、抗脂膜过氧化、清除生命体内的自由基、拮抗重金属毒性、增加机体免疫力等作用。由于硒在地壳中的分布很不均匀，造成动植物食品中硒含量存在地区性及地带性差异。据统计，全世界有40多个国家缺硒，我国处于全球缺硒地带，是国际公认的缺硒大国，除湖北恩施、陕西紫阳等地区外，约有占国土面积72％的地区土壤缺硒，其中29％为严重缺硒地区(含硒量<0.02mg/kg)，43％为缺硒区(含硒量0.03～0.05mg/kg)，成人硒摄入量远远低于生物需要量(40μg/d)及中国营养学会推荐的硒摄入量的最低限值(50μg/d)，而且动物和人体缺硒情况正在加剧。为此科学家呼吁为提高生命质量，科学补硒刻不容缓。然而人体无法合成硒，只能从食物中摄取所需的硒，但粮食等天然食物含硒较少。植物是自然界硒生态循环中的关键性的中间环节，是人和动物摄入硒的最重要的直接硒源。因此，开发富硒农产品顺应了人们的消费潮流。尤其是开发天然有机硒保健食品，已成为目前我国功能性保健食品开发的热点之一。

为了获得有效安全的补硒方式，人们采用生物转化的手段将无机硒转化为有机硒。富硒大米、富硒大豆、富硒矿泉水、硒酵母等富硒产品与之俱来，但由此带来的产品质量差、生产成本高、副作用大等突出问题比比皆是。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种凤头姜组培培养基，所述培养基包括脱分化培养基、再分化培养基、生根壮苗培养基，以MS培养基为基础添加一定的激素，具有成活率高、分蘖多、成本低等优点。

本发明的第二目的在于提供一种凤头姜的组织培养方法，该方法利用上述培养基进行培养，具有操作简便、成活率高、成本低等优点。

本发明的另一方面还在于提供一种凤头姜富硒原原种快繁方法，该方法以上述组培方法为基础，结合了病毒检测和硒富集栽培等技术，不仅繁殖周期短、操作简便、成本较低、性状稳定、繁殖系数高，还能有效促进凤头姜产业快速健康发展。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种凤头姜组培培养基，所述培养基包括脱分化培养基、再分化培养基、生根壮苗培养基；

所述脱分化培养基的组成包括：MS培养基、6-BA、IAA和蔗糖；所述脱分化培养基中6-BA的浓度为1.3～1.7mg/L，IAA的浓度为0.08～0.12mg/L，蔗糖的浓度为40～60g/L；

所述再分化培养基的组成包括：MS培养基、6-BA、KT和蔗糖；所述再分化培养基中6-BA的浓度为1.8～2.2mg/L，KT的浓度为0.08～0.12mg/L，蔗糖的浓度为40～60g/L；

所述生根壮苗培养基的组成包括：MS培养基、6-BA、IAA和蔗糖；所述生根壮苗培养基中6-BA的浓度为0.8～1.2mg/L，IAA的浓度为0.2～0.4mg/L，蔗糖的浓度为40～60g/L。

在整个组织培养过程中，培养基的选择是十分重要的，它是细胞或组织生长所需营养物质的基质。在离体培养条件下，不同植物的组织对营养有不同的需求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的需求也不同，只有满足了它们各自的特殊要求，才能很好的生长。因此，没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官，在建立一个新的培养体系时，找到适合的培养基是至关重要的。

本发明针对凤头姜提供了适宜的脱分化培养基、再分化培养基和生根壮苗培养基，以MS培养基为基础，添加适宜的生长素和/或细胞分裂素及蔗糖，满足凤头姜不同生长发育阶段的营养需求。

MS培养基以发明人的名字Murashige和Skoog来命名，简称MS。其无机盐和离子浓度较高，养分的数量和比例合适，可满足植物的营养和生理需求。

生长素可诱导愈伤组织形成、根分化和促进细胞分裂、伸长生长。因浓度不同而有多方面的生理效应，低浓度时可促进生长，高浓度时则抑制生长，甚至致使植物死亡。所以在应用中需根据不同植物种类、处理时间和处理部位等因素选择合适的浓度。

细胞分裂素是腺嘌呤的衍生物，能促进胞质分裂和组织的分化、生长，与生长素有协同作用。与生长素相同，细胞分裂素也具有生理作用的两重性，故在应用中需根据不同植物种类、处理时间和处理部位等因素选择合适的浓度。

蔗糖是优质碳源，对各阶段组织的发育起到重要的作用。蔗糖的浓度不仅影响着培养物的生长速度和生长量，还影响其代谢水平以及细胞的形态和发生，是影响组织培养成功与否的关键之一。

6-BA即6-苄氨基腺嘌呤，别名：6-苄氨基嘌呤、细胞分裂素，英文通用名：6-Benzylaminopurine，是对人畜安全的植物生长调节剂。其具有促进细胞分裂、促进非分化组织分化、促进生物体内物质的积累、促进侧芽发生、防止老化等作用。正因为如此，6-BA成为植物组织和细胞培养中不可缺少的化合物。6-BA的另一个重要特征是在植物体内的移动性差，其生理作用局限于处理部位及其附近。在实际应用中要考虑处理方法和处理部位。在应用中，植物种类、用法和浓度、处理时间和部位不同，所表现出来的作用或反应也不尽相同，例如低浓度时作用效果差，而过高浓度可能会产生相反作用，所以在应用中需根据不用植物种类、处理时间和处理部位等因素选择合适的浓度。

IAA，即吲哚-3-乙酸，亦称吲哚乙酸、3-吲哚乙酸、茁长素、生长素、异生长素，乙酸英文通用名：Indole-3-acetic acid，是用作刺激植物生长的激素类试剂，广泛应用于农业生产中。在细胞水平上，IAA可刺激形成层细胞分裂；刺激枝的细胞伸长、抑制根细胞生长；促进木质部、韧皮部细胞分化，促进插条发根、调节愈伤组织的形态建成。在器官和整株水平上，生长素从幼苗到果实成熟都起作用。其生理作用同样具有两重性，因此在应用中需根据不同植物种类、处理时间和处理部位等因素选择合适的浓度。

KT，即6-糠基氨基嘌呤或N6-呋喃甲基腺嘌呤，英文别名：6-Furfurylaminopurine,N6-Furfuryladenine，为激动素，具有促进细胞分化、分裂、生长，诱导愈伤组织长芽等作用。

在脱分化阶段，使用脱分化培养基，其组成包括：MS培养基、6-BA、IAA和蔗糖；脱分化培养基中6-BA的浓度为1.3～1.7mg/L，IAA的浓度为0.08～0.12mg/L，蔗糖的浓度为40～60g/L。如在本发明不同的实施例中，6-BA浓度还可以为1.4mg/L、1.5mg/L、1.55mg/L、1.6mg/L、1.65mg/L等；IAA的浓度还可以为0.09mg/L、0.10mg/L、0.11mg/L等；此范围内结果基本一致。

在再分化阶段，使用再分化培养基，其组成包括：MS培养基、6-BA、KT和蔗糖；脱分化培养基中6-BA的浓度为1.8～2.2mg/L，KT的浓度为0.08～0.12mg/L，蔗糖的浓度为40～60g/L。如在本发明不同的实施例中，6-BA的浓度还可以为1.9mg/L、2.0mg/L、2.1mg/L、2.15mg/L等；KT的浓度还可以为0.09mg/L、0.10mg/L、0.11mg/L等；以上范围内结果基本一致。

在生根壮苗阶段，使用生根壮苗培养基，其组成包括：MS培养基、6-BA、IAA和蔗糖；生根壮苗培养基中6-BA的浓度为0.8～1.2mg/L，IAA的浓度为0.2～0.4mg/L，蔗糖的浓度为40～60g/L。如在本发明不同的实施例中，6-BA的浓度还可以为0.9mg/L、1.0mg/L、1.1mg/L等；IAA的浓度还可以为0.25mg/L、0.30mg/L、0.35mg/L等；以上范围内结果基本一致。

在本发明不同的实施例中，脱分化培养基、再分化培养基、生根壮苗培养基中蔗糖的浓度均还可以为42g/L、45g/L、48g/L、50g/L、55g/L、58g/L等，此范围内结果基本一致。

优选地，所述脱分化培养基、再分化培养基、生根壮苗培养基的pH均为5.7～6.0。

如在本发明的不同实施例中，所述pH还可以为5.75、5.8、5.9等，此范围内结果基本一致。

在一些实施方式中，所述脱分化培养基中6-BA的浓度为1.5mg/L，IAA的浓度为0.10mg/L，蔗糖的浓度为50g/L；所述再分化培养基中6-BA的浓度为2.0mg/L，KT的浓度为0.10mg/L，蔗糖的浓度为50g/L；所述生根壮苗培养基中6-BA的浓度为1.0mg/L，IAA的浓度为0.3mg/L，蔗糖的浓度为50g/L。

在一些实施方式中，所述脱分化培养基、再分化培养基、生根壮苗培养基的组成还分别包括琼脂，各培养基中琼脂的浓度均为6～8g/L。

在一些实施方式中，各培养基中琼脂的浓度均为7g/L。

用琼脂制备固体培养基，后续操作简单易行。

本发明的一个方面还涉及凤头姜的组织培养方法，包括以下步骤：外植体消毒，茎尖的剥离，使用上述的培养基依次进行培养，得到组培苗；

所述依次进行培养的顺序是先使用脱分化培养基，再使用再分化培养基，最后使用生根壮苗培养基。

将外植体在无菌条件下接种到培养基上，进行愈伤组织的诱导、生长和发育。

在一些实施方式中，所述外植体消毒前，进行外植体的催芽，具体方法为：用50％多菌灵800倍液浸泡种姜15min，晾干后置于沙盘催芽，待种姜芽点萌发至1～2cm时，切取粗壮幼芽作为接种材料外植体。

在一些实施方式中，所述外植体消毒包括：在无菌环境下，依次用70％～75％酒精、质量分数为0.05％～0.15％HgCl₂溶液、质量分数为4％～6％次氯酸钠溶液进行消毒。

因为培养基含有丰富的营养，很容易引起杂菌污染。要达到彻底灭菌的目的，必须根据不同的对象采取不同的切实有效的方法灭菌，才能保证培养时不受杂菌的影响，使试管苗能正常生长。优选地，用70％～75％酒精清洗30s，质量分数为0.1％HgCl₂溶液浸泡15～20s，质量分数为5％次氯酸钠浸泡8～10min，无菌水冲洗3次。

在一些实施方式中，所述外植体灭菌前，在流水下冲洗1～2h，然后转入无菌条件下进行消毒处理。

在一些实施方式中，所述茎尖的剥离为在无菌环境下，将所述外植体剥离为带1～2个叶原基的长度为0.2～0.5mm的茎尖。

剥离茎尖的大小是影响脱毒率和成苗率的重要因素。离体茎尖越大，越易成活，但不易脱除病毒；茎尖越小，脱毒率越高，但成苗较难。本发明选择带1～2个叶原基的长度为0.2～0.5mm的茎尖较为适宜。在本发明不同的实施例中，茎尖的长度还可以为0.25、0.3、0.4、0.45mm等，此范围内结果基本一致。

在一些实施方式中，所述培养的条件均为在23～25℃、光照强度2000～3000Lx、光照时间15～17h/天的温室内进行培养。

脱分化培养、再分化培养和生根壮苗培养的培养均为此条件。在本发明不同的实施例中，培养的温度还可以为24℃，光照强度还可以为2200、2400、2500、2800、2900Lx等，光照时间还可为16h/天等，在此范围内结果基本一致。

本发明的一个方面还涉及凤头姜富硒原原种快繁方法，使用上述组织培养方法培养得到组培苗，然后将检测出无病毒的组培苗移栽到苗床中定植并繁殖；在生长中期的植株叶面处喷施有机硒；所述苗床含有生物有机肥，所述生物有机肥以天然富硒土壤区域内的畜禽粪便、农作物秸秆为主要原料。

利用天然硒资源，开展凤头姜富硒原原种生产，将凤头姜脱毒技术与硒富集栽培技术深度有机融合，不仅能有效克服种性退化、提高抗逆性、提升产品质量，还能有效增加人体对有机硒的摄入途径及凤头姜的商品附加值。

在一些实施方式中，本发明移栽地为湖北恩施。湖北恩施素有“世界硒都”之称，拥有世界唯一的独立硒矿床，可充分利用天然硒资源，十分有利于开展凤头姜富硒原原种的生产。在一些实施例中，生物有机肥为以天然富硒土壤区域内的畜禽粪便、农作物秸秆等为主要原料，通过无害化、腐熟处理，添加特定功能微生物，复合而成的微生物有机肥。

原原种是繁育推广良种的基础种子，它质量的优劣将影响繁殖后代的纯度和性状，因此必须保证其为脱毒种姜，才能有效克服种性退化，提高抗逆性，增加产量，提升品质。本发明利用组织培养技术，培育凤头姜原原种，可有效限制病毒在植物分生组织的扩散速度，快繁脱毒种姜，结合病毒检测，可更准确更快速的优选出无病毒感染的组培苗并进行繁殖，提高经济效益，节约时间及成本，且繁殖出的原原种种质优良。

在一些实施方式中，所述病毒包括烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒。

姜病毒病的病原主要为烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒，排除这两类病毒的感染，其病毒感染的概率可大大降低。

在一些实施方式中，所述检测方法为RT-PCR。

在一些实施方式中，所述检测的步骤包括：每个株系随机抽取1％～2％的试管苗，采用逆转录-聚合酶链式反应法(RT-PCR)进行烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒病毒检测。剔除有目的片段的株系，继代培养无目的片段的株系，其培养基同生根壮苗培养基。

在一些实施方式中，移栽的时间为待生姜组培苗生长旺盛、根系发达时；优选地，在组培苗有3～4片叶及4～5条根时进行移栽；优选地，所述炼苗的方法包括：将带有培养基的组培苗移入防虫网室放置5～7天，3～4d后打开瓶盖，2d后从瓶内取出幼苗，洗净根部培养基，放入1200倍多菌灵溶液中浸根，然后分成单株定植到基质中。

在一些实施方式中，所述移栽前，取出组培苗并清洗根部，先浸根于多菌灵中以预防病虫害，再移栽到苗床中。在一些实施例中，所述多菌灵为1200倍多菌灵溶液。在一些实施方式中，所述定植为按行距45～50cm，株距12～15cm进行定植。

以此行距和株距进行定植，可计算出每亩苗床中的苗数。

在一些实施例中，定植后浇足水。

在一些实施方式中，所述有机硒的喷施方法为：每隔10天喷1次，连续喷3次；优选地，所述喷施量为：以纯硒计，5～8g/亩。

在一些实施例中，选择晴朗无风的早上或傍晚进行喷施；优选地，喷施时以有水滴下落为宜，喷后当天下雨需立即补喷。在本发明不同的实施例中，所述有机硒的喷施量还可以为6g/亩、7g/亩等。

在一些实施方式中，所述生物有机肥的添加量为100～150kg/亩。

所述生物有机肥是以天然富硒土壤区域内的畜禽粪便、农作物秸秆等为主要原料，通过无害化、腐熟处理，添加特定功能微生物，复合而成的微生物有机肥料。在本发明不同的实施例中，所述生物有机肥的添加量还可以为110kg/亩、120kg/亩、130kg/亩、140kg/亩等。

在一些实施方式中，所述苗床中基质的组分包括草炭、珍珠岩、牛粪、蛭石，所述草炭、珍珠岩、牛粪、蛭石的重量比为(4.5～5.5):(1.8～2.2):(1～2):(1～2)。

在本发明不同的实施例中，所述草炭、珍珠岩、牛粪、蛭石的重量比还可以为5:2.0:1.5:1.5，4.5:2.2:1.0:1.5，5:2.2:1.0:1.0，5.5:1.8:1.0:1.0，5:1.8:1.5:1.0，5:2.0:1.0:2.0，5.1:2.1:1.2:1.7，5.2:2.0:1.8:1.4，4.8:2.0:1.5:1.2等，此范围内结果基本一致。

利用组织培养技术，培育凤头姜富硒原原种，能有效限制病毒在植物分生组织的扩散速度，快繁脱毒种姜。在繁殖时将凤头姜脱毒技术与硒富集栽培技术深度有机融合，更加有效克服种性退化，提高抗逆性，增加产量，提升品质。因此利用组培培养生产脱毒种苗的生产方式必将是一种大势所趋。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明的凤头姜组培培养基对凤头姜外植体的分化和生长有良好的作用，不仅能有效限制病毒在植物分生组织的扩散速度，快繁脱毒种姜，还具有操作简便、根系发达、成活率高、分蘖强、成本低等优点。

本发明的凤头姜富硒原原种快繁方法，操作简便、成本较低、繁殖系数高，且原原种大小均匀、发芽率高、长势一致、性状稳定。繁殖过程中结合病毒检测和硒富集栽培技术，即将种苗脱毒与硒富集栽培等技术深度有机融合。凤头姜原原种硒富集栽培技术，采用富硒生物有机底肥和叶面喷施生物有机硒肥等配套技术，生产的凤头姜原原种总硒含量可达57μg/100g(干基)，从而提高凤头姜的营养保健功能及商品附加值。

本发明的凤头姜组培培养基和培养方法，组培成功率高，且组培苗品质高，利于后续硒富集栽培技术的进行，与没有进行硒富集栽培相比，前者种苗抗逆性更强，且生产出的凤头姜品质更高。此外，若改变组培培养基的部分组分配比，不仅会影响凤头姜对硒的吸收及转化，还会影响凤头姜的脱毒率和繁殖系数。本发明的组培培养基和硒富集栽培方法的作用是相互联系的，共同决定了凤头姜原原种的长势、性状稳定性和硒含量。

具体实施方式

本发明中使用的MS基础培养基母液的配方如下：

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

外植体的培育：选用无病虫害、块大、粗壮、皮色鲜艳的凤头姜为培养材料，洗去泥土，用50％多菌灵800倍液浸泡15min，晾干后置于沙盘催芽。待种姜芽点萌发至1～2cm时，切取粗壮幼芽作为接种材料。

茎尖的剥离：将上步中的幼芽，在流水下冲洗1～2h，然后转入超净工作台进行操作，将其放入无菌烧杯内，用75％酒精清洗30s，0.1％HgCl₂溶液浸泡15～20s，5％次氯酸钠浸泡8～10min，无菌水冲洗3次。在解剖镜下用无菌解剖刀、解剖针剥取0.2～0.5mm带1个叶原基的茎尖进行接种。

组培苗的培养：将上步中的茎尖接种到脱分化培养基中，在23～25℃、光照强度2000Lx、光照时间16h/天的温室内培养。其脱分化培养基为：MS+6-BA 1.5mg/L+IAA 0.1mg/L+蔗糖50g/L+琼脂7g/L，pH值为5.8；

待茎尖生长到1～2cm时，接种到再分化培养基中，在23～25℃、光照强度2000Lx、光照时间16h/天的温室内培养。其再分化培养基为：MS+6-BA 2.0mg/L+KT 0.1mg/L+蔗糖50g/L+琼脂7g/L，pH值为5.8；

待不定芽生长到1～3cm时，接种到生根壮苗培养基中，在23～25℃、光照强度2000Lx、光照时间16h/天的温室内培养。其生根壮苗培养基为：MS+6-BA 1.0mg/L+IAA0.3mg/L+蔗糖50g/L+琼脂7g/L，pH值为5.8；

病毒检测与扩繁：每个株系随机抽取1％～2％的试管苗，采用逆转录-聚合酶链式反应法(RT-PCR)进行烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒等病毒检测。组培苗总RNA的提取和反转录方法根据试剂盒说明书进行。根据Genebank中已报道的序列，通过Primer 5软件设计正反向引物，采用50ul PCR反应体系，扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳，5V/cm恒压条件下电泳30min左右，在凝胶成像系统下观察是否有目的基因大小的条带出现。剔除有目的片段的株系，扩繁无目的片段的株系，其培养基与不定芽生根壮苗相同。

炼苗移栽：移栽地为湖北恩施地区。将生长旺盛、根系发达的生姜组培苗(3～4片叶，4～5条根)移入防虫网室，3d后打开瓶盖，2d后从瓶内取出幼苗，洗净根部培养基，放入1200倍多菌灵溶液中浸根，然后分成单株移栽到苗床中，按行距45～50cm，株距12～15cm定植，浇足定根水。苗床的基质(草炭:珍珠岩:牛粪:蛭石＝5:2:1.5:1.5)中添加生物有机肥(以湖北恩施天然富硒土壤区域内的畜禽粪便、农作物秸秆等为主要原料，通过无害化、腐熟处理，添加特定功能微生物，复合而成的微生物有机肥料)140kg/亩。在凤头姜植株生长中期，每隔10天选择晴朗无风的早上或傍晚，叶面喷施生物有机硒6g/亩(以纯硒计)，连续喷3次，叶面喷施生物有机硒6g/亩(以纯硒计)，以有水滴下落为宜，喷后当天下雨需立即补喷。其他按常规生姜大田生产管理。

实施例2

外植体的培育：选用无病虫害、块大、粗壮、皮色鲜艳的凤头姜为培养材料，洗去泥土，用50％多菌灵800倍液浸泡15min，晾干后置于沙盘催芽。待种姜芽点萌发至1～2cm时，切取粗壮幼芽作为接种材料。

茎尖的剥离：将上步中的幼芽，在流水下冲洗1～2h，然后转入超净工作台进行操作，将其放入无菌烧杯内，用75％酒精清洗30s，0.1％HgCl₂溶液浸泡15～20s，5％次氯酸钠浸泡8～10min，无菌水冲洗3次。在解剖镜下用无菌解剖刀、解剖针剥取0.2～0.5mm带1个叶原基的茎尖进行接种。

组培苗的培养：将上步中的茎尖接种到脱分化培养基中，在23～25℃、光照强度2500Lx、光照时间15h/天的温室内培养。其脱分化培养基为：MS+6-BA 1.3mg/L+IAA0.12mg/L+蔗糖40g/L+琼脂7g/L，pH值为5.9；

待无菌苗生长到1～2cm时，接种到再分化培养基中，在23～25℃、光照强度3000Lx、光照时间17h/天的温室内培养。其再分化培养基为：MS+6-BA 2.2mg/L+KT 0.12mg/L+蔗糖40g/L+琼脂6g/L，pH值为5.8；

待不定芽生长到1～3cm时，接种到生根壮苗培养基中，在23～25℃、光照强度2800Lx、光照时间16h/天的温室内培养。其生根壮苗培养基为：MS+6-BA 1.2mg/L+IAA0.4mg/L+蔗糖40g/L+琼脂6g/L，pH值为5.9；

病毒检测与扩繁：每个株系随机抽取1％～2％的试管苗，采用逆转录-聚合酶链式反应法(RT-PCR)进行烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒等病毒检测。组培苗总RNA的提取和反转录方法根据试剂盒说明书进行。根据Genebank中已报道的序列，通过Primer 5软件设计正反向引物，采用50ul PCR反应体系，扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳，5V/cm恒压条件下电泳30min左右，在凝胶成像系统下观察是否有目的基因大小的条带出现。剔除有目的片段的株系，扩繁无目的片段的株系，其培养基与不定芽生根壮苗相同。

炼苗移栽：将生长旺盛、根系发达的生姜组培苗(3～4片叶，4～5条根)移入防虫网室，3d后打开瓶盖，2d后从瓶内取出幼苗，洗净根部培养基，放入1200倍多菌灵溶液中浸根，然后分成单株移栽到苗床中，按行距45～50cm，株距12～15cm定植，浇足定根水。苗床的基质(草炭:珍珠岩:牛粪:蛭石＝5:2.2:1.0:1.5)中添加生物有机肥(以湖北恩施天然富硒土壤区域内的畜禽粪便、农作物秸秆等为主要原料，通过无害化、腐熟处理，添加特定功能微生物，复合而成的微生物有机肥料)100kg/亩。在凤头姜植株生长中期，每隔10天选择晴朗无风的早上或傍晚，叶面喷施生物有机硒6g/亩(以纯硒计)，连续喷3次，以有水滴下落为宜，喷后当天下雨需立即补喷。其他按常规生姜大田生产管理。

实施例3

外植体的培育：选用无病虫害、块大、粗壮、皮色鲜艳的凤头姜为培养材料，洗去泥土，用50％多菌灵800倍液浸泡15min，晾干后置于沙盘催芽。待种姜芽点萌发至1～2cm时，切取粗壮幼芽作为接种材料。

茎尖的剥离：将上步中的幼芽，在流水下冲洗1～2h，然后转入超净工作台进行操作，将其放入无菌烧杯内，用75％酒精清洗30s，0.1％HgCl₂溶液浸泡15～20s，5％次氯酸钠浸泡8～10min，无菌水冲洗3次。在解剖镜下用无菌解剖刀、解剖针剥取0.2～0.5mm带1个叶原基的茎尖进行接种。

组培苗的培养：将上步中的茎尖接种到脱分化培养基中，在23～25℃、光照强度2800Lx、光照时间16h/天的温室内培养。其脱分化培养基为：MS+6-BA 1.7mg/L+IAA0.08mg/L+蔗糖60g/L+琼脂7g/L，pH值为6.0；

待无菌苗生长到1～2cm时，接种到再分化培养基中，在23～25℃、光照强度2500Lx、光照时间16h/天的温室内培养。其再分化培养基为：MS+6-BA 1.8mg/L+KT 0.08mg/L+蔗糖60g/L+琼脂8g/L，pH值为5.8；

待不定芽生长到1～3cm时，接种到生根壮苗培养基中，在23～25℃、光照强度2200Lx、光照时间16h/天的温室内培养。其生根壮苗培养基为：MS+6-BA 0.8mg/L+IAA0.2mg/L+蔗糖55g/L+琼脂7g/L，pH值为5.9；

病毒检测与扩繁：每个株系随机抽取1％～2％的试管苗，采用逆转录-聚合酶链式反应法(RT-PCR)进行烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒等病毒检测。组培苗总RNA的提取和反转录方法根据试剂盒说明书进行。根据Genebank中已报道的序列，通过Primer 5软件设计正反向引物，采用50ul PCR反应体系，扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳，5V/cm恒压条件下电泳30min左右，在凝胶成像系统下观察是否有目的基因大小的条带出现。剔除有目的片段的株系，扩繁无目的片段的株系，其培养基与不定芽生根壮苗相同。

炼苗移栽：将生长旺盛、根系发达的生姜组培苗(3～4片叶，4～5条根)移入防虫网室，3d后打开瓶盖，2d后从瓶内取出幼苗，洗净根部培养基，放入1200倍多菌灵溶液中浸根，然后分成单株移栽到苗床中，按行距45～50cm，株距12～15cm定植，浇足定根水。苗床的基质(草炭:珍珠岩:牛粪:蛭石＝5:2.0:1.8:1.4)中添加生物有机肥(以湖北恩施天然富硒土壤区域内的畜禽粪便、农作物秸秆等为主要原料，通过无害化、腐熟处理，添加特定功能微生物，复合而成的微生物有机肥料)150kg/亩。在凤头姜植株生长中期，每隔10天选择晴朗无风的早上或傍晚，叶面喷施生物有机硒6g/亩(以纯硒计)，连续喷3次，以有水滴下落为宜，喷后当天下雨需立即补喷。其他按常规生姜大田生产管理。

实施例4

外植体的培育：选用无病虫害、块大、粗壮、皮色鲜艳的凤头姜为培养材料，洗去泥土，用50％多菌灵800倍液浸泡15min，晾干后置于沙盘催芽。待种姜芽点萌发至1～2cm时，切取粗壮幼芽作为接种材料。

茎尖的剥离：将上步中的幼芽，在流水下冲洗1～2h，然后转入超净工作台进行操作，将其放入无菌烧杯内，用75％酒精清洗30s，0.1％HgCl₂溶液浸泡15～20s，5％次氯酸钠浸泡8～10min，无菌水冲洗3次。在解剖镜下用无菌解剖刀、解剖针剥取0.2～0.5mm带1个叶原基的茎尖进行接种。

组培苗的培养：将上步中的茎尖接种到脱分化培养基中，在24℃、光照强度2500Lx、光照时间16h/天的温室内培养。其脱分化培养基为：MS+6-BA 1.6mg/L+IAA0.11mg/L+蔗糖48g/L+琼脂7g/L，pH值为5.8；

待无菌苗生长到1～2cm时，接种到再分化培养基中，在23～25℃、光照强度2400Lx、光照时间15h/天的温室内培养。其再分化培养基为：MS+6-BA 1.9mg/L+KT 0.11mg/L+蔗糖50g/L+琼脂8g/L，pH值为5.8；

待不定芽生长到1～3cm时，接种到生根壮苗培养基中，在23～25℃、光照强度2700Lx、光照时间17h/天的温室内培养。其生根壮苗培养基为：MS+6-BA 1.0mg/L+IAA0.3mg/L+蔗糖55g/L+琼脂7g/L，pH值为5.9；

病毒检测与扩繁：每个株系随机抽取1％～2％的试管苗，采用逆转录-聚合酶链式反应法(RT-PCR)进行烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒等病毒检测。组培苗总RNA的提取和反转录方法根据试剂盒说明书进行。根据Genebank中已报道的序列，通过Primer 5软件设计正反向引物，采用50ul PCR反应体系，扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳，5V/cm恒压条件下电泳30min左右，在凝胶成像系统下观察是否有目的基因大小的条带出现。剔除有目的片段的株系，扩繁无目的片段的株系，其培养基与不定芽生根壮苗相同。

炼苗移栽：将生长旺盛、根系发达的生姜组培苗(3～4片叶，4～5条根)移入防虫网室，3d后打开瓶盖，2d后从瓶内取出幼苗，洗净根部培养基，放入1200倍多菌灵溶液中浸根，然后分成单株移栽到苗床中，按行距45～50cm，株距12～15cm定植，浇足定根水。苗床的基质(草炭:珍珠岩:牛粪:蛭石＝5:2.2:1.0:1.0))中添加生物有机肥(以湖北恩施天然富硒土壤区域内的畜禽粪便、农作物秸秆等为主要原料，通过无害化、腐熟处理，添加特定功能微生物，复合而成的微生物有机肥料)120kg/亩。在凤头姜植株生长中期，每隔10天选择晴朗无风的早上或傍晚，叶面喷施生物有机硒6g/亩(以纯硒计)，连续喷3次，以有水滴下落为宜，喷后当天下雨需立即补喷。其他按常规生姜大田生产管理。

实验例1

不同培养基对凤头姜愈伤组织诱导率、出芽时间、出芽率和生根率的影响。

对比例的设置，以实施例1为基础设置对比例，具体设置方式如下：

对比例1：将脱分化培养基中的IAA改为等浓度的NAA，其余步骤同实施例1，观察并记录愈伤组织形成情况和成活情况，计算愈伤组织诱导率、成活率；

对比例2：将生根壮苗培养基中的IAA改为等浓度的NAA，其余步骤同实施例1，观察并记录生根情况，计算生根率；

对比例3：将脱分化培养基中6-BA的浓度改为1.0mg/L，其余步骤同实施例1，观察并记录愈伤组织形成情况和成活情况，计算愈伤组织诱导率、成活率；

对比例4：将脱分化培养基中6-BA的浓度改为1.8mg/L，其余步骤同实施例1，观察并记录愈伤组织形成情况和成活情况，计算愈伤组织诱导率、成活率；

对比例5：将再分化培养基中6-BA的浓度改为1.5mg/L，其余步骤同实施例1，观察出芽情况和出芽时间，计算出芽率；

对比例6：将再分化培养基中6-BA的浓度改为2.3mg/L，其余步骤同实施例1，观察出芽情况和出芽时间，计算出芽率；

对比例7：将生根壮苗培养基中的6-BA浓度改为0.5mg/L，IAA的浓度改为0.5mg/L，其余步骤同实施例1，观察并记录生根情况，计算生根率；

对比例8：将生根壮苗培养基中的6-BA浓度改为1.4mg/L，IAA的浓度改为0.1mg/L，其余步骤同实施例1，观察并记录生根情况，计算生根率；

对比例9：将脱分化培养基和生根壮苗培养基中的IAA改为等浓度的NAA，脱分化培养基中6-BA的浓度改为1.0mg/L，再分化培养基中6-BA的浓度改为1.5mg/L，将生根壮苗培养基中的6-BA浓度改为0.5mg/L，IAA的浓度改为0.5mg/L，观察并记录愈伤组织形成情况、出芽情况、出芽时间和生根情况，计算愈伤组织诱导率、出芽率、成活率和生根率；

愈伤组织诱导率＝生成愈伤组织的苗数/接种数×100％；

出芽率＝出芽外植体数/接种数×100％；

成活率＝成活的组培苗数/接种数×100％；

生根率＝生根苗数/接种数×100％；

统计结果见表1。

表1不同培养基组成对愈伤组织诱导率、出芽时间、出芽率、成活率和生根率的影响

每组实验进行三次。

比较实施例1和对比例1可以看出，将脱分化培养基中的IAA改为等质量的NAA后，愈伤组织诱导率从100.0％降到了85.0％，成活率从96.5％降到了48.3％，说明对于形成愈伤组织和成活率IAA的效果优于NAA，并且IAA的价格低于NAA，选择IAA作为生长素，效果更好且可降低成本；

比较实施例1和对比例2可以看出，将生根壮苗培养基中的IAA改为等质量的NAA后，生根率从99.0％降低到了85.0％，说明对于生根IAA的效果优于NAA，选择IAA作为生长素，效果更好且可降低成本；

比较实施例1和对比例3可以看出，将脱分化培养基中的6-BA浓度降低到1.0mg/L，对于愈伤组织诱导率有较大的影响，其从100.0％降低到了81.0％，成活率从96.5％降到了60.5％％，说明若6-BA浓度低于本发明的范围值不利于愈伤组织的形成及成活；

比较实施例1和对比例4可以看出，将脱分化培养基中的6-BA浓度升高到1.8mg/L，对于愈伤组织诱导率有较大的影响，其从100.0％降低到了85.5％，成活率从96.5％降到了72.5％，说明若6-BA浓度过高，高于本发明的范围值不利于愈伤组织的形成及成活；

比较实施例1和对比例5可以看出，将再分化培养基中的6-BA浓度降低到1.5mg/L，对于出芽率有较大的影响，其从100.0％降低到了86.5％，且出芽时间推迟了12天，说明若6-BA浓度低于本发明的范围值不利于芽的形成；

比较实施例1和对比例6可以看出，将再分化培养基中的6-BA浓度升高到2.3mg/L，对于出芽率有较大的影响，其从100.0％降低到了84.0％，且出芽时间推迟了10天，说明若6-BA浓度高于本发明的范围值则不利于芽的形成；

比较实施例1和对比例7可以看出，将生根壮苗培养基中的6-BA浓度改为0.5mg/L，IAA的浓度改为0.5mg/L，即6-BA的浓度低于本发明的范围值，IAA浓度高于本发明的范围值，生根率从99.0％降低到了86.5％，说明改变6-BA和IAA的浓度不利于生根；

比较实施例1和对比例8可以看出，将生根壮苗培养基中的6-BA浓度改为1.4mg/L，IAA的浓度改为0.1mg/L，即6-BA的浓度高于本发明的范围值，IAA浓度低于本发明的范围值，生根率从99.0％降低到了82.0％，说明改变6-BA和IAA的浓度不利于生根；

比较实施例1和对比例9可以看出，将脱分化培养基和生根壮苗培养基中的IAA改为等浓度的NAA，脱分化培养基中6-BA的浓度改为1.0mg/L，再分化培养基中6-BA的浓度改为1.5mg/L，将生根壮苗培养基中的GA₃浓度改为0.5mg/L，IAA的浓度改为0.5mg/L，愈伤组织诱导率从100.0％降低到了78.0％；出芽时间推迟了17天，出芽率从100.0％降低到了72.5％，生根率从99.0％降低到了32.5％，说明本申请提供的方案对凤头姜的组织培养有很强的适用性，若改变其中培养基的组成和用量，组织培养的成功率显著下降。

实验例2

不同培养基和硒富集栽培对凤头姜原原种品质的影响。

对比例的设置：

以实施例1为基础设置对比例10，在移栽时不添加生物有机肥，生长中期不喷生物有机硒，其余均与实施例1中的操作相同；

以对比例9为基础设置对比例11，在移栽时不添加生物有机肥，生长中期不喷生物有机硒，其余均与对比例11中的操作相同；

实施例1、对比例1、对比例5、对比例9、对比例10和对比例11生长出的凤头姜原原种的繁殖系数、脱毒率及硒含量进行测定和计算，结果见表2。

繁殖系数＝总姜苗数/接种数。

表2不同培养基组成和硒富集栽培对凤头姜原原种品质的影响

每组实验进行三次。

从表2可以看出，本发明实施例生产的凤头姜原原种繁殖系数高，脱毒率高，且硒含量可达到57μg/100g。若改变组培培养基的部分成分或组分含量，原原种的硒含量明显下降，说明培养基的组成不仅能有效干预凤头姜对硒的吸收及转化，还能影响凤头姜的脱毒率和繁殖系数。对比实施例1和对比例10、11，说明硒富集栽培可有效提高凤头姜的抗逆性、姜块含硒量及繁殖系数，从而提高其商品性，增强市场竞争力。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种凤头姜组培培养基，其特征在于，所述培养基包括脱分化培养基、再分化培养基、生根壮苗培养基；

所述脱分化培养基的组成包括：MS培养基、6-BA、IAA和蔗糖；所述脱分化培养基中6-BA的浓度为1.3～1.7mg/L，IAA的浓度为0.08～0.12mg/L，蔗糖的浓度为40～60g/L；

所述再分化培养基的组成包括：MS培养基、6-BA、KT和蔗糖；所述再分化培养基中6-BA的浓度为1.8～2.2mg/L，KT的浓度为0.08～0.12mg/L，蔗糖的浓度为40～60g/L；

所述生根壮苗培养基的组成包括：MS培养基、6-BA、IAA和蔗糖；所述生根壮苗培养基中6-BA的浓度为0.8～1.2mg/L，IAA的浓度为0.2～0.4mg/L，蔗糖的浓度为40～60g/L；

优选地，所述脱分化培养基、再分化培养基、生根壮苗培养基的pH均为5.7～6.0。

2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述脱分化培养基中6-BA的浓度为1.5mg/L，IAA的浓度为0.10mg/L，蔗糖的浓度为50g/L；

所述再分化培养基中6-BA的浓度为2.0mg/L，KT的浓度为0.10mg/L，蔗糖的浓度为50g/L；

所述生根壮苗培养基中6-BA的浓度为1.0mg/L，IAA的浓度为0.3mg/L，蔗糖的浓度为50g/L。

3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述脱分化培养基、再分化培养基、生根壮苗培养基的组成还分别包括琼脂，各培养基中琼脂的浓度均为6～8g/L；

优选地，各培养基中琼脂的浓度均为7g/L。

4.一种凤头姜的组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤：外植体消毒，茎尖的剥离，使用权利要求1～3任一项所述的培养基依次进行培养，得到组培苗；

所述依次进行培养的顺序是先使用脱分化培养基，再使用再分化培养基，最后使用生根壮苗培养基。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述外植体消毒包括：在无菌环境下，依次用70％～75％酒精、质量分数为0.05％～0.15％HgCl₂溶液、质量分数为4％～6％次氯酸钠溶液进行消毒。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述茎尖的剥离为在无菌环境下，将所述外植体剥离为带1～2个叶原基的长度为0.2～0.5mm的茎尖。

7.一种凤头姜富硒原原种快繁方法，其特征在于，使用权利要求4～6任一项所述的组织培养方法培养得到组培苗，然后将检测出无病毒的组培苗移栽到苗床中定植并繁殖；在生长中期的植株叶面处喷施有机硒；所述苗床含有生物有机肥，所述生物有机肥以天然富硒土壤区域内的畜禽粪便、农作物秸秆为主要原料。

8.根据权利要求7所述的快繁方法，其特征在于，所述病毒包括烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒；优选地，所述检测方法为RT-PCR。

9.根据权利要求7所述的快繁方法，其特征在于，所述定植为按行距45～50cm，株距12～15cm进行定植；

优选地，所述有机硒的喷施方法为：每隔10天喷1次，连续喷3次；优选地，所述喷施量为：以纯硒计，5～8g/亩；

优选地，所述生物有机肥的添加量为100～150kg/亩。

10.根据权利要求7所述的快繁方法，其特征在于，所述移植为移栽到基质中，所述基质的组分包括草炭、珍珠岩、牛粪、蛭石，所述草炭、珍珠岩、牛粪、蛭石的重量比为5:(1.8～2.2):(1～2):(1～2)。