CN104686350A - 一种花魔芋组织培养快繁体系的建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种花魔芋组织培养快繁体系的建立方法，涉及花魔芋（Amorphophallus konjac）通过组织培养技术手段采用少量的组织或器官作为材料在短时间内快速繁殖保持亲本原有优良性状种苗的方法。本发明以魔芋地下块茎为外植体，通过愈伤组织诱导、继代培养、丛生芽诱导、试管苗生根以及试管苗驯化移栽等阶段实现了花魔芋的组织培养快速繁殖，从而解决花魔芋用种和种苗短缺的问题,还可以培育花魔芋脱毒苗和对品种进行提纯复壮，促进花魔芋产业的发展。
Description
技术领域
本发明涉及农业生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种花魔芋组织培养快繁体系的建立方法。
背景技术
魔芋（Amorphophallus konjac）是属天南星科魔芋属多年生草本植物，在我国主要分布于四川、云南、陕西、宁夏、甘肃等地，且以花魔芋为主要的栽培种且分布最为广泛，遍布于秦岭以南的所有山区和丘陵地带。魔芋球茎内富含的葡甘聚糖，具胶溶性、凝胶性、成膜性及与其它植物胶的优良复配性等特点而被广泛应用于食品和保健方面，具有降血脂、降血糖、抗癌、美容、减肥等功效。
近年来魔芋的栽培面积不断扩大，用种量不断攀，但魔芋作为一种半野生植物，自然繁殖率极低,具商品价值的器官形成周期长，种芋退化严重，容易受到多种病虫的侵害且缺乏抗病品种和针对性药物防治，使得魔芋产业的发展受到制约。近年来，由于魔芋用途的不断发掘,其市场需求量日益增加，使得魔芋繁殖系数低与用种量却逐年上升的矛盾日益尖锐，采用组织培养快速繁殖可以较好地解决这一问题。但魔芋的组培快繁技术还不是很成熟，还受到污染严重、外植体褐变、诱导率和分化率低等问题的困扰，而使用本发明的技术能很好地解决了这些问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种花魔芋组织培养快繁体系的建立方法，本发明以魔芋地下块茎为外植体，通过愈伤组织诱导、继代培养、丛生芽诱导、试管苗生根以及试管苗驯化移栽等阶段实现了花魔芋的组织培养快速繁殖，进而实现了本发明的目的。
本发明的一种花魔芋组织培养快繁体系的建立方法，包括以下的工艺步骤：
（1）愈伤组织诱导：选取生长健壮的花魔芋种芋,先用清水洗净，用毛笔将主芽附近刷洗干净、晾干，然后切取带芽的顶心块（2cm×2cm×2cm），并将其表皮刮洗干净，放在干净的陶瓷紅中,并在瓷紅上盖一层纱布,在自来水下冲洗1～3h，先在75%～80%的乙醇中浸泡3～10s，用无菌水冲洗3～5次，每次3～8min,然后用0.1%～0.5%的升汞溶液消毒5～10min,再用洗菌水冲洗3～5次，每次3～8min。用无菌滤纸吸干种芋表面水珠后切去表层1～2mm,然后切成0.5cm×0.5cm×0.5cm小块并在50～100mg/L的柠檬酸中浸泡1～5s后接种到诱导培养基中进行愈伤组织诱导。接种后先在25～28℃条件下全暗培养7～14天，然后置于每天光照12～15小时，光照强度为1500～2500lx，培养温度为25～28℃的条件下培养直至形成愈伤组织。
（2）继代培养：将步骤（1）诱导得到的愈伤组织切成0.5cm3大小的小块后转接至增殖培养基上进行继代培养，接种后先在25～28℃条件下全暗培养3～5天，然后置于每天光照12～15小时，光照强度为1500～2500lx，培养温度为25～28℃的条件下培养，30～40天转接一次。
（3）分化培养：将步骤（1）或（2）得到的愈伤组织切成0.5cm3大小的小块后转接至分化培养基上进行不定芽诱导，接种后先在25～28℃条件下全暗培养1～3天，然后置于每天光照12～15小时，光照强度为1500～2500lx，培养温度为25～28℃的条件下培养直至形成不定芽。
（4）试管苗生根：将步骤（3）得到的长至2～4cm的不定芽分切接种到生根培养基上进行诱导生根，接种后先在25～28℃条件下全暗培养1～4天，然后置于每天光照12～15小时，光照强度为2000～3000lx，培养温度为25～28℃的条件下培养至生根。
（5）炼苗移栽：将长至6～8cm的生根试管苗移栽到经过消毒(800倍多菌灵液浇透培养基质)的培养盘中,盘中基质为蛭石:珍珠岩＝2:1。在培养盘上用保鲜膜覆盖以保持湿度和隔离细菌,放到自然光下炼苗,切勿在强光下暴晒,保持湿度在90%以上，每隔2～5天就在保鲜膜上戳2～3个直径1cm左右的洞,使组培苗渐渐适应外界环境,2周后将保鲜膜除去。
上述步骤（1）所述的诱导培养基为MS+5～10mg/L TDZ+1～3mg/L NAA+2.5%～3.5%蔗糖+0.35%～0.5%琼脂+0.05%～0.1%活性炭，pH值为5.4～5.8。
上述步骤（2）所述的增殖培养基为MS+1～5mg/L TDZ+5～15mg/L NAA+2.5%～3.5%蔗糖+0.35%～0.5%琼脂+0.05%～0.1%活性炭，pH值为5.4～5.8。
上述步骤（3）所述的分化培养基为：MS+6～15mg/L TDZ+1～3mg/L IBA+2.5%～3.5%蔗糖+0.35%～0.5%琼脂+0.05%～0.1%活性炭，pH值为5.4～5.8。
上述步骤（4）所述的生根培养基为：1/2MS+3～8mg/L NAA+2.5%～3.5%蔗糖+0.35%～0.5%琼脂+0.05%～0.1%活性炭，pH值为5.4～5.8。
本发明的优点是：通过组织培养技术手段采用少量的组织或器官作为材料在短时间内快速繁殖保持亲本原有优良性状种苗的方法。以魔芋地下块茎为外植体，通过愈伤组织诱导、继代培养、丛生芽诱导、试管苗生根以及试管苗驯化移栽等阶段实现了花魔芋的组织培养快速繁殖，从而解决花魔芋用种和种苗短缺的问题,还可以培育花魔芋脱毒苗和对品种进行提纯复壮，促进花魔芋产业的发展。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
实施例1：
（1）愈伤组织诱导：选取生长健壮的花魔芋种芋,先用清水洗净，用毛笔将主芽附近刷洗干净、晾干，然后切取带芽的顶心块（2cm×2cm×2cm），并将其表皮刮洗干净，放在干净的陶瓷紅中,并在瓷紅上盖一层纱布,在自来水下冲洗1h，先在75%的乙醇中浸泡5s，用无菌水冲洗3次，每次3min,然后用0.1%的升汞溶液消毒5min,再用洗菌水冲洗3次，每次3min。用无菌滤纸吸干种芋表面水珠后切去表层1mm,然后切成0.5cm×0.5cm×0.5cm小块并在70mg/L的柠檬酸中浸泡2s后接种到诱导培养基中进行愈伤组织诱导。接种后先在28℃条件下全暗培养7天，然后置于每天光照12小时，光照强度为1500lx，培养温度为28℃的条件下培养28天后即形成愈伤组织，污染率低至7%，褐变率仅为5.7%，诱导率为87.3%。所述的诱导培养基为MS+6mg/L TDZ+1mg/L NAA+3.5%蔗糖+0.35%琼脂+0.05%活性炭，pH值为5.4。
（2）继代培养：将步骤（1）诱导得到的愈伤组织切成0.5cm3大小的小块后转接至增殖培养基上进行继代培养，接种后先在28℃条件下全暗培养3天，然后置于每天光照13小时，光照强度为1500lx，培养温度为28℃的条件下培养27天即可继代一次，增殖的愈伤组织结构致密，颜色呈浅红色，相对生长速率达至0.289g/d。所述的增殖培养基为MS+3mg/L TDZ+9mg/L NAA+2.5%蔗糖+0.35%琼脂+0.05%活性炭，pH值为5.4。
（3）分化培养：将步骤（1）或（2）得到的愈伤组织切成0.5cm3大小的小块后转接至分化培养基上进行不定芽诱导，接种后先在28℃条件下全暗培养1天，然后置于每天光照12小时，光照强度为1500lx，培养温度为28℃的条件下培养25天即可形成不定芽，分化率达到147.6%，分化得到的不定芽比较粗壮，生良好。所述的分化培养基为：MS+12mg/L TDZ+1mg/L IBA+3.5%蔗糖+0.40%琼脂+0.1%活性炭，pH值为5.4。
（4）试管苗生根：将步骤（3）得到的长至2～4cm的不定芽分切接种到生根培养基上进行诱导生根，接种后先在28℃条件下全暗培养1天，然后置于每天光照12小时，光照强度为2000lx，培养温度为28℃的条件下培养至生根，生根率达100%，生根数量多且较粗壮。所述的生根培养基为：1/2MS+5mg/L NAA+3.0%蔗糖+0.40%琼脂+0.08%活性炭，pH值为5.4。
（5）炼苗移栽：将长至6～8cm的生根试管苗移栽到经过消毒(800倍多菌灵液浇透培养基质)的培养盘中,盘中基质为蛭石:珍珠岩＝2:1。在培养盘上用保鲜膜覆盖以保持湿度和隔离细菌,放到自然光下炼苗,切勿在强光下暴晒,保持湿度在90%以上，每隔2天就在保鲜膜上戳2个直径1cm左右的洞,使组培苗渐渐适应外界环境,2周后将保鲜膜除去，移栽成活率达到97.1%。
实施例2：
（1）愈伤组织诱导：选取生长健壮的花魔芋种芋,先用清水洗净，用毛笔将主芽附近刷洗干净、晾干，然后切取带芽的顶心块（2cm×2cm×2cm），并将其表皮刮洗干净，放在干净的陶瓷紅中,并在瓷紅上盖一层纱布,在自来水下冲洗2h，先在75%的乙醇中浸泡7s，用无菌水冲洗5次，每次5min,然后用0.1%的升汞溶液消毒6min,再用洗菌水冲洗4次，每次3min。用无菌滤纸吸干种芋表面水珠后切去表层2mm,然后切成0.5cm×0.5cm×0.5cm小块并在100mg/L的柠檬酸中浸泡3s后接种到诱导培养基中进行愈伤组织诱导。接种后先在26℃条件下全暗培养9天，然后置于每天光照14小时，光照强度为2000lx，培养温度为26℃的条件下培养26天后即形成愈伤组织，污染率低至5%，褐变率仅为4.1%，诱导率为85.9%。所述的诱导培养基为MS+9mg/L TDZ+2mg/L NAA+4.0%蔗糖+0.35%琼脂+0.08%活性炭，pH值为5.8。
（2）继代培养：将步骤（1）诱导得到的愈伤组织切成0.5cm3大小的小块后转接至增殖培养基上进行继代培养，接种后先在26℃条件下全暗培养3天，然后置于每天光照13小时，光照强度为2000lx，培养温度为26℃的条件下培养25天即可继代一次，增殖的愈伤组织结构致密，颜色呈浅红色，相对生长速率达至0.302g/d。所述的增殖培养基为MS+4mg/L TDZ+13mg/L NAA+2.5%蔗糖+0.35%琼脂+0.08%活性炭，pH值为5.8。
（3）分化培养：将步骤（1）或（2）得到的愈伤组织切成0.5cm3大小的小块后转接至分化培养基上进行不定芽诱导，接种后先在26℃条件下全暗培养2天，然后置于每天光照14小时，光照强度为2000lx，培养温度为26℃的条件下培养27天即可形成不定芽，分化率达到142.9%，分化得到的不定芽比较粗壮，生良好。所述的分化培养基为：MS+14mg/L TDZ+1.5mg/L IBA+3.5%蔗糖+0.40%琼脂+0.1%活性炭，pH值为5.8。
（4）试管苗生根：将步骤（3）得到的长至2～4cm的不定芽分切接种到生根培养基上进行诱导生根，接种后先在28℃条件下全暗培养1天，然后置于每天光照13小时，光照强度为2500lx，培养温度为26℃的条件下培养至生根，生根率达96%，生根数量多且较粗壮。所述的生根培养基为：1/2MS+7mg/L NAA+3.0%蔗糖+0.40%琼脂+0.1%活性炭，pH值为5.8。
（5）炼苗移栽：将长至6～8cm的生根试管苗移栽到经过消毒(800倍多菌灵液浇透培养基质)的培养盘中,盘中基质为蛭石:珍珠岩＝2:1。在培养盘上用保鲜膜覆盖以保持湿度和隔离细菌,放到自然光下炼苗,切勿在强光下暴晒,保持湿度在90%以上，每隔3天就在保鲜膜上戳2个直径1cm左右的洞,使组培苗渐渐适应外界环境,2周后将保鲜膜除去，移栽成活率达到95.9%。
Claims (5)
1.一种花魔芋组织培养快繁体系的建立方法，其特征在于包括以下工艺步骤：
（1）愈伤组织诱导：选取生长健壮的花魔芋种芋,先用清水洗净，用毛笔将主芽附近刷洗干净、晾干，然后切取带芽的顶心块2cm×2cm×2cm，并将其表皮刮洗干净，放在干净的陶瓷紅中,并在瓷紅上盖一层纱布,在自来水下冲洗1～3h，先在75%～80%的乙醇中浸泡3～10s，用无菌水冲洗3～5次，每次3～8min,然后用0.1%～0.5%的升汞溶液消毒5～10min,再用洗菌水冲洗3～5次，每次3～8min,用无菌滤纸吸干种芋表面水珠后切去表层1～2mm,然后切成0.5cm×0.5cm×0.5cm小块并在50～100mg/L的柠檬酸中浸泡1～5s后接种到诱导培养基中进行愈伤组织诱导,接种后先在25～28℃条件下全暗培养7～14天，然后置于每天光照12～15小时，光照强度为1500～2500lx，培养温度为25～28℃的条件下培养直至形成愈伤组织;
（2）继代培养：将步骤（1）诱导得到的愈伤组织切成0.5cm3大小的小块后转接至增殖培养基上进行继代培养，接种后先在25～28℃条件下全暗培养3～5天，然后置于每天光照12～15小时，光照强度为1500～2500lx，培养温度为25～28℃的条件下培养，30～40天转接一次;
（3）分化培养：将步骤（1）或（2）得到的愈伤组织切成0.5cm3大小的小块后转接至分化培养基上进行不定芽诱导，接种后先在25～28℃条件下全暗培养1～3天，然后置于每天光照12～15小时，光照强度为1500～2500lx，培养温度为25～28℃的条件下培养直至形成不定芽;
（4）试管苗生根：将步骤（3）得到的长至2～4cm的不定芽分切接种到生根培养基上进行诱导生根，接种后先在25～28℃条件下全暗培养1～4天，然后置于每天光照12～15小时，光照强度为2000～3000lx，培养温度为25～28℃的条件下培养至生根;
（5）炼苗移栽：将长至6～8cm的生根试管苗移栽到经过消毒800倍多菌灵液浇透培养基质的培养盘中,盘中基质为蛭石:珍珠岩＝2:1,在培养盘上用保鲜膜覆盖以保持湿度和隔离细菌,放到自然光下炼苗,切勿在强光下暴晒,保持湿度在90%以上，每隔2～5天就在保鲜膜上戳2～3个直径1cm左右的洞,使组培苗渐渐适应外界环境,2周后将保鲜膜除去。
2.根据权利要求1所述的一种花魔芋组织培养快繁体系的建立方法，其特征在于步骤（1）所述的诱导培养基为MS+5～10mg/L TDZ+1～3mg/L NAA+2.5%～3.5%蔗糖+0.35%～0.5%琼脂+0.05%～0.1%活性炭，pH值为5.4～5.8。
3.根据权利要求1所述的一种花魔芋组织培养快繁体系的建立方法，其特征在于步骤（2）所述的增殖培养基为MS+1～5mg/L TDZ+5～15mg/L NAA+2.5%～3.5%蔗糖+0.35%～0.5%琼脂+0.05%～0.1%活性炭，pH值为5.4～5.8。
4.根据权利要求1所述的一种花魔芋组织培养快繁体系的建立方法，其特征在于步骤（3）所述的分化培养基为：MS+6～15mg/L TDZ+1～3mg/L IBA+2.5%～3.5%蔗糖+0.35%～0.5%琼脂+0.05%～0.1%活性炭，pH值为5.4～5.8。
5.根据权利要求1所述的一种花魔芋组织培养快繁体系的建立方法，其特征在于步骤（4）所述的生根培养基为：1/2MS+3～8mg/L NAA+2.5%～3.5%蔗糖+0.35%～0.5%琼脂+0.05%～0.1%活性炭，pH值为5.4～5.8。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20150610 |