CN104429963B - 一种马蔺游离花粉培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种马蔺游离花粉培养方法，包括：外植体的选择与消毒，接种培养，培养获得愈伤组织；继代增殖培养，生根培养，炼苗移栽等步骤。本发明首次采用马蔺花药作为外植体对马蔺进行快速繁殖，并且繁殖效率高，在继代增殖过程中，将未污染的愈伤组织转入第一继代培养基中使芽增殖，继代5次，转入第二继代培养基或不添加任何激素的空白培养基中继代一次，然后再转入第一继代培养基中继续增殖，这种操作大大降低了继代培养过程中的变异率，提高了繁殖效率。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及一种马蔺游离花粉培养方法。
背景技术
马蔺，多年生密丛草本。根状茎粗壮，木质，斜伸，外包有大量致密的红紫色折断的老叶残留叶鞘及毛发状的纤维。生于荒地、路旁、山坡草地，尤以过度放牧的盐碱化草场上生长较多。耐盐碱、耐践踏，根系发达，可用于水土保持和改良盐碱土。
马蔺还具有重要的药用、饲用和工业价值。马蔺利用年限长，产草量高，营养成分丰富，为各类牲畜尤其是绵羊喜食。马蔺的花、种子、根均可人药。花晒干服用可利尿通便；种子和根可除湿热、止血、解毒种子有退烧、解毒、驱虫的功效。作为纤维植物，可以代替麻生产纸、绳，叶是编制工艺品的原料，根可以制作刷子。真可谓“马蔺全身是宝”。
为克服利用马蔺种子发芽进行有性繁殖的局限性，北京草业与环境研究发展中心与北京农业生物技术研究中心于2002年开展合作研究，筛选出了“成熟种胚----诱导愈伤组织----绿苗分化----继代增殖----生根----试管苗移栽”等全过程中各环节的最佳培养基和操作程序，从而建立起一套行之有效的马蔺组织培养快繁体系，为实现马蔺快速无性繁殖，大幅度降低马蔺建植成本，奠定了基础。同时，也为今后开展马蔺体细胞无性系变异体筛选乃至基因工程改良等生物技术育种工作奠定了可靠的技术基础。
“马蔺组织培养快速繁殖体系的研究”(肖阔，中国农业大学，硕士论文，2003)一文中，同样公开了采用成熟种胚进行马蔺组织培养快速繁殖的，并且系统公开了其快速繁殖体系的建立。
目前，马蔺的无性繁殖一般采用的是成熟种胚，但是种子采集比较困难，并且不易采收到成熟种子，因此在实际应用过程中会受到限制。
发明内容
针对目前存在的问题，本发明提供一种马蔺游离花粉培养方法，可以快速有效的繁殖马蔺，成活率较高，打破种子繁殖受限制的问题，并且不受季节的影响，大幅度降低增殖成本，满足规模化生产需要。
为了解决上述问题，本发明提供如下技术方案：
一种马蔺游离花粉培养方法，包括：
1)外植体的选择与消毒：取单核靠边期的花药进行消毒处理；
2)接种培养：接种愈伤组织诱导培养基，培养获得愈伤组织；
3)继代增殖培养：将未污染的愈伤组织转入第一继代培养基中使芽增殖，继代5次，转入第二继代培养基或不添加任何激素的空白培养基中继代一次，然后再转入第一继代培养基中继续增殖，根据需苗量重复上述步骤；
4)生根培养：接种生根培养基，筛选获得单体植株；
5)炼苗移栽：先将培养瓶移至温室，自然条件下炼苗3～5d，待马蔺苗健壮且有5-7片真叶、6-8cm高时，然后解开封口膜，炼苗6～7d，炼苗完成后取出小苗洗净根部附着的培养基，移栽到经消毒的基质中，温度控制在24-26℃，前7d湿度控制在70％左右，以后逐渐降低湿度，直至将移栽苗置于自然条件下，炼苗移栽期间适当遮光，使光照强度为自然光的40％。
所述的消毒处理是将花药用无菌纱布包裹浸入70-75％浓度的酒精中消毒10-16s，快速取出立即浸入漂白粉中浸泡10min，最后用无菌水冲洗4～6次。
所述的接种培养基为：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L；
所述接种培养基的pH为6.0，培养温度为25±1℃，12h/d的光周期，光照强度600Lx。
所述的第一继代培养基为1/2MS+6-BA1.0mg/L+2，4-D0.1mg/L+NAA 0.2mg/L+琼脂5g/L+蔗糖20g/L；
所述第二继代培养基为1/2MS+6-BA 0.3mg/L+NAA 0.1mg/L+白砂糖24g/L+琼脂8g/L；
所述空白培养基为1/2MS+蔗糖30g/L；
所述继代培养过程中，培养基的pH为6.0，培养温度为25±1℃，24h/d的光周期，光照强度1000Lx。
所述的生根培养基为：1/2MS+IAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+活性炭质量比0.1％～0.3％；
所述生根培养条件为：培养基的pH为6.0，培养温度为25±1℃，24h/d的光周期，光照强度1200Lx。
有益效果：
(1)将花药作为马蔺快速繁殖的外植体，还属于首创，发明人经过大量长期实践操作，发现将花药作为外植体可以长期保持其优良的性状，并且出愈率高。将花药作为外植体，具有花粉萌发成胚时间短、加倍效率高、产量大及较容易获得优良育种中间材料等优点，在育种材料提纯复壮、种质资源创新、多倍体育种及花粉发育进程研究等方面内容，具有较大的实用价值；
(2)发明人发现，在工厂化育苗过程中，继代超过5代左右，开始出现变异，经研究发现，上述原因是激素累积导致，因此，在继代培养过程中，采用了转换培养基的方法，减少激素的累积给马蔺苗的影响；
(3)本发明培养过程速度快，再生频率较高，变异率较低，周期相对较短，能较好地保持马蔺的遗传稳定性。
具体实施方式
(一)外植体的选择
将采收的花药、成熟的种胚、茎尖、花瓣、茎节、叶片、未成熟种子分别作为外植体进行对比，分别在合适的季节进行采收，采收后马上进行操作，其余条件相同，并且按照本发明的步骤进行，见表1，从对比可以看出，叶片、未成熟种子不适于做马蔺组织培养的材料，茎节虽然出现了愈伤组织，但是在继代过程中生长缓慢，生根质量较差。茎尖和成熟的种胚都可以作为马蔺组织培养的材料，但是其愈伤组织的诱导率和生根率相对较低，并且变异率相对较高，采用花药作为外植体，不仅愈伤组织的诱导率和生根率最高，分别可以达到82％、92％，而且经过5代继代培养没有产生变异，可以解决马蔺繁殖过程中容易出现变异的难题。
表1
表中“-”表示不存在。
具体实施例1
一种马蔺游离花粉培养方法，包括：
1)外植体的选择与消毒：取单核靠边期的花药进行消毒处理；
2)接种培养：接种愈伤组织诱导培养基，培养获得愈伤组织；
3)继代增殖培养：将未污染的愈伤组织转入第一继代培养基中使芽增殖，继代5次，转入第二继代培养基继代一次，然后再转入第一继代培养基中继续增殖，根据需苗量重复上述步骤；
4)生根培养：接种生根培养基，筛选获得单体植株；
5)炼苗移栽：先将培养瓶移至温室，自然条件下炼苗5d，待马蔺苗健壮且有5-7片真叶、6-8cm高时，然后解开封口膜，炼苗6d，炼苗完成后取出小苗洗净根部附着的培养基，移栽到经消毒的基质中，温度控制在24-26℃，前7d湿度控制在70％左右，以后逐渐降低湿度，直至将移栽苗置于自然条件下，炼苗移栽期间适当遮光，使光照强度为自然光的40％。
所述的消毒处理是将花药用无菌纱布包裹浸入70-75％浓度的酒精中消毒12s，快速取出立即浸入漂白粉中浸泡10min，最后用无菌水冲洗5次。
所述的接种培养基为：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L；
所述接种培养基的PH为6.0，培养温度为25±1℃，12h/d的光周期，光照强度600Lx。
所述的第一继代培养基为1/2MS+6-BA1.0mg/L+2，4-D0.1mg/L+NAA 0.2mg/L+琼脂5g/L+蔗糖20g/L；
所述第二继代培养基为1/2MS+6-BA 0.3mg/L+NAA 0.1mg/L+白砂糖24g/L+琼脂8g/L；
所述继代培养过程中，培养基的PH为6.0，培养温度为25±1℃，24h/d的光周期，光照强度1000Lx。
所述的生根培养基为：1/2MS+IAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+活性炭质量比0.1％～0.3％；
所述生根培养条件为：培养基的PH为6.0，培养温度为25±1℃，24h/d的光周期，光照强度1200Lx。
具体实施例2
一种马蔺游离花粉培养方法，包括：
1)外植体的选择与消毒：取单核靠边期的花药进行消毒处理；
2)接种培养：接种愈伤组织诱导培养基，培养获得愈伤组织；
3)继代增殖培养：将未污染的愈伤组织转入第一继代培养基中使芽增殖，继代5次，转入不添加任何激素的空白培养基中继代一次，然后再转入第一继代培养基中继续增殖，根据需苗量重复上述步骤；
4)生根培养：接种生根培养基，筛选获得单体植株；
5)炼苗移栽：先将培养瓶移至温室，自然条件下炼苗3d，待马蔺苗健壮且有5-7片真叶、6-8cm高时，然后解开封口膜，炼苗7d，炼苗完成后取出小苗洗净根部附着的培养基，移栽到经消毒的基质中，温度控制在24-26℃，前7d湿度控制在70％左右，以后逐渐降低湿度，直至将移栽苗置于自然条件下，炼苗移栽期间适当遮光，使光照强度为自然光的40％。
所述的消毒处理是将花药用无菌纱布包裹浸入75％浓度的酒精中消毒10s，快速取出立即浸入漂白粉中浸泡10min，最后用无菌水冲洗6次。
所述的接种培养基为：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L；
所述接种培养基的PH为6.0，培养温度为25±1℃，12h/d的光周期，光照强度600Lx。
所述的第一继代培养基为1/2MS+6-BA1.0mg/L+2，4-D0.1mg/L+NAA 0.2mg/L+琼脂5g/L+蔗糖20g/L；
所述空白培养基为1/2MS+蔗糖30g/L；
所述继代培养过程中，培养基的PH为6.0，培养温度为25±1℃，24h/d的光周期，光照强度1000Lx。
所述的生根培养基为：1/2MS+IAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+活性炭质量比0.1％～0.3％；
所述生根培养条件为：培养基的PH为6.0，培养温度为25±1℃，24h/d的光周期，光照强度1200Lx。
对比实施例
一种马蔺游离花粉培养方法，包括：
1)外植体的选择与消毒：取单核靠边期的花药进行消毒处理；
2)接种培养：接种愈伤组织诱导培养基，培养获得愈伤组织；
3)继代增殖培养：将未污染的愈伤组织转入第一继代培养基中使芽增殖，连续继代培养；
4)生根培养：接种生根培养基，筛选获得单体植株；
5)炼苗移栽：先将培养瓶移至温室，自然条件下炼苗3d，待马蔺苗健壮且有5-7片真叶、6-8cm高时，然后解开封口膜，炼苗7d，炼苗完成后取出小苗洗净根部附着的培养基，移栽到经消毒的基质中，温度控制在24-26℃，前7d湿度控制在70％左右，以后逐渐降低湿度，直至将移栽苗置于自然条件下，炼苗移栽期间适当遮光，使光照强度为自然光的40％。
所述的消毒处理是将花药用无菌纱布包裹浸入75％浓度的酒精中消毒10s，快速取出立即浸入漂白粉中浸泡10min，最后用无菌水冲洗6次。
所述的接种培养基为：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L；
所述接种培养基的PH为6.0，培养温度为25±1℃，12h/d的光周期，光照强度600Lx。
所述继代培养过程中，培养基的PH为6.0，培养温度为25±1℃，24h/d的光周期，光照强度1000Lx。
所述的生根培养基为：1/2MS+IAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+活性炭质量比0.1％～0.3％；
所述生根培养条件为：培养基的PH为6.0，培养温度为25±1℃，24h/d的光周期，光照强度1200Lx。
将对比实施例与具体实施例1、具体实施例2进行对比，结果见表2，从对比结果可以看出，在经过几代继代培养后，转换培养基的条件，可以使其变异率大大降低，有效的结果在继代过程中出现变异的现象，可以大大提高马蔺的繁殖效率。
表2
| 对比 | 变异率(％) |
| 对比实施例 | 34 |
| 具体实施例1 | 2 |
| 具体实施例2 | 0 |
Claims (1)
1.一种马蔺游离花粉培养方法，包括：1)外植体的选择与消毒：取单核靠边期的花药进行消毒处理，将花药用无菌纱布包裹浸入70-75％浓度的酒精中消毒10-16s，快速取出立即浸入漂白粉中浸泡10min，最后用无菌水冲洗4～6次；2)接种培养：接种愈伤组织诱导培养基，接种培养基为：MS+6-BA1.0mg/L+NAA 0.2mg/L；培养基的pH为6.0，培养温度为25±1℃，12h/d的光周期，光照强度600Lx，培养获得愈伤组织；3)继代增殖培养：将未污染的愈伤组织转入第一继代培养基中使芽增殖，继代5次，转入第二继代培养基或不添加任何激素的空白培养基中继代一次，然后再转入第一继代培养基中继续增殖，根据需苗量重复上述步骤；4)生根培养：接种生根培养基，筛选获得单体植株；5)炼苗移栽：先将培养瓶移至温室，自然条件下炼苗3～5d，待马蔺苗健壮且有5-7片真叶、6-8cm高时，然后解开封口膜，炼苗6～7d，炼苗完成后取出小苗洗净根部附着的培养基，移栽到经消毒的基质中，温度控制在24-26℃，前7d湿度控制在70％，以后逐渐降低湿度，直至将移栽苗置于自然条件下，炼苗移栽期间适当遮光，使光照强度为自然光的40％；所述的第一继代培养基为1/2MS+6-BA1.0mg/L+2，4-D 0.1mg/L+NAA 0.2mg/L+琼脂5g/L+蔗糖20g/L；所述第二继代培养基为1/2MS+6-BA 0.3mg/L+NAA 0.1mg/L+白砂糖24g/L+琼脂8g/L；所述空白培养基为1/2MS+蔗糖30g/L，继代培养过程中，培养基的pH为6.0，培养温度为25±1℃，24h/d的光周期，光照强度1000Lx；所述的生根培养基为：1/2MS+IAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+活性炭质量比0.1％～0.3％；培养条件为：培养基的pH为6.0，培养温度为25±1℃，24h/d的光周期，光照强度1200Lx。
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