CN108782250A - 一种定向诱导提高养心菜植株耐盐性的方法 - Google Patents

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张国新
王秀萍
姚玉涛
刘雅辉
王硕
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Abstract

本发明涉及一种定向诱导提高养心菜植株耐盐性的方法，选取健壮养心菜成年植株，将中间部位冲洗干净后，茎、叶分离，茎切5‑8cm段，对茎段进行预消毒后，用蒸馏水冲洗干净，再用0.1％的升汞溶液灭菌，最后用蒸馏水冲洗干净，得到无菌的茎段，将无菌的茎段先切成1cm的茎段，再纵切，得到半圆柱形茎段，将半圆柱形茎段接种于诱导培养基中，12‑15d后获得茎段愈伤组织，然后通过盐分递增的盐基多代培养，不断诱导提高养心菜植株的耐盐性。该方法操作简单，效率高，能显著提高养心菜植株的耐盐性，获得的耐盐植株，耐盐性可提高30％，生根苗在含盐量7g/kg土壤正常生长，成苗在含盐量10g/kg土壤能正常生长。

Description

一种定向诱导提高养心菜植株耐盐性的方法
技术领域
本发明涉及一种定向诱导提高养心菜植株耐盐性的方法，耐盐植物育种领域。
背景技术
我国有盐碱地面积1亿亩，土壤盐渍化是制约农业生产的主要因素之一。目前，改良盐碱地的主要措施有物理措施、工程措施及生物措施，其中，生物措施，尤其是耐盐植物的利用是盐碱地改良的最经济、有效的改良途径。耐盐植物种质资源筛选、创新是盐碱地改良利用的核心关键。由于植物耐盐性受多基因控制，耐盐机理复杂，有性杂交等常规育种方法在耐盐品种选育及资源创新上不能很好体现。
养心菜，学名费菜，景天科三七属多年生宿根植物，其功能性突出，可食用，具有保健作用，尤其在园林绿化上得到了很好应用。研究发现，在低于7g/kg的土壤盐分胁迫下，养心菜植株生长良好，但高于7g/kg土壤盐分对植株抑制极显著，而我国盐碱地的土壤盐分通常高于7g/kg。目前对养心菜的研究主要集中在繁育及栽培技术、营养及药用价值等方面，并没有提高耐盐性方面的研究。因此，提高养心菜植株的耐盐性，为盐碱滩涂生态修复及盐碱地生物改良提供优质耐盐资源很有必要。
发明内容
本发明目的是解决现有技术的上述，提供一种定向诱导提高养心菜植株耐盐性的方法，该方法操作简单，效率高，能显著提高养心菜植株的耐盐性。
技术方案
一种定向诱导提高养心菜植株耐盐性的方法，包括如下步骤：
(1)选取健壮养心菜成年植株，将中间部位冲洗干净后，茎、叶分离，茎切5-8cm段备用，对茎段进行预消毒后，用灭菌后的蒸馏水冲洗干净，再用0.1％的升汞溶液灭菌10-15min，最后用灭菌后的蒸馏水冲洗干净，得到无菌的茎段；
(2)将步骤(1)中得到的无菌的茎段先切成1cm的茎段，再纵切，得到半圆柱形茎段，将半圆柱形茎段接种于诱导培养基中，12-15d后获得茎段愈伤组织；
(3)将步骤(2)的茎段愈伤组织接种到含有110mmol/L NaCl的继代培养基中，培养15-20d，然后选取淡黄色愈伤组织移入含有130mmol/L的NaCl的MS培养基中，进行第二代盐基培养；15-20d后，选取淡黄色愈伤组织移入170mmol/L NaCl的MS培养基中，进行第三代盐基培养；15-20d后，选淡黄色良愈伤组织移入190mmol/L的NaCl的MS培养基中，进行第四代盐基培养，培养15-20d，然后选择长势良好的组织移入210mmol/L的NaCl的MS培养基中，进行第五代盐基培养，培养15-20d后，获得耐盐愈伤组织；
(4)将步骤(3)的耐盐愈伤组织移入分化培养基中，继续培养15-20d后，选取生长健壮的小苗移入生根培养基中，10-15d完成生根，获得耐盐试管苗，继续培养28-32d，闭瓶炼苗10-15d，然后移植至体积比为2:1的草炭和蛭石形成的基质中，30d后移栽至大棚土壤中。
步骤(1)中，所述预消毒是指：将茎段浸泡在体积浓度为65-75％的乙醇溶液中。
步骤(1)中，所述用0.1％的升汞溶液灭菌的时间为14min，研究发现此时灭菌最完全且发芽率最高。
步骤(2)中，所述诱导培养基的组成为：MS+6-BA 0.5mg/L+2,4D 0.2mg/L+7g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH为5.7-6.0。
步骤(3)中，所述继代培养基的组成为：MS+6-BA 0.4mg/L+NAA 0.2mg/L+琼脂粉7g/L+蔗糖30g/L，pH为5.7-6.0。
步骤(4)中，所述分化培养基的组成为：MS+6-BA 0.2mg/L+NAA 0.01mg/L+琼脂粉7g/L+蔗糖30g/L，pH为5.7-6.0。
步骤(2)、(3)、(4)的培养条件为：温度为21-23℃，每天光照时间为12-16h，光照设备为白炽灯管，光照强度2000lux。
步骤(4)中，炼苗条件为温度为21-23℃、空气湿度80-85％。
本发明的有益效果：本发明利用离体培养方法，通过盐分递增的盐基多代培养，不断诱导提高养心菜植株的耐盐性，通过耐盐鉴定相结合，试验周期300d左右，获得耐盐植株，较对照植株相比，耐盐性可提高30％，生根苗在含盐量7g/kg土壤正常生长，成苗在含盐量10g/kg土壤能正常生长。本技术操作简单，效率高，应用前景广阔，对耐盐植物育种具有积极意义。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
备注：下述实施例中，所用到的培养基配方如下：
诱导培养基：MS+6-BA 0.5mg/L+2,4D 0.2mg/L+琼脂粉7g/L+蔗糖30g/L
继代培养基：MS+6-BA 0.4mg/L+NAA 0.2mg/L+琼脂粉7g/L+蔗糖30g/L
分化培养基：MS+6-BA 0.2mg/L+NAA 0.01mg/L+琼脂粉7g/L+蔗糖30g/L
生根培养基：1/2MS+NAA 0.3mg/L+琼脂粉7g/L+蔗糖30g/L
以上培养基pH均为5.7-6.0。
实施例1
一种定向诱导提高养心菜植株耐盐性的方法，包括如下步骤：
(1)选取健壮养心菜成年植株，切去带有棕黄色污垢的底部，将中间部位用自来水冲洗20min后，于超净工作台中进行茎、叶分离，茎切5-8cm段备用，对茎段进行预消毒(将茎段浸泡在浓度为70％的乙醇溶液中)后，用灭菌后的蒸馏水冲洗干净，再用0.1％的升汞溶液灭菌14min，最后用灭菌后的蒸馏水冲洗干净，得到无菌的茎段；
(2)将步骤(1)中得到的无菌的茎段先切成1cm的茎段，再纵切，得到半圆柱形茎段，将半圆柱形茎段接种于含诱导培养基的培养瓶中，培养室温度为21-23℃，每天光照时间为12-16h，光照设备为白炽灯管，光照强度2000lux，12d后获得茎段愈伤组织；
(3)将步骤(2)的茎段愈伤组织接种到含有110mmol/L不同浓度NaCl的继代培养基中，每瓶培养基35-40ml，每瓶4块愈伤组织，温度为21-23℃，每天光照时间为12-16h，光照设备为白炽灯管，光照强度2000lux，培养20d，然后选取淡黄色愈伤组织移入含有130mmol/L的NaCl的MS培养基中，进行第二代盐基培养；15-20d后，选取淡黄色愈伤组织移入170mmol/L NaCl的MS培养基中，进行第三代盐基培养；15-20d后，选取淡黄色愈伤组织移入190mmol/L的NaCl的MS培养基中，进行第四代盐基培养，培养15-20d，然后选择长势良好的组织移入210mmol/L的NaCl的MS培养基中，进行第五代盐基培养，培养15-20d后，获得耐盐愈伤组织；
(4)将步骤(3)的耐盐愈伤组织移入分化培养基中，继续培养20d后，选取生长健壮的小苗移入生根培养基中，10-15d完成生根，获得耐盐试管苗，继续培养28-32d，闭瓶炼苗10-15d，然后移植至体积比为2:1的草炭和蛭石形成的基质中，30d后移栽至大棚土壤中。
耐盐性测试：
取经过实施例1步骤(1)-(4)得到的组培苗，以未经处理的作为对照苗，选取5cm茎段进行扦插，待60-80d，选取地下2-3条根，地上2-3茎，生长一致的植株，采用盆栽法，利用含盐量5g/kg(对照)、7g/kg、9g/kg的盐碱土，进行盐碱胁迫试验，花盆口直径35cm、高25cm，每盆栽植5株，移栽后每盆浇透水，以保持盆内盐分稳定，不要渗出，在生长期看土壤含水状况，每盆浇水适量，保持土壤湿润即可。胁迫60d后，调查生物量指标，耐盐性强弱采用耐盐系数法，耐盐系数＝盐胁迫下地上生物量/对照条件下地上生物量，测试结果见表1：
表1不同梯度盐分对养心菜生物量的影响
从表1看出，随着盐分含量升高，耐盐系数显著减少，相同浓度的盐分下，组培苗耐盐系数显著高于对照苗，说明组培苗耐盐性较对照苗显著提高。土壤盐分为5g/kg时，对照苗与组培苗耐盐系数差异不大，但当盐分达到7g/kg时，组培苗耐盐系数较对照苗高提高54％，当盐分达到9g/kg时，组培苗耐盐系数为0.42，接近于0.5，较对照苗提高一倍，且与盐分含量7g/kg的对照苗耐盐系数相当，说明组培苗耐盐力提高了2g/kg，耐盐水平提高了30％。

Claims (8)

1.一种定向诱导提高养心菜植株耐盐性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)选取健壮养心菜成年植株，将中间部位冲洗干净后，茎、叶分离，茎切5-8cm段备用，对茎段进行预消毒后，用灭菌后的蒸馏水冲洗干净，再用0.1％的升汞溶液灭菌10-15min，最后用灭菌后的蒸馏水冲洗干净，得到无菌的茎段；
(2)将步骤(1)中得到的无菌的茎段先切成1cm的茎段，再纵切，得到半圆柱形茎段，将半圆柱形茎段接种于诱导培养基中，12-15d后获得茎段愈伤组织；
(3)将步骤(2)的茎段愈伤组织接种到含有110mmol/L NaCl的继代培养基中，培养15-20d，然后选取淡黄色的愈伤组织移入含有130mmol/L的NaCl的MS培养基中，进行第二代盐基培养；15-20d后，选取淡黄色的愈伤组织移入170mmol/L NaCl的MS培养基中，进行第三代盐基培养；15-20d后，选淡黄色的愈伤组织移入190mmol/L的NaCl的MS培养基中，进行第四代盐基培养，培养15-20d，然后选择长势良好的组织移入210mmol/L的NaCl的MS培养基中，进行第五代盐基培养，培养15-20d后，获得耐盐愈伤组织；
(4)将步骤(3)的耐盐愈伤组织移入分化培养基中，继续培养15-20d后，选取生长健壮的小苗移入生根培养基中，10-15d完成生根，获得耐盐试管苗，继续培养28-32h，闭瓶炼苗10-15d，然后移植至体积比为2:1的草炭和蛭石形成的基质中，30d后移栽至大棚土壤中。
2.如权利要求1所述定向诱导提高养心菜植株耐盐性的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述预消毒是指：将茎段浸泡在体积浓度为65-75％的乙醇溶液中。
3.如权利要求1所述定向诱导提高养心菜植株耐盐性的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述用0.1％的升汞溶液灭菌的时间为14min。
4.如权利要求1所述定向诱导提高养心菜植株耐盐性的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述诱导培养基的组成为：MS+6-BA 0.5mg/L+2,4D 0.2mg/L+7g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH为5.7-6.0。
5.如权利要求1所述定向诱导提高养心菜植株耐盐性的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述继代培养基的组成为：MS+6-BA 0.4mg/L+NAA 0.2mg/L+琼脂粉7g/L+蔗糖30g/L，pH为5.7-6.0。
6.如权利要求1所述定向诱导提高养心菜植株耐盐性的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述分化培养基的组成为：MS+6-BA 0.2mg/L+NAA 0.01mg/L+琼脂粉7g/L+蔗糖30g/L，pH为5.7-6.0。
7.如权利要求1所述定向诱导提高养心菜植株耐盐性的方法，其特征在于，步骤(2)、(3)、(4)的培养条件为：温度为21-23℃，每天光照时间为12-16h，光照设备为白炽灯管，光照强度2000lux。
8.如权利要求1至7任一项所述定向诱导提高养心菜植株耐盐性的方法，其特征在于，步骤(4)中，炼苗条件为温度为21-23℃、空气湿度80-85％。
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