CN105359980B - 一种黑果菝葜初代诱导及离体保存的方法 - Google Patents

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Abstract

一种黑果菝葜初代诱导及离体保存的方法，包括如下步骤：(1)取黑果菝葜幼嫩带芽茎段作为外植体进行消毒；(2)将消毒后的外植体置于MS基本培养基中诱导出芽；(3)将无菌芽置于MS基本培养基中，经继代培养后长成健壮植株；(4)将健壮植株置于生根培养基中培养得到完整的带根苗；(5)将完整的带跟苗置于离体保存培养基中进行培养。采用本发明有利于黑果菝葜野生资源的保护和优良性状的保持，为进一步开展该物种遗传育种和资源保护提供了良好的试验材料，具有广泛的应用前景。

Description

一种黑果菝葜初代诱导及离体保存的方法
技术领域
本发明涉及一种植物初代诱导及离体保存的方法，特别是一种黑果菝葜初代诱导及离体保存的方法。
背景技术
黑果菝葜(Smilax glauco-china Warb.)又名金刚藤头，为百合科(Liliacea)菝葜属(Smilax L.)攀援灌木，根、茎入药，其味甘，性平，具有祛风，清热，利湿，解毒的功效。根状茎粗短且富含淀粉，可以用于制做糕点、酿酒或加工食用。春、夏季采收的嫩叶可鲜用，含有丰富的蛋白质、氨基酸和多种维生素，而且具有清热解毒的药膳功效，为不可多得的药食两用的植物。
黑果菝葜主要分布于我国的甘肃(南部)、陕西(秦岭以南)、山西(南部)、河南、四川(东部)、贵州、湖北、湖南、江苏(南部)、浙江、安徽、江西、广东(北部)和广西(东北部)等地，生于海拔1600m以下的林下、灌丛或山坡上。黑果菝葜的繁育特性主要是靠自然分蘖或实生繁殖，但每株的年分蘖能力低，研究发现百合科的种子休眠期长且发芽率低，扦插和嫁接比较难成活。近几年来，由于人们的过度的采挖，该植物资源面临更严峻的境况。鉴于黑果菝葜良好的药用价值和面临的资源困境，为了更好的开发和保护黑果菝葜中药资源，本发明对黑果菝葜优良植株初代诱导和离体保存进行了探讨和研究，将有利于该野生资源的保护和优良性状的保持，为进一步综合开发黑果菝葜创造条件。
发明内容
本发明的目的是提供一种黑果菝葜初代诱导及离体保存的方法，通过对黑果菝葜进行外植体消毒诱导、增殖、生根及离体保存试验，筛选出最佳外植体消毒方法、适宜离体保存的生长调节剂及浓度。它能够提高初代诱导率，延长继代周期，减少工作量和成本，保证无菌苗的优良性状。
本发明通过以下技术方案达到上述目的：一种黑果菝葜初代诱导及离体保存的方法，包括以下步骤：
(1)外植体的消毒：将3～5滴洗洁精滴入装有100ml自来水的烧杯中，取无病虫害黑果菝葜当年生的幼嫩带芽茎段剪切成4cm长的带芽茎段，置于烧杯中搅拌，再用软毛刷擦拭表面污垢，流水冲洗15min，然后在超净工作台内用75v/v％的乙醇消毒15S，无菌水冲洗1次，再用0.1v/v％HgCl2消毒10min，无菌水浸泡3次，每次约2min，用无菌滤纸吸干外植体表面水分，获得外植体，其中无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水；
(2)无菌芽的诱导：将步骤(1)得到的外植体剪切成1～1.5cm的带芽茎段，接种于MS启动培养基中，在培养温度为25±3℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下进行暗培养10d开始萌发，发育成不定芽,所述MS启动培养基是以MS为基本培养基，还加入0.5～2.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0～1.0mg/L的吲哚丁酸IBA和0～2.0mg/L萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
(3)无菌芽的继代增殖：将步骤(2)中得到的不定芽剪切成1～2cm长的单芽或芽丛接种于MS继代增殖培养基中，在培养温度为25±3℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下培养30～40d便长出更多的芽丛，所述继代增殖培养基为MS基本培养基，添加0.1～3.0mg/L的噻重氮苯基脲TDZ、0.5～2.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.1～2.0mg/L的吲哚乙酸IBA，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
(4)无菌苗的生根：将步骤(3)中得到的芽丛剪切为单芽置于1/2MS生根培养基中，在培养温度为25±3℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下进行生根培养15～20d获得生根苗,所述1/2MS生根培养基是以1/2MS为基本培养基，还加入0～1.0mg/L的萘乙酸NAA、0～1.0mg/L的吲哚丁酸IBA，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
(5)无菌苗的保存：将步骤(4)中得到的生根苗置于离体保存培养基中，在培养温度为25±3℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下进行离体保存，所述离体保存培养基是以MS为基本培养基，还加入0.05～0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.05～0.1mg/L的萘乙酸NAA、0.5～2.0mg/L的PP333，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。
本发明的突出优点在于：
(1)本发明采用生物技术方法实现了黑果菝葜的初代诱导出芽及长期保存。该方法使无菌苗诱导率和存活率高，生长健壮，继代周期延长，减少工作量和成本，保证无菌苗种质的优良性和遗传稳定性。
(2)所用试剂升汞、酒精，MS基本培养基和6-苄基腺嘌呤6-BA、萘乙酸NAA、噻重氮苯基脲TDZ、吲哚丁酸IBA，价格低廉，试验成本低。
(3)采用本发明所述的初代诱导及保存的方法，暗培养10d开始长出新芽，培养30d，芽诱导率达78.5％，继代培养50d即可成苗，生根培养30d生根率为82.5％，在离体保存培养基上保存180d后，存活率最高为80.7％。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进一步说明。
实施例1
(1)外植体的消毒：将3～5滴洗洁精滴入装有100ml自来水的烧杯中，取无病虫害黑果菝葜当年生的幼嫩带芽茎段剪切成4cm长的带芽茎段，置于烧杯中搅拌，再用软毛刷擦拭表面污垢，流水冲洗15min，然后在超净工作台内用75v/v％的乙醇消毒15S，无菌水冲洗1次，再用0.1v/v％HgCl2消毒10min，无菌水浸泡3次，每次约2min，用无菌滤纸吸干外植体表面水分，获得外植体，其中无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水；
(2)无菌芽的诱导：将步骤(1)得到的外植体剪切成1～1.5cm的带芽茎段，接种于MS启动培养基中，在培养温度25±3℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下进行暗培养12d开始萌发，发育成不定芽。所述MS启动培养基是以MS为基本培养基，还加入0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.5mg/L萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，诱导培养30d，出芽率为74.8％；
(3)无菌芽的继代增殖：将步骤(2)中得到的不定芽剪切成1～2cm长的单芽或芽丛接种于MS继代增殖培养基中，在培养温度为25±3℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下培养30～40d便长更多的芽丛。所述MS继代增殖培养基中添加0.1mg/L的噻重氮苯基脲TDZ、2.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、1.0mg/L的吲哚乙酸IBA，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8,培养30d，增殖系数为2.6；
(4)无菌苗的生根：将步骤(3)中得到的芽丛剪切为单芽置于1/2MS生根培养基中，在培养温度为25±3℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下进行生根培养15～20d可获得生根苗。所述1/2MS生根培养基中添加0.5mg/L的吲哚丁酸IBA，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养30d，生根率为65.3％；
(5)无菌苗的保存：将步骤(4)中得到的生根苗置于离体保存培养基中，在培养温度为25±3℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下进行离体保存，所述离体保存培养基是以MS为基本培养基，还加入0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.1mg/L的萘乙酸NAA、0.5mg/L的PP333，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，保存180d，存活率为68.4％。
实施例2
(1)外植体的消毒：将3～5滴洗洁精滴入装有100ml自来水的烧杯中，取无病虫害黑果菝葜当年生的幼嫩带芽茎段剪切成4cm长的带芽茎段，置于烧杯中搅拌，再用软毛刷擦拭表面污垢，流水冲洗15min，然后在超净工作台内用体积百分比为75v/v％的乙醇消毒15S，无菌水冲洗1次，再用0.1v/v％HgCl2消毒10min，无菌水浸泡3次，每次约2min，用无菌滤纸吸干外植体表面水分，获得外植体，其中无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水；
(2)无菌芽的诱导：将步骤(1)得到的外植体剪切成1～1.5cm的带芽茎段，接种于MS启动培养基中，在培养温度25±3℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下进行暗培养，培养10d开始萌发，发育成不定芽。所述MS启动培养基是以MS为基本培养基，还加入1.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.1mg/L的吲哚丁酸IBA和0.2mg/L萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，诱导培养30d，出芽率为78.5％；
(3)无菌芽的继代增殖：将步骤(2)中得到的不定芽剪切成1～2cm长的单芽或芽丛接种于MS继代增殖培养基中，在培养温度为25±3℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下培养30～40d便长更多的芽丛。所述继代增殖培养基为MS基本培养基，添加1.0mg/L的噻重氮苯基脲TDZ、1.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、2.0mg/L的吲哚乙酸IBA，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养30d,增殖系数为3.2；
(4)无菌苗的生根：将步骤(3)中得到的芽丛剪切为单芽置于1/2MS生根培养基中，在培养温度为25±3℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下进行生根培养15～20d可获得生根苗。所述1/2MS生根培养基是以1/2MS为基本培养基，还加入0.5mg/L的萘乙酸NAA，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8,培养30d，生根率为76.7％；
(5)无菌苗的保存：将步骤(4)中得到的生根苗置于离体保存培养基中，在培养温度25±3℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下进行离体保存，所述离体保存培养基是以MS为基本培养基，还加入0.1mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.05mg/L的萘乙酸NAA、1.0mg/L的PP333，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8,保存180d，存活率为72.5％。
实施例3
(1)外植体的消毒：将3～5滴洗洁精滴入装有100ml自来水的烧杯中，取无病虫害黑果菝葜当年生的幼嫩带芽茎段剪切成4cm长的带芽茎段，置于烧杯中搅拌，再用软毛刷擦拭表面污垢，流水冲洗15min，然后在超净工作台内用体积百分比为75v/v％的乙醇消毒15S，无菌水冲洗1次，再用0.1v/v％HgCl2消毒10min，无菌水浸泡3次，每次约2min，用无菌滤纸吸干外植体表面水分，获得外植体，其中无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水；
(2)无菌芽的诱导：将步骤(1)得到的外植体剪切成1～1.5cm的带芽茎段，接种于MS启动培养基中，在培养温度25±3℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下进行暗培养14d开始萌发，发育成不定芽。所述MS启动培养基是以MS为基本培养基，还加入2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.5mg/L的吲哚丁酸IBA和1.0mg/L萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8,诱导培养30d，出芽率为71.6％；
(3)无菌芽的继代增殖：将步骤(2)中得到的不定芽剪切成1～2cm长的单芽或芽丛接种于MS继代增殖培养基中，在培养温度25±3℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下培养30～40d便长出更多的芽丛。所述MS继代增殖培养基是MS基本培养基中添加2.0mg/L的噻重氮苯基脲TDZ、1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.1mg/L的吲哚乙酸IBA，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养30d，增殖系数为4.1；
(4)无菌苗的生根：将步骤(3)中得到的芽丛剪切为单芽置于1/2MS生根培养基中，在培养温度为25±3℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下进行生根培养15～20d可获得生根苗。所述1/2MS生根培养基是以1/2MS为基本培养基，还加入1.0mg/L的萘乙酸NAA、0.5mg/L的吲哚丁酸IBA，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养30d，生根率为82.5％；
(5)无菌苗的保存：将步骤(4)中得到的生根苗置于离体保存培养基中，在培养温度为25±3℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下进行离体保存，所述离体保存培养基是以MS为基本培养基，还加入0.05mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.1mg/L的萘乙酸NAA、1.5mg/L的PP333，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8,保存180d，存活率为80.7％。
实施例4
(1)外植体的消毒：将3～5滴洗洁精滴入装有100ml自来水的烧杯中，取无病虫害黑果菝葜当年生的幼嫩带芽茎段剪切成4cm长的带芽茎段，置于烧杯中搅拌，再用软毛刷擦拭表面污垢，流水冲洗15min，然后在超净工作台内用75v/v％的乙醇消毒15S，无菌水冲洗1次，再用0.1v/v％HgCl2消毒10min，无菌水浸泡3次，每次约2min，用无菌滤纸吸干外植体表面水分，获得外植体，其中无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水；
(2)无菌芽的诱导：将步骤(1)得到的外植体剪切成1～1.5cm的带芽茎段，接种于MS启动培养基中，在培养温度25±3℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下进行暗培养，培养15d开始萌发，发育成不定芽。所述MS启动培养基是以MS为基本培养基，还加入2.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、1.0mg/L的吲哚丁酸IBA和2.0mg/L萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8,诱导培养30d，出芽率为69.7％；
(3)无菌芽的继代增殖：将步骤(2)中得到的不定芽剪切成1～2cm长的单芽或芽丛接种于MS继代增殖培养基中，在培养温度25±3℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下培养30～40d便长出更多的芽丛。所述继代增殖培养基为MS基本培养基，添加3.0mg/L的噻重氮苯基脲TDZ、0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.5mg/L的吲哚乙酸IBA，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养30d，增殖系数为2.9；
(4)无菌苗的生根：将步骤(3)中得到的芽丛剪切为单芽置于1/2MS生根培养基中，在培养温度25±3℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下进行生根培养15～20d可获得生根苗。所述1/2MS生根培养基是以1/2MS为基本培养基，还加入0.5mg/L的萘乙酸NAA、1.0mg/L的吲哚丁酸IBA，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养30d，生根率为77.4％；
(5)无菌苗的保存：将步骤(4)中得到的生根苗置于离体保存培养基中，在培养温度25±3℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下进行离体保存，所述离体保存培养基是以MS为基本培养基，还加入0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.1mg/L的萘乙酸NAA、2.0mg/L的PP333，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，保存180d，存活率为69.3％。

Claims (1)

1.一种黑果菝葜初代诱导及离体保存的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
(1)外植体的消毒：将3～5滴洗洁精滴入装有100ml自来水的烧杯中，取无病虫害黑果菝葜当年生的幼嫩带芽茎段剪切成4cm长的带芽茎段，置于烧杯中搅拌，再用软毛刷擦拭表面污垢，流水冲洗15min，然后在超净工作台内用75％v/v的乙醇消毒15S，无菌水冲洗1次，再用0.1％v/v HgCl2消毒10min，无菌水浸泡3次，每次约2min，用无菌滤纸吸干外植体表面水分，获得外植体，其中无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水；
(2)无菌芽的诱导：将步骤(1)得到的外植体剪切成1～1.5cm的带芽茎段，接种于MS启动培养基中，在培养温度为25±3℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下进行培养10d开始萌发，发育成不定芽,所述MS启动培养基是以MS为基本培养基，还加入0.5～2.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0～1.0mg/L的吲哚丁酸IBA和0～2.0mg/L萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
(3)无菌芽的继代增殖：将步骤(2)中得到的不定芽剪切成1～2cm长的单芽或芽丛接种于MS继代增殖培养基中，在培养温度为25±3℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下培养30～40d便长出更多的芽丛，所述继代增殖培养基为MS基本培养基，添加0.1～3.0mg/L的噻重氮苯基脲TDZ、0.5～2.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.1～2.0mg/L的吲哚乙酸IBA，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
(4)无菌苗的生根：将步骤(3)中得到的芽丛剪切为单芽置于1/2MS生根培养基中，在培养温度为25±3℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下进行生根培养15～20d获得生根苗,所述1/2MS生根培养基是以1/2MS为基本培养基，还加入0～1.0mg/L的萘乙酸NAA、0～1.0mg/L的吲哚丁酸IBA，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；
(5)无菌苗的保存：将步骤(4)中得到的生根苗置于离体保存培养基中，在培养温度为25±3℃，光照强度20～30μmol/m2·s，光照时间为12h/d的条件下进行离体保存，所述离体保存培养基是以MS为基本培养基，还加入0.05～0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.05～0.1mg/L的萘乙酸NAA、0.5～2.0mg/L的PP333，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。
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