CN104255532B - 一种养心菜的组织培养一步成苗快速繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
一种养心菜的组织培养一步成苗快速繁殖方法，属于植物组织培养技术领域。本发明解决养心菜常规繁殖方法系数低，生长缓慢，难以形成规模化生产的问题。所述方法是按下述步骤进行的：步骤一、消毒灭菌；步骤二、一步成苗培养；步骤三、试管苗的驯化与移栽：将生根苗取出，放到光照充足的炼苗室内，3至5天后将瓶口打开继续炼苗2至3天；然后取出试管苗，洗净根部培养基，移栽基质中，基质由泥炭土与蛭石构成，其中泥炭土与蛭石的重量份数比为1:1，起初7天保证每天给小苗喷雾2‑3次。本发明用于养心菜的组织培养。
Description
技术领域
本发明涉及一种养心菜的组织培养一步成苗快速繁殖方法，属于植物组织培养技术领域。
背景技术
目前养心菜的生产繁殖以分株繁殖和扦插繁殖为主。具体如下:1、扦插繁殖选取当年生长健壮枝条，切成10-15cm长的茎段，去掉基部叶片，每茎段留3.4叶，打顶，插人畦内，人土3一5cm，浇一次透水，一般7-10天生根成活，枝条最好随剪随种，20天后即可移栽定植。也可在大田直接扦插，定植密度为行距25cm，穴距15cm，每穴2-3株。2、分株繁殖将要分株的养心菜连根挖起，按每一段带有2个以上根芽的标准进行分株，然后按株行距15cmx25cm进行分植。挖苗时谨慎操作，尽量不破坏母株，切下的每一段根尽量多带根芽，以缩短缓苗时间。定植后铺好滴灌带，并滴适量的压根水。
上述养心菜常规繁殖方法系数低，生长缓慢，难以形成规模化生产。用组织培养技术，既可保持它的优良特性，又能在短期内获得大量的试管苗，且移栽成活率高，生长迅速，可克服常规繁殖方法的不足，对缓解人们对费菜的需求可能有一定的参考价值。
常规的植物组织培养再生途径主要为外植体完全脱分化形成愈伤组织，然后将愈伤组织转移到分化培养基上分化出芽，再将其转移到生根培养基上诱导生根。但该途径较烦琐，种质易产生变异，再生频率不高。
发明内容
本发明为了解决问题，进而提供了一种养心菜的组织培养一步成苗快速繁殖方法。
本发明为解决上述技术问题采取的技术方案是：所述方法是按下述步骤进行的：
步骤一、取无病虫害、生长健壮的养心菜叶片作外植体，然后消毒灭菌；
步骤二、一步成苗培养：将消毒灭完菌的叶片切成面积为0.4-0.6cm2块状后接种到培养基上，接种后培养基置于温度为25士2℃条件下，全黑暗培养，7至10天后进行光照培养至生根；
步骤三、试管苗的驯化与移栽：将生根苗取出，放到光照充足的炼苗室内，3至5天后将瓶口打开继续炼苗2至3天；然后取出试管苗，洗净根部培养基，移栽基质中，基质由泥炭土与蛭石构成，其中泥炭土与蛭石的重量份数比为1:1，起初7天保证每天给小苗喷雾2-3次。
进一步的，步骤一外植体的消毒灭菌方法如下：在洗洁精水中清洗10min后，除去叶片表面污物，流水中冲洗30min；在无菌条件下，用70％酒精浸泡45s，无菌水冲洗3次，再在0.1％升汞溶液浸泡4min，然后用无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干表面水分。
进一步的，步骤二的光强为20001x，14h/d的光照。
进一步的，步骤二中以MS培养基为基础的培养基，在1LMS培养基中，添加不同浓度的6-苄基腺嘌呤、萘乙酸、2,4-二氯苯氧乙酸、糖和琼脂组合，糖为蔗糖或者葡萄糖，其中6-苄基腺嘌呤浓度为1.0mg/L、2.0mg/L或3.0mg/L，萘乙酸浓度为0.1mg/L、0.2mg/L或0.4mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸浓度为0.0mg/L、0.1mg/L或0.2mg/L。
进一步的，步骤二的培养基配方为MS+6-BA 2.0mg/L、2,4-D 0.2mg/L、NAA 0.2mg/L、蔗糖25g/L和琼脂7.0g/L，培养基的pH值为5.8。
进一步的，步骤二中培养基为MS+6-BA 1.0mg/L、2,4-D 0.2mg/L、NAA 0.2mg/L、葡萄糖25g/L和琼脂7.0g/L，培养基的pH值为5.8。
本发明的有益效果是：养心菜以叶片作为外植体一步成苗法是外植体在形成愈伤组织后，不需要转移到分化培养基上，而是直接在原培养基上分化，分化的顺序通常是先根后芽，直止形成健壮的全苗。再生周期短，繁殖系数和再生频率高，易操作，培养程序简单，不影响增殖率，能保持原种特性，便于大规模生产。
附图说明
图1是养心菜叶片接种后，愈伤组织分化出的小芽照片；图2是一步培养成的组培苗照片；图3是驯化移栽成功的组培苗。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式以下结合具体实施例对本发明做进一步描述和说明。所述方法是按下述步骤进行的：
步骤一、取无病虫害、生长健壮的养心菜叶片作外植体，然后消毒灭菌；
步骤二、叶片愈伤组织的诱导：将消毒灭完菌的叶片切成面积为0.4-0.6cm2块状后接种到培养基上，接种后培养基置于温度为25士2℃条件下，全黑暗培养，7至10天后进行光照培养至生根；
步骤三、试管苗的驯化与移栽：将生根苗取出，放到光照充足的炼苗室内，3至5天后将瓶口打开继续炼苗2至3天；然后取出试管苗，洗净根部培养基，移栽基质中，基质由泥炭土与蛭石构成，其中泥炭土与蛭石的重量份数比为1:1，起初7天保证每天给小苗喷雾2-3次。
作为优选，步骤一外植体的消毒灭菌方法如下：在洗洁精水中清洗10min后，除去叶片表面污物，流水中冲洗30min；在无菌条件下，用70％酒精浸泡45s，无菌水冲洗3次，再在0.1％升汞溶液浸泡4min，然后用无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干表面水分。
作为优选，步骤二的光强为20001x，14h/d的光照。
作为优选，步骤二中以MS培养基为基础的培养基，在1LMS培养基中，添加不同浓度的6-苄基腺嘌呤、萘乙酸、2,4-二氯苯氧乙酸、糖和琼脂组合，糖为蔗糖或者葡萄糖，其中6-苄基腺嘌呤浓度为1.0mg/L、2.0mg/L或3.0mg/L，萘乙酸浓度为0.1mg/L、0.2mg/L或0.4mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸浓度为0.0mg/L、0.1mg/L或0.2mg/L。
作为优选，步骤二的培养基配方为MS+6-BA 2.0mg/L、2,4-D 0.2mg/L、NAA 0.2mg/L、蔗糖25g/L和琼脂7.0g/L，培养基的pH值为5.8。
作为优选，步骤二中培养基为MS+6-BA 1.0mg/L、2,4-D 0.2mg/L、NAA 0.2mg/L、葡萄糖25g/L和琼脂7.0g/L，培养基的pH值为5.8。其中6-苄基腺嘌呤、萘乙酸和2,4-二氯苯氧乙酸均为市售分析纯化学试剂。所需激素的配制方法：6-苄基腺嘌呤(6-BA)：配制浓度为1mg/ml，称取0.1g6-苄基腺嘌呤用少许0.1mol/L HCl溶解后用蒸馏水定容至100ml容量瓶中待用；萘乙酸(NAA)：配制浓度为0.5mg/ml，称取0.05g萘乙酸用少许无水乙醇溶解后用蒸馏水定容至100ml容量瓶中待用；2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)：配制浓度为0.5mg/ml，称取0.05g萘乙酸用少许0.1mol/L HCl乙醇溶解后用蒸馏水定容至100ml容量瓶中待用；
采用下述试验验证本实施方式的效果：
以MS培养基为基础培养基，并在1LMS培养基中，添加不同浓度的6-苄基腺嘌呤、萘乙酸和2，4-二氯苯氧乙酸的不同组合，采用三因素三水平L9(34)正交试验设计设计，配制成养心菜组织培养一步成苗培养基，其中6-苄基腺嘌呤浓度为1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L，萘乙酸浓度为0.1mg/L、0.2mg/L、0.4mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸浓度为0.0mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L，见表一。
表一
对上述10种养心菜一步成苗培养基进行灭菌处理，并取适量分装于培养瓶中；
晴天上午取无病虫害、生长健壮的养心菜叶片作外植体在洗洁精水中清洗10min后，除去叶片表面污物，流水中冲洗30min；在无菌条件下，用70％酒精浸泡45s，无菌水冲洗3次，再在0.1％升汞溶液浸泡4min，然后用无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干表面水分。
将养心菜叶片切取约0.5cmX0.5cm大小，接种到上述的不同激素组合的培养基中。以叶片背面贴于所述养心菜一步成苗培养基上；每瓶接种6个外植体，每个组合接种10瓶；接种后培养基置于温度为25士2℃条件下，全黑暗培养，7至10天后进行14h/d光照培养，光强为20001x；光照培养20d后，由表2可知愈伤组织诱导率，即产生愈伤的外植体数/接种外植体数X 100，及愈伤组织的形成情况。在原培养基中继续光照培养40d后得愈伤组织分化结果(见表3)，即分化芽的愈伤块数/总愈伤块数X 100％，及成苗状况。
表2不同激素组合对叶片愈伤组织诱导的影响
表3不同激索组合对叶片不定芽分化的影响
分析表2所得的实验数据可知，各组养心菜组织培养一步成苗培养基均能较好的诱导养心菜叶片形成愈伤组织，其诱导率均达到80％以上，第2、3、5、7和8组，诱导率达90％以上。再分析表3中数据可知，第3、6、7和9组中的愈伤组织未能分化成芽，而在第2、5和8组中，第2组愈伤组织的分化率较差，出芽天数最长，丛生芽数量少而长势较差，第5组和第8组的分化率较好，出芽天数较短，以第5组分化率最好，出芽天数最短，丛生芽数量多而长势较好。由此，最佳养心菜一步成苗培养基为:MS+6-BA 2.0mg/L、2，4-D 0.2mg/L、NAA 0.2mg/L、蔗糖25g/L和琼脂7.0g/L的组合。
Claims (3)
1.一种养心菜的组织培养一步成苗快速繁殖方法，其特征在于：所述方法是按下述步骤进行的：
步骤一、取无病虫害、生长健壮的养心菜叶片作外植体，然后消毒灭菌；
步骤二、一步成苗培养：将消毒灭完菌的叶片切成面积为0.4-0.6cm2块状后接种到培养基上，接种后培养基置于温度为25±2℃条件下，全黑暗培养，7至10天后进行光照培养至生根；
步骤三、试管苗的驯化与移栽：将生根苗取出，放到光照充足的炼苗室内，3至5天后将瓶口打开继续炼苗2至3天；然后取出试管苗，洗净根部培养基，移栽基质中，基质由泥炭土与蛭石构成，其中泥炭土与蛭石的重量份数比为1:1，起初7天保证每天给小苗喷雾2-3次；
步骤二的培养基配方为MS+6-BA 2.0mg/L、2,4-D 0.2mg/L、NAA 0.2mg/L、蔗糖25g/L和琼脂7.0g/L，培养基的pH值为5.8。
2.根据权利要求1所述一种养心菜的组织培养一步成苗快速繁殖方法，其特征在于步骤一外植体的消毒灭菌方法如下：在洗洁精水中清洗10min后，除去叶片表面污物，流水中冲洗30min；在无菌条件下，用70％酒精浸泡45s，无菌水冲洗3次，再在0.1％升汞溶液浸泡4min，然后用无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干表面水分。
3.根据权利要求1所述一种养心菜的组织培养一步成苗快速繁殖方法，其特征在于步骤二的光强为20001x，14h/d的光照。
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