CN105918124B - 一种黄花油点草组织培养与快速繁殖的方法 - Google Patents

一种黄花油点草组织培养与快速繁殖的方法 Download PDF

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    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/008—Methods for regeneration to complete plants

Abstract

本发明公开了一种黄花油点草组织培养与快速繁殖的方法，依次包括以下步骤1）外植体的消毒：剪取黄花油点草茎段，清洗后消毒，接种到添加植物生长调节剂的MS培养基中；2）腋芽的诱导；3)丛生芽的诱导；4）不定芽的增殖和壮苗；5）不定芽的生根培养；6）再生苗的炼苗和移栽。在上述步骤中采用了不同成分和配比的培养基。采用本发明方法，黄花油点草茎段腋芽诱导率达96.6%，丛生芽诱导率达90%左右，不定芽增殖倍数达5.6‑5.8，幼苗生根率达97.1%以上，植株炼苗成活率达98.8%，植株移栽成活率达98%以上，按此方法，每年可以繁殖超过100万株幼苗。

Description

一种黄花油点草组织培养与快速繁殖的方法
技术领域
本发明属于植物培养技术领域，具体涉及一种黄花油点草组织培养与快速繁殖的方法。
背景技术
黄花油点草[Tricyrtis maculata (D. Don) Machride]，是百合科（Liliaceae）油点草属（Tricyrtis）多年生草本植物，产云南、四川、贵州、陕西、甘肃、河北、河南、湖南和湖北等地。生于海拔280-2300米的山坡林下、路旁等处。其根或全草入药，名黑点草，也叫立竹根、山黄瓜、黄瓜菜、大黄瓜香、瓜米菜，其性微寒，味甘，具清热除烦、活血消肿之功效，主治胃热口渴、烦燥不安、劳伤、水肿；其花的颜色常有变化，由绿白色、淡黄色至近黄色，花被片内面的斑点由紫黑色点状小块分布到紫褐色星散地分布，具有良好的观赏价值，有待于商业化。油点草属植物在全世界约15种，国内有4种，分别为台湾油点草（T. Formosana）、油点草（T. Macropoda）、黄花油点草（T. Maculata）、紫花油点草（T. Stolonifera），目前尚未有该属植物的组织培养快速繁殖的研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一种成活率高，利于实现产业化生产的黄花油点草组织培养与快速繁殖的方法。
为实现本发明之目的，采用以下技术方案予以实现：一种黄花油点草组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）黄花油点草的消毒
4月至8月之间，剪取带腋芽的茎段，先用软毛刷于自来水下轻柔刷洗，加入适量的洗洁精溶液浸泡2 min，倾倒洗洁精溶液后用流水冲洗0.5 h后，在紫外灯消毒30 min以上的超净工作台里将茎段转入70%的酒精溶液中浸泡1 min，用无菌水冲洗3次，浸泡入滴加有2滴吐温-80的0.1% HgCl2溶液内浸泡消毒12-13 min，然后用无菌水充分浸洗3次，即可得到消完毒的外植体；
（2）腋芽的诱导
将上一步得到的的外植体，以正常的极性方向插入到装有添加NAA 0.1-0.5 g/L，6-BA 1.0-5.0 mg/L的MS基本培养基的培养瓶中，该培养基中的蔗糖添加量为30 g/L，琼脂添加量为8 g/L，活性炭的添加量为0-2.0 g/L，pH为5.8-6.0，培养基曾于121℃下高温高压灭菌20 min；接种好的培养瓶先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度为30-40 μmol/(m2·s)，光源为白色节能灯；
（3）丛生芽的诱导
待上一步培养的腋芽长出后，在紫外灯灭菌30 min的超净工作台里切下带腋芽的茎段，以正常的极性方向接种到装有添加TDZ 0-2.0 mg/L，6-BA 0-5.0 mg/L的MS基本培养基的培养瓶中，该培养基中的蔗糖添加量为30 g/L，琼脂添加量为8.0 g/L，活性炭的添加量为0.5 g/L，pH为5.8-6.0，培养基曾于121℃下高温高压灭菌20 min；先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度30-40 μmol/(m2·s)，光源为白色节能灯；
（4）不定芽的增殖
将上一步诱导获得的不定芽丛切成2-3株不定芽的芽块，接种到装有添加6-BA 0-6.0mg/L，IAA 0-3.0 mg/L的MS基本培养基的培养基中，该培养基中的蔗糖添加量为30 g/L，琼脂添加量为8.0 g/L，活性炭的添加量为0.5 g/L，pH为5.8-6.0，培养基曾于121℃下高温高压灭菌20 min；先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度30-40 μmol/(m2·s)，光源为白色节能灯；
（5）再生植株的生根培养
切取叶片嫩绿、生长旺盛且2~3 cm高的不定芽，插入到添加NAA 0-1.0 mg/L ，AC0.5 mg的12.5%-100% MS基本培养基的培养瓶中，该培养基中的蔗糖添加量为10-50 g/L，琼脂添加量为8.0 g/L，活性炭的添加量为0.5 g/L，pH为5.8-6.0，培养基曾于121℃下高温高压灭菌20 min；先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度30-40 μmol/(m2·s)；
（6）炼苗移栽
待生根的组培苗的苗高长至5 cm以上，根长超过5 cm时，松开组培瓶的瓶盖，往瓶中注入少量清水，防止培养基干裂，但先不移开瓶盖，12 h后半挪开瓶盖，再过12 h，移走瓶盖，让灯光直照再生植株培养2 d；然后小心地将培养基捣碎，拿出再生植株，用水浸润根部过夜后，小心将残留的琼脂冲洗干净，将植株定植于珍珠岩、泥炭重量比为 1：（1-5）的混合基质中，浇透水并用透明的聚乙烯塑料薄膜覆盖以保温保湿，室内温度控制在15-25℃，光源可采用自然光或白色节能灯；第8 d松开薄膜，使与外面空气相通，第9 d揭开薄膜，经常于叶面喷雾保持湿润，适应3-5 d后可移栽大田中。
作为优选方案：用于丛生芽诱导的材料为步骤（1）和（2）获得的无菌萌发的腋芽。
作为优选方案：所述步骤（2）中MS基本培养基中添加了6-BA 2.0 mg/L，NAA 0.2mg/L，活性炭0.5 mg/L。
作为优选方案：所述步骤（3）中MS基本培养基中添加了TDZ 0.5 mg/L，6-BA 1.0-2.0 mg/L。
作为优选方案：所述步骤（4）中MS基本培养基中添加了6-BA 2.0 mg/L，IAA 0.5-1.0 mg/L。
作为优选方案：所述步骤（5）中的生根培养基为25%MS基本培养基，NAA 0.2 mg/L，蔗糖15-20 g/L。
作为优选方案：所述步骤（6）中混合基质中珍珠岩与泥炭的重量比为 1：2。
与现有技术相比较，本发明的有益效果是：采用本发明的方法，能够快速地获得植株，利于产业化生产。采用本发明方法，黄花油点草茎段腋芽诱导率达96.6%，丛生芽诱导率达90%左右，不定芽增殖倍数达5.6-5.8，幼苗生根率为97.1%以上，幼苗炼苗成活率达98.8%，植株移栽成活率达98%以上，按此方法，在一年内可繁殖出幼苗超过100万株。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供一种组织培养与快速繁殖的方法，包括以下步骤：
（1）黄花油点草的消毒
4月至8月之间，剪取带腋芽的茎段，先用软毛刷于自来水下轻柔刷洗，加入适量的洗洁精溶液浸泡2 min，倾倒洗洁精溶液后用流水冲洗0.5 h后，在紫外灯消毒30 min以上的超净工作台里将茎段转入70%的酒精溶液中浸泡1 min，用无菌水冲洗3次，浸泡入滴加有2滴吐温-80的0.1% HgCl2溶液内浸泡消毒12-13 min，然后用无菌水充分浸洗3次。经此步骤消毒的外植体，接种培养基20 d后统计发现，其污染率3.7%，成活率在91.8%；
（2）腋芽的诱导
将上一步得到的的外植体，以正常的极性方向插入到装有添加NAA 0.2 g/L，6-BA2.0 mg/L的MS基本培养基的培养瓶中，该培养基中的蔗糖添加量为30 g/L，琼脂添加量为8g/L，活性炭（AC）的添加量为0.5 g/L，pH为5.8-6.0，培养基曾于121℃下高温高压灭菌20min；接种好的培养瓶先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度为30-40 μmol/(m2·s)，光源为白色节能灯；最早培养5 d后腋芽出现明显的萌动，平均出现萌动的时间为8.6 d；30 d统计腋芽的萌发率达96.6%；
（3）丛生芽的诱导
待上一步培养的腋芽长出后，在紫外灯灭菌30 min的超净工作台里切下带腋芽的茎段，以正常的极性方向接种到装有添加TDZ 0.5 mg/L，6-BA 1.0-2.0 mg/L的MS基本培养基的培养瓶中，该培养基中的蔗糖添加量为30 g/L，琼脂添加量为8.0 g/L，活性炭的添加量为0.5 g/L，pH为5.8-6.0，培养基曾于121℃下高温高压灭菌20 min；先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度30-40 μmol/(m2·s)，光源为白色节能灯；在培养9 d时节间膨大起来，14 d开始出现丛生芽，30 d统计丛生芽诱导率为90%左右；
（4）不定芽的增殖
将上一步诱导获得的不定芽丛切成2-3株不定芽的芽块，以正常的极性方向接种到装有添加6-BA 2.0mg/L，IAA 0.5-1.0 mg/L的MS基本培养基的培养基中，该培养基中的蔗糖添加量为30 g/L，琼脂添加量为8.0 g/L，活性炭的添加量为0.5 g/L，pH为5.8-6.0，培养基曾于121℃下高温高压灭菌20 min；先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度30-40 μmol/(m2·s)，光源为白色节能灯；30 d统计不定芽的增殖倍数为5.6-5.8，不定芽的生长正常，叶色浓绿；
（5）再生植株的生根培养
切取叶片嫩绿、生长旺盛且2~3 cm高的不定芽，插入到添加NAA 0.2 mg/L，AC 0.5mg的25% MS基本培养基的培养瓶中，该培养基中的蔗糖添加量为15-20 g/L，琼脂添加量为8.0 g/L，活性炭的添加量为0.5 g/L，pH为5.8-6.0，培养基曾于121℃下高温高压灭菌20min；先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14h光/10 h暗，光照强度30-40 μmol/(m2·s)；生根最早在培养7 d后出现，30 d统计后发现平均出根时间为8.8 d，生根率为97.1%以上；
（6）炼苗移栽
待生根的组培苗的苗高长至5 cm以上，根长超过5 cm时，松开组培瓶的瓶盖，往瓶中注入少量清水，防止培养基干裂，但先不移开瓶盖，12 h后半挪开瓶盖，再过12 h，移走瓶盖，让灯光直照再生植株培养2 d；然后小心地将培养基捣碎，拿出再生植株，用水浸润根部过夜后，小心将残留的琼脂冲洗干净，将植株定植于珍珠岩、泥炭重量比为 1：2的混合基质中，浇透水并用透明的聚乙烯塑料薄膜覆盖以保温保湿，室内温度控制在15-25℃，光源可采用自然光或白色节能灯；第8 d松开薄膜，使与外面空气相通，第9 d揭开薄膜，经常于叶面喷雾保持湿润，适应5 d后统计发现炼苗成活率为98.8%，炼好苗后，小心挖出移栽入大田，按常规管理，移栽成活率可达98%以上。
文中涉及的缩略词：
6-BA 6-苄氨基腺嘌呤
AC 活性炭
IAA 吲哚乙酸
NAA 萘乙酸
TDZ 噻苯隆(脱叶脲)
MS Murashige和Skoog（1962）
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于步骤（2）腋芽的诱导：以正常的极性方向插入到装有添加NAA 0.1-0.6 mg/L，6-BA 1.0-6.0 mg/L的MS基本培养基的培养瓶中，该培养基中的蔗糖添加量为30 g/L，琼脂添加量为8 g/L，AC添加量为0-2.0 g/L，pH为5.8-6.0，培养基曾于121℃下高温高压灭菌20 min；接种好的培养瓶先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度为30-40 μmol/(m2·s)，光源为白色节能灯；30 d后统计发现，腋芽诱导率在0-97.9%之间，腋芽出芽平均时间为7.7-15.4 d之间，其中以NAA 0.2 mg/L，6-BA 2.0 mg/L，AC 0.5 g/L效果最佳，腋芽诱导率为98.7%，腋芽出芽平均时间为8.2 d。结果还表明随着6-BA浓度提高，腋芽诱导率增加，随着NAA浓度增加，腋芽生长速度加快。腋芽在萌发过程中可看到外植体周围的培养基产生褐色，而AC可去除褐化物质，但过多的AC却吸附过多营养，易导致生长的减缓。
表1 不同处理对腋芽诱导率和腋芽出芽平均时间的影响
处理 腋芽诱导率(%) 腋芽出芽平均时间(d) 腋芽生长长势
NAA 0.1 mg/L，6-BA 1.0 mg/L 72.2 13.2 出芽慢，生长慢，培养基有少量褐化
NAA 0.1 mg/L，6-BA 2.0 mg/L 78.6 12.1 出芽尚可，生长较慢，培养基有少量褐化
NAA 0.1 mg/L，6-BA 4.0 mg/L 85.7 10.9 出芽尚可，生长较慢，培养基有褐化
NAA 0.1 mg/L，6-BA 6.0 mg/L 80.2 9.6 生长较慢，叶稍有水渍化，培养基有褐化
NAA 0.2 mg/L，6-BA 2.0 mg/L 83.5 10.2 出芽尚可，生长较慢，培养基有褐化
NAA 0.4 mg/L，6-BA 2.0 mg/L 89.0 9.4 出芽尚可，生长较慢，培养基有褐化
NAA 0.6 mg/L，6-BA 2.0 mg/L 83.4 10.1 出芽尚可，生长较慢，培养基大量褐化
NAA 0.2 mg/L，6-BA 2.0 mg/L，AC 0.5 g/L 96.6 8.6 出芽快，生长快
NAA 0.2 mg/L，6-BA 2.0 mg/L，AC 1.0 g/L 95.8 9.2 出芽快，生长较快
NAA 0.2 mg/L，6-BA 2.0 mg/L，AC 2.0 g/L 98.1 9.9 出芽慢，生长慢
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于步骤（3）丛生芽的诱导：在紫外灯灭菌30 min的超净工作台里切下带腋芽的茎段，以正常的极性方向接种到装有添加TDZ 0-2.0 mg/L，6-BA0-6.0 mg/L的MS基本培养基的培养瓶中，该培养基中的蔗糖添加量为30 g/L，琼脂添加量为8.0 g/L，活性炭的添加量为0.5 g/L，pH为5.8-6.0，培养基曾于121℃下高温高压灭菌20min；先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14h光/10 h暗，光照强度30-40 μmol/(m2·s)，光源为白色节能灯。30 d后统计发现，不定芽诱导率介于0-91.8%之间，不定芽数为1.0-8.8之间，其中以MS，TDZ 0.5 mg/L，6-BA 2.0mg/L效果最佳，不定芽诱导率在90%左右，不定芽数在6.4-6.5，而且不定芽叶色浓绿，生长良好，株高和茎粗适中。结果还表明，6-BA对于丛生芽的诱导效果较弱，TDZ较强，两者组合效果更佳。
表2 不同处理对丛生芽诱导的影响
处理 丛生芽诱导率(%) 不定芽数 生长情况
TDZ 0.5 mg/L 68.5 5.5 不定芽叶色淡绿，生长尚可
TDZ 1.0 mg/L 72.6 5.8 不定芽叶色浓绿，生长良好
TDZ 2.0 mg/L 73.4 5.7 不定芽玻璃化严重，叶片和茎水渍状
TDZ 0.5 mg/L，6-BA 1.0 mg/L 89.6 6.4 不定芽叶色淡绿，生长良好
TDZ 0.5 mg/L，6-BA 2.0 mg/L 90 6.5 不定芽叶色淡绿，生长尚可，有水渍化倾向
TDZ 0.5 mg/L，6-BA 6.0 mg/L 84.2 7.2 不定芽玻璃化严重，叶片和茎水渍状
实施例4
本实施例与实施例1的区别在于步骤（4）丛生芽的增殖：将上一步诱导获得的不定芽丛切成2-3株不定芽的芽块，接种到装有添加6-BA 0-6.0mg/L，IAA 0-3.0 mg/L的MS基本培养基的培养基中，该培养基中的蔗糖添加量为30 g/L，琼脂添加量为8.0 g/L，活性炭的添加量为0.5 g/L，pH为5.8-6.0，培养基曾于121℃下高温高压灭菌20 min；先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度30-40 μmol/(m2·s)，光源为白色节能灯。30 d后统计发现，各培养基中不定芽的增殖倍数在1.0-6.2之间，高的生长素和细胞分裂素均容易产生玻璃化现象，表现最佳的培养基为MS，6-BA 2.0 mg/L，IAA 0.5-1.0 mg/L其增殖倍数在5.6-5.8，且无玻璃化苗，植株粗壮，且生长较快。
表3 不同处理对不定芽增殖的影响
不同处理 增殖倍数 生长情况
6-BA 2.0 mg/L 5.1 生长较慢
6-BA 4.0 mg/L 5.8 生长较慢
6-BA 6.0 mg/L 6.2 生长较慢，叶有水渍化
6-BA 2.0 mg/L，IAA 0.5 mg/L 5.6 生长快，茎粗壮
6-BA 2.0 mg/L，IAA 1.0 mg/L 5.8 生长快，茎粗壮
6-BA 2.0 mg/L，IAA 3.0 mg/L 5.2 生长快，茎较弱，且有水渍
实施例5
本实施例与实施例1的区别在于步骤（5）再生植株的生根培养：切取叶片嫩绿、生长旺盛且2~3 cm高的不定芽，插入到添加NAA 0-1.0 mg/L，活性炭0.5 mg/L的12.5%-100%MS基本培养基的培养瓶中，该培养基中的蔗糖添加量为10-50 g/L，琼脂添加量为8.0 g/L，活性炭的添加量为0.5 g/L，pH为5.8-6.0，培养基曾于121℃下高温高压灭菌20 min；先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14 h光/10h暗，光照强度30-40 μmol/(m2·s)；30 d时统计发现，最早生根时间8-14 d，生根率在59.8-98.8%，说明较易生根，MS基本培养基的浓度对于生根基本无影响，只不过太低的浓度下生根的再生植株生长柔弱；蔗糖浓度对于不定芽的生根影响也不大；最佳的组合为25%MS，NAA 0.2 mg/L，蔗糖15-20 g/L，生根时间早，最早7 d就可以生根，生根率可达97.1%以上，根粗适中，叶绿浓绿，适于炼苗移栽。
表4 不同培养基对生根的影响
培养基 生根率(%) 最早发根时间（d） 平均生根时间（d） 生长情况
12.5%MS，蔗糖30 g/L 64.3 10 11.6 根细、长，叶色黄
25%MS，蔗糖30 g/L 66.8 11 13.2 根粗和根长适中，叶色较黄
50%MS，蔗糖30 g/L 67.5 11 13.5 根较细长，叶色浓绿
MS，蔗糖30 g/L 59.8 13 15.4 根较细长，叶色浓绿
25%MS，蔗糖20 g/L 68.3 10 11.3 根较细长，叶色浓绿
25%MS，蔗糖50 g/L 63.2 14 16.8 根较细长，叶色逍绿
25%MS，NAA 0.1 mg/L，蔗糖20 g/L 90.4 8 9.5 根粗和根长适中，叶色浓绿
25%MS，NAA 0.2 mg/L，蔗糖20 g/L 97.1 7 8.8 根粗和根长适中，叶色浓绿
25%MS，NAA 0.2 mg/L，蔗糖15 g/L 97.4 7 8.8 根粗和根长适中，叶色浓绿
25%MS，NAA 0.5 mg/L，蔗糖20 g/L 98.8 8 9.1 根粗、短，叶稍有水渍化
实施例6
本实施例与实施例1的区别在于步骤（6）炼苗移栽：待生根的组培苗的苗高长至5cm以上，根长超过5 cm时，松开组培瓶的瓶盖，往瓶中注入少量清水，防止培养基干裂，但先不移开瓶盖，12 h后半挪开瓶盖，再过12 h，移走瓶盖，让灯光直照再生植株培养2 d；然后小心地将培养基捣碎，拿出再生植株，用水浸润根部过夜后，小心将残留的琼脂冲洗干净，将植株定植于珍珠岩、泥炭重量比为 1：（1-5）的混合基质中，浇透水并用透明的聚乙烯塑料薄膜覆盖以保温保湿，室内温度控制在15-25℃，光源可采用自然光或白色节能灯；第8 d松开薄膜，使与外面空气相通，第9 d揭开薄膜，经常于叶面喷雾保持湿润，适应3-5 d后可移栽大田中。适应5 d后统计发现，随着泥炭的比例提高，幼苗的生长变得健壮，但炼苗成活率却有小幅下降，这主要是因为珍珠岩在培养基中起到保水透气的作用，而泥炭提供幼苗生长所需的营养。综合来看，珍珠岩与泥炭的比例在1：2时，炼苗成活率和幼苗生长达到最佳。
表5 不同栽培基质对炼苗成活率的影响
珍珠岩、泥炭重量比 炼苗成活率（%） 生长状况
1：1 98.5 苗稍黄
1：2 98.8 苗生长佳
1：3 92.7 苗生长佳
1：4 88.5 苗生长佳
1：5 82.9 苗生长佳
对比实施例1至6可知，实施例1为最优选的实施例，实施例1的每个步骤均采用了实施例2至6所述的最佳培养条件，能够获得最高的植株产量。

Claims (1)

1.一种黄花油点草组织培养与快速繁殖的方法，包括以下步骤：
（1）黄花油点草的消毒
4月至8月之间，剪取带腋芽的茎段，先用软毛刷于自来水下轻柔刷洗，加入适量的洗洁精溶液浸泡2 min，倾倒洗洁精溶液后用流水冲洗0.5 h后，在紫外灯消毒30 min以上的超净工作台里将茎段转入70%的酒精溶液中浸泡1 min，用无菌水冲洗3次，浸泡入滴加有2滴吐温-80的0.1% HgCl2溶液内浸泡消毒12-13 min，然后用无菌水充分浸洗3次；
（2）腋芽的诱导
将上一步得到的的外植体，以正常的极性方向插入到装有添加NAA 0.2 g/L，6-BA 2.0mg/L的MS基本培养基的培养瓶中，该培养基中的蔗糖添加量为30 g/L，琼脂添加量为8 g/L，活性炭的添加量为0.5 g/L，pH为5.8-6.0，培养基曾于121℃下高温高压灭菌20 min；接种好的培养瓶先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度为30-40 μmol/(m2·s)，光源为白色节能灯；
（3）丛生芽的诱导
待上一步培养的腋芽长出后，在紫外灯灭菌30 min的超净工作台里切下带腋芽的茎段，以正常的极性方向接种到装有添加TDZ 0.5 mg/L，6-BA 1.0-2.0 mg/L的MS基本培养基的培养瓶中，该培养基中的蔗糖添加量为30 g/L，琼脂添加量为8.0 g/L，活性炭的添加量为0.5 g/L，pH为5.8-6.0，培养基曾于121℃下高温高压灭菌20 min；先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度30-40 μmol/(m2·s)，光源为白色节能灯；
（4）不定芽的增殖
将上一步诱导获得的不定芽丛切成2-3株不定芽的芽块，以正常的极性方向接种到装有添加6-BA 2.0mg/L，IAA 0.5-1.0 mg/L的MS基本培养基的培养基中，该培养基中的蔗糖添加量为30 g/L，琼脂添加量为8.0 g/L，活性炭的添加量为0.5 g/L，pH为5.8-6.0，培养基曾于121℃下高温高压灭菌20 min；先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度30-40 μmol/(m2·s)，光源为白色节能灯；
（5）再生植株的生根培养
切取叶片嫩绿、生长旺盛且2~3 cm高的不定芽，插入到添加NAA 0.2 mg/L，AC 0.5 mg的25% MS基本培养基的培养瓶中，该培养基中的蔗糖添加量为15-20 g/L，琼脂添加量为8.0 g/L，活性炭的添加量为0.5 g/L，pH为5.8-6.0，培养基曾于121℃下高温高压灭菌20min；先置于黑暗中过夜，随后光照培养，培养条件为：培养温度为(25±1)℃，光照时间为14h光/10 h暗，光照强度30-40 μmol/(m2·s)；
（6）炼苗移栽
待生根的组培苗的苗高长至5 cm以上，根长超过5 cm时，松开组培瓶的瓶盖，往瓶中注入少量清水，防止培养基干裂，但先不移开瓶盖，12 h后半挪开瓶盖，再过12 h，移走瓶盖，让灯光直照再生植株培养2 d；然后小心地将培养基捣碎，拿出再生植株，用水浸润根部过夜后，小心将残留的琼脂冲洗干净，将植株定植于珍珠岩、泥炭重量比为 1：2的混合基质中，浇透水并用透明的聚乙烯塑料薄膜覆盖以保温保湿，室内温度控制在15-25℃，光源可采用自然光或白色节能灯；第8 d松开薄膜，使与外面空气相通，第9 d揭开薄膜，经常于叶面喷雾保持湿润，炼好苗后，小心挖出移栽入大田。
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