CN104756864B

CN104756864B - 一种疏脉半蒴苣苔的离体保存方法

Info

Publication number: CN104756864B
Application number: CN201410739915.4A
Authority: CN
Inventors: 李翠; 韦莹; 郭晓云; 张占江; 缪剑华; 赵以民; 韦坤华; 李林轩; 吕惠珍; 王诺; 王一诺; 王晓峰
Original assignee: Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants
Current assignee: Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants
Priority date: 2014-12-09
Filing date: 2014-12-09
Publication date: 2017-04-26
Anticipated expiration: 2034-12-09
Also published as: CN104756864A

Abstract

本发明公开了一种疏脉半蒴苣苔的离体保存方法，包括如下步骤：(1)取疏脉半蒴苣苔顶芽进行诱导培养得丛生芽；(2)将诱导得到的丛生芽进行壮苗生根得到具有4～6片叶的试管苗；(3)将具有4～6片叶的试管苗接种到保存培养基进行离体保存。本发明保存培养基为1/2MS+PPP3331.0mg/l+AC0.5％+蔗糖2.5％～3％+琼脂0.38％～0.48％。培养基温度为20±1℃，光照强度1400～2000lx，光照时间为8～10h/d。利用本发明快繁方法可在短期内提供大量疏脉半蒴苣苔的优质种苗，得到的种苗健壮、成活率高，利用本发明离体保存方法可以使疏脉半蒴苣苔种质资源得到长期保存，有效解决了疏脉半蒴苣苔种质资源保存及规模化育苗问题。

Description

一种疏脉半蒴苣苔的离体保存方法

技术领域

本发明属于组织培养技术领域，具体地，涉及疏脉半蒴苣苔的离体保存方法。

背景技术

疏脉半蒴苣苔是苦苣苔科半蒴苣苔属植物，分布于广西、贵州南部和云南东南部。生于海拔260-1600米山谷林下石上，生长环境恶劣，自然界种子细小繁殖困难，在引种栽培时较难成活，给种质保存与利用带来较大的困难，因此找出一种种质资源保护的有效新途径，对疏脉半蒴苣苔资源的修复和再生，防止流失、退化和灭绝，保障资源的可持续利用具有重要意义。而组织培养技术为如何妥善保存稀有的种质资源提供了最便捷、稳定的手段。

目前暂无对于疏脉半蒴苣苔相关研究，因此对疏脉半蒴苣苔离体保存的研究具有十分重要的意义。

目前如何妥善保存稀有的种质资源已成为一个急需解决的问题，而组织培养为离体种质保存提供了最便捷、稳定的手段。

组织培养的关键技术是培养基及其培养条件，同一属不同种的植物其培养条件也不尽相同，因此，对同一个属的不同种的植物组织培养条件的研究也十分必要。

目前对于疏脉半蒴苣苔离体保存的研究还比较少，申请人在公开号为CN104041412 A的中国发明专利“一种贵州半蒴苣苔的组织培养快速繁殖方法”中公开了利用组织培养技术快速繁殖贵州半蒴苣苔的方法，但是并没有公开贵州半蒴苣苔是如何进行保存的，另外申请人还在公开号为CN103651127A的中国发明专利“一种弄岗唇柱苣苔的离体保存方法”一文中公开了对弄岗唇柱苣苔的离体保存时将生长健壮的弄岗唇柱苣苔试管苗单芽切下接种到最佳保存培养基上保存300d，但是并没有公开此最佳保存培养基的具体配比，而对于离体保存来说，其保存培养基的配比是其保存能否成功的一个重要条件，因此，对其保存培养基的研究和公开具有十分重要的意义。

发明内容

针对目前存在的问题，本发明提供一种疏脉半蒴苣苔的离体保存方法，利用组织培养技术对其进行离体繁殖，通过采用合适的保存培养基对其进行离体保存，不仅可以有效挽救濒危的疏脉半蒴苣苔物种，使之成为可再生资源，还可以为疏脉半蒴苣苔种植提供优良一致种苗的技术和室内离体保存提供技术支持。为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种疏脉半蒴苣苔的离体保存方法，包括如下步骤：

(1)外植体诱导培养取野外采集的疏脉半蒴苣苔的顶芽作为外植体，在70％乙醇中浸泡30～45s，无菌水冲洗2～3次，投入0.1％升汞(添加2％吐温-20)8min，再用无菌水冲洗2～3次，切割为0.5～1.0cm长接种在接种培养基上，培养8～15天，顶芽分化形成嫩黄绿色丛生芽；所述培养基的pH值为5.8，培养温度为23～26℃，光照强度1400～2000lx，光照时间为10～12h/d；

(2)丛生芽壮苗生根培养经20～35d，丛生芽长至2～3cm，转入生根培养基培养1个月后，长成具根和4～6片叶的试管苗；所述培养基的温度为23～26℃，光照强度2000～2800lx，光照时间为10～12h/d；

(3)试管苗离体保存将由丛生芽分化产生的具有4～6片叶的试管苗，接种到保存培养基进行离体保存，所述的培养基温度为20±1℃，光照强度1400～2000lx，光照时间为8～10h/d。

步骤(1)中所述的接种培养基为：MS+6-BA0.5～1.5mg/l+IAA0.5mg/l+KT0.3mg/l+蔗糖2.5％～3％和+琼脂0.4％～0.45％。

步骤(2)中所述的壮苗生根培养基为：1/2MS+IBA1.0～1.5mg/l+6-BA0.5mg/l+AC0.5％+蔗糖2.5％～3％+琼脂0.4％～0.45％。

步骤(3)中所述的保存培养基为1/2MS+PPP3331.0mg/l+AC0.5％+蔗糖2.5％～3％+琼脂0.38～0.48％。

本发明的有益效果：

利用本发明快繁方法可在短期内提供大量疏脉半蒴苣苔的优质种苗，得到的种苗健壮、成活率高，利用本发明离体保存方法可以使疏脉半蒴苣苔种质资源得到长期保存，有效解决了疏脉半蒴苣苔种质资源保存及规模化育苗问题。

附图说明

图1表示本发明光强对疏脉半蒴苣苔离体保存的影响。

其中，横坐标表示光强(lx)，纵坐标表示保存天数(d)。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

一种疏脉半蒴苣苔属离体保存方法，通过以下方法实现：

一、疏脉半蒴苣苔经快速繁殖得试管苗：

1、供试材料

疏脉半蒴苣苔Hemiboea cavaleriei var.paucinervis W.T.Wang et Z.Y.Li顶芽。

2、外植体的消毒处理

将选择的顶芽，在70％乙醇中浸泡30～45s，无菌水冲洗2～3次，投入0.1％升汞(添加2％吐温-20)8min，再用无菌水冲洗2～3次。

3、外植体诱导

将采集到的疏脉半蒴苣苔顶芽灭菌后切割为0.5～1.0cm长的小段，按自然生长顺序接种在培养基(MS+6-BA0.5～1.5mg/l+NAA0.5mg/l+KT0.3mg/l+蔗糖2.5％～3％和+琼脂0.4％～0.45％)上，培养8～15天，顶芽分化形成丛生芽，丛生芽可切割重复培养。所述培养基的pH值为5.8，培养温度为23～26℃，光照强度14000～2000lx，光照时间为10～12h/d。

4、丛生芽壮苗生根

疏脉半蒴苣苔增殖速度30～45d平均可达1∶4～6倍。上一步骤中顶芽培养天14d左右，可得到大量丛生芽(70％以上)，又经过20～30d的培养可以得到高约2～3cm芽体，转入壮苗生根培养基(1/2MS+IAA1.0mg/l+AC0.5％+蔗糖2.5％～3％+琼脂0.4％～0.45％)，培养基的温度为23～26℃，光照强度2000～2800lx，光照时间为10～12h/d；培养一个月左右，试管苗可进行移栽。整个周期为2.5～3.5个月。

6、试管苗移栽

当试管苗至少具有4～6片伸展叶，根系正常，健康，高度为6cm左右时，即可出瓶移栽，先要经室内炼苗，出瓶时不能折伤叶片和根尖，清除根系上的培养基，分株种植，种植基质为石灰岩∶珍珠岩∶泥炭土＝3∶3∶4，基质需经过高温高压灭菌，盖上透光率60％的黑色遮阴网以保持较低光强，2d浇水1次以保持湿润。栽后放在大棚内，隐蔽度为70％，棚内温度控制在20～26℃，注意保湿。约20d试管苗长出新根，揭开遮阴网，单株移栽入盆，盆土(河沙∶草炭土＝1∶3)。试管苗移栽不宜太深，移栽的成活率可达96％。

二、取上述所得疏脉半蒴苣苔试管苗进行离体保存

选择上述具有4～6片叶疏脉半蒴苣苔试管苗为试验材料进行离体保存。

下面对其进行培养基类型、温度、光强、生长抑制剂的筛选，保存天数均以试管苗存活率为60％进行统计。

1、培养基对疏脉半蒴苣苔离体保存的影响

将试验材料接种到试验设计MS、1/2MS、1/4MS三种培养基上，接种10瓶，每瓶5株单芽；培养基中2.5～3.0％蔗糖和0.38～0.48％的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养温度25±1℃，光强1600lx，光照12～14h/d；结果表明，疏脉半蒴苣苔在MS培养基上保存时间最长，考虑到成本问题，本发明采用1/2MS为基本培养基。

表1培养基对疏脉半蒴苣苔离体保存时间的影响

2、温度对疏脉半蒴苣苔离体保存的影响

将接种到1/2MS培养基上的试验材料分别放置于温度15℃，20℃，25℃的光照培养箱培养，接种10瓶，每瓶5株单芽；培养基中2.5～3.0％蔗糖和0.38～0.48％的琼脂，培养基的pH值为5.8，光强1600lx，光照12～14h/d；具体见表2，疏脉半蒴苣苔在20℃时保存时间最长，为297天。

表2温度对疏脉半蒴苣苔离体保存时间的影响

3、光强对疏脉半蒴苣苔离体保存的影响

将试验材料接种到1/2MS培养基上，设计0、800lx，1600lx，2400lx四种光照强度，每种光强接种10瓶，每瓶5株单芽；培养基中2.5～3.0％蔗糖和0.38～0.48％的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养温度20±1℃，光照12～14h/d，结果如图1，疏脉半蒴苣苔在光强为1600lx左右保存天数最长，为304天；

4、生长抑制剂对疏脉半蒴苣苔离体保存的影响

将试验材料接种到添加不同浓度CCC、PPP₃₃₃的1/2MS培养基上，接种10瓶，每瓶5株单芽；培养基中2.5～3.0％蔗糖和0.38～0.48％的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养温度20±1℃，光强1600lx，光照12～14h/d，结果如表3，PP333浓度为1.0mg/l时保存时间最长，为329天；

表3激素对疏脉半蒴苣苔保存时间的影响

通过上述实验，最终确定疏脉半蒴苣苔离体保存培养基为1/2MS+PPP3331.0mg/l+AC0.5％+蔗糖2.5％～3％+琼脂0.38％～0.48％，保存时间为329d；培养基温度为20±1℃，光照强度1400～2000lx，光照时间为8～10h/d。

5、生长状况考察

离体保存的疏脉半蒴苣苔试管苗的生长恢复情况考察：将生长健壮的疏脉半蒴苣苔试管苗单芽切下接种到最佳保存培养基上保存300d后，存活的半蒴苣苔试管苗接种到MS+6-BA1.0mg/l+IAA0.5mg/l+KT0.5mg/l，添加AC0.1％，添加2.5％～3％的蔗糖和0.38％～0.48％的琼脂培养基上，每30d继代1次，继代3次后，恢复后疏脉半蒴苣苔试管苗的生长状况良好，株高、生长率、繁殖倍数、单株生根率等各项指标与离体保存前相近，参见表4。

表4离体保存后恢复的试管苗和保存前试管苗的比较

本发明中所用的物质注释：6-BA(6-苄氨基嘌呤)，IBA(吲哚丁酸)，KT(激动素)，IAA(吲哚乙酸)，AC(活性炭)，CCC(矮壮素)，PPP333(多效唑)。

Claims

1.一种疏脉半蒴苣苔的离体保存方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)外植体诱导培养：取野外采集的疏脉半蒴苣苔的顶芽作为外植体，在70％乙醇中浸泡30～45s，无菌水冲洗2～3次，投入添加2％吐温-20的0.1％升汞中8min，再用无菌水冲洗2～3次，切割为0.5～1.0cm长接种在接种培养基上，培养8～15d，顶芽分化形成嫩黄绿色丛生芽；所述的接种培养基为：MS+6-BA0.5～1.5mg/l+IAA 0.5mg/l+KT 0.3mg/l+蔗糖2.5％～3％+琼脂0.4％～0.45％；所述接种培养基的pH值为5.8，培养温度为23～26℃，光照强度1400～2000lx，光照时间为10～12h/d；

(2)丛生芽壮苗生根培养：经20～35d，丛生芽长至2～3cm，转入生根培养基培养1个月后，长成具根和4～6片叶的试管苗；所述的生根培养基为：1/2MS+IBA 1.0～1.5mg/l+6-BA0.5mg/l+AC 0.5％+蔗糖2.5％～3％+琼脂0.4％～0.45％；所述壮苗生根培养的温度为23～26℃，光照强度2000～2800lx，光照时间为10～12h/d；

(3)试管苗离体保存：将由丛生芽分化产生的具有4～6片叶的试管苗，接种到保存培养基进行离体保存，所述的保存培养基为：1/2MS+PPP333 1.0mg/l+AC 0.5％+蔗糖2.5％～3％+琼脂0.38％～0.48％；培养温度为20±1℃，光照强度1400～2000lx，光照时间为8～10小时/天。