CN104920228B - 一种宝兴百合组培快繁和离体保存方法 - Google Patents

一种宝兴百合组培快繁和离体保存方法 Download PDF

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一种宝兴百合组培快繁和离体保存方法，包括获取外植体、诱导不定芽与增殖培养、鳞茎增大及生根培养、离体保存、移栽步骤，以宝兴百合的鳞片为外植体，建立宝兴百合的组培快繁和离体保存体系，增值系数高达1∶10，离体保存继代周期达4年以上。该方法有效地解决了宝兴百合的组培快繁问题，大大延长了离体保存周期，有利于宝兴百合种质资源的保存和开发利用，为宝兴百合的育种奠定了基础。

Description

一种宝兴百合组培快繁和离体保存方法
技术领域：
本发明涉及植物生物技术领域，具体地，涉及植物宝兴百合(Lilium duchartreiFranch.)的组培快繁和离体保存方法。
背景技术：
宝兴百合(Lilium duchartrei Franch.)为百合科百合属植物，中国特有，主要分布于我国四川、云南、西藏和甘肃等省区，生于海拔2300-3500米的高山草地、林缘或灌木丛中。宝兴百合是亚洲产百合种类中唯一具香味、花白色、花瓣反卷的野生种类。宝兴百合以鳞茎入药，润肺止咳，清热安神，可用于治疗肺结核，慢性支气管炎等症。宝兴百合是培育香花型百合品种的潜在亲本，不仅是百合育种研究中的优异种质材料，而且其自身也具有极大的商业开发潜力。我国百合属植物资源丰富，是世界百合育种重要的亲本来源。百合属植物组培繁殖相关工作已有报道，但大多集中在具有观赏价值的园艺品种或杂交种。目前，针对我国的野生百合种质资源组培繁殖和离体保存方面的工作有很少报道。其中如专利公开号为CN104663458A的关于川百合的组培快繁，CN102204512B的关于细叶百合的组培快繁的报道，这两种野生百合的组培繁殖强度也较大，在不定芽诱导方面采用了不同的培养基。宝兴百合虽已有组培快繁和离体保存方面的探索，但在增殖情况和离体保存继代周期方面仍不尽如人意，如，傅伊倩(2012，几种野生百合离体保存技术的研究)以宝兴百合的叶片为外植体，在MS+NAA2.0mg/L+TDZ 0.2mg/L培养基中，其增值系数仅为3.29，在1/2MS+NAA0.5mg/L+活性炭2g/L的离体保存培养基中，继代周期也仅为1个月。为使宝兴百合这一中国特有的野生种质资源能实现人工大规模繁殖，实现更加有效的离体保存，节省人力物力，需要提供一种宝兴百合更有效率的组培快繁和离体保存方法。
发明内容：
本发明的目的在于提供现有技术中未有的一种中国特有、极具观赏和药用潜力的植物宝兴百合的组培快繁和离体保存方法。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
宝兴百合(Lilium duchartrei Franch.)的组培快繁和离体保存方法，取宝兴百合的中层鳞片进行消毒后，接种在不定芽诱导和增殖培养基上，获得小鳞茎后，转接到可使鳞茎增大及生根的培养基中，经过炼苗处理后，即可移栽。去除长根且增大的鳞茎的根和叶，置于离体保存培养基中，在低温条件下培养，离体保存周期可延长至4年。
上述方法的不定芽诱导和增殖培养基为(1)MS+BA 0.5mg/L+2,4-D 1.0mg/L；(2)鳞茎增大及生根培养基：MS+PPP3332.0mg/L+NAA 0.5mg/L；(3)离体保存培养基：MS+PPP3330.3mg/L+BA 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L+TDZ0.06mg/L。以上培养基(1)和(3)添加蔗糖20g/L，(2)添加蔗糖90g/L，(2)和(3)添加活性炭1-2g/L。所有培养基均添加琼脂5.6g/L固化，pH5.8，除离体保存培养条件为13±2℃外，其余培养温度均为25±2℃，光照强度10-20μmol/(m2·s)，光照12h/d。
具体地，本发明的方法是野外获取宝兴百合的鳞茎，用湿苔藓包裹带回实验室，将鳞茎表面泥土用纱布搽洗干净，选取中层鳞片放入已滴加2-3滴洗洁精的自来水中浸泡5min，再用流动自来水冲洗30-40min，再用75％酒精进行表面消毒20-30s，并用无菌水冲洗5遍，再用0.1％HgCl2水溶液进行消毒16-20min，在无菌条件下用无菌水反复水洗3遍，将鳞片接种至不定芽诱导培养基MS+BA0.5mg/L+2,4-D 1.0mg/L中，15天后长出愈伤组织，30天后出现芽分化，并有新叶片长出，继续在此培养条件下继代培养2-3次，20天继代一次，增值率可达1∶10；将新增殖的鳞茎转接在生根培养基MS+PPP3332.0mg/L+NAA 0.5mg/L，培养15天，可长根4条以上，在此培养基中继续培养，在诱导生根的同时鳞茎能增大至直径1.5-2.0cm。将已生根增大的鳞茎去除根叶，转至培养基MS+PPP3330.3mg/L+BA 0.5mg/L+NAA0.5mg/L+TDZ 0.06mg/L中，培养瓶口用保鲜膜缠绕6圈以上封严，在培养温度为13±2℃条件下，继代周期可延长至4年以上。将生根4条左右、根长为1-2cm的小苗炼苗处理移栽至经5％甲醛水溶液消毒过的腐叶土∶沙土∶珍珠岩＝1∶1∶1的基质中，移栽成苗率90％以上。
更具体地，宝兴百合的组培快繁和离体保存方法包括获取外植体、诱导不定芽与增殖培养、鳞茎增大及生根培养、离体保存、移栽步骤，培养条件为：(1)不定芽诱导和增殖培养基：MS+BA 0.5mg/L+2,4-D 1.0mg/L；(2)鳞茎增大及生根培养基：MS+PPP3332.0mg/L+NAA 0.5mg/L；(3)离体保存培养基：MS+PPP3330.3mg/L+BA 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L+TDZ0.06mg/L，以上培养基(1)和(3)添加蔗糖20g/L，(2)添加蔗糖90g/L，(2)和(3)添加活性炭1-2g/L，所有培养基均添加琼脂5.6g/L固化，pH5.8，除离体保存培养条件为13±2℃外，其余培养温度均为25±2℃，光照强度10-20μmol/(m2·s)，光照12h/d；
所述获取外植体步骤是取野生宝兴百合的鳞茎，洗净，选取中层鳞片放入已滴加2-3滴洗洁精的自来水中浸泡5min，再用流动自来水冲洗30-40min以清除鳞片表面杂质。将经过初步清洗的鳞片用75％酒精进行表面消毒20-30s，并用无菌水冲洗5遍，用0.1％HgCl2水溶液进行消毒16-20min，在无菌条件下用无菌水反复水洗3遍，用滤纸吸干表面水分，切去已经损伤的组织待用；
所述诱导不定芽与增殖培养步骤是将鳞片接种至不定芽诱导培养基(1)上，每瓶接种5个外植体；待长出愈伤组织，出现芽分化，长出新叶片后，继续在此培养条件下继代培养2-3次，20天继代一次，增值率可达1∶10；
所述的鳞茎增大及生根培养是将新增殖的鳞茎转接在培养基(2)上，每瓶接种5个，培养15天，长根4条以上，生根率100％；在此培养基中继续培养，在诱导生根的同时鳞茎增大至直径达1.5-2.0cm；
所述的离体保存步骤是将生根且增大的鳞茎去除根叶，转至培养基(3)中，每瓶接种5个，培养瓶口用保鲜膜缠绕6圈以上封严，以减弱后期瓶苗的呼吸作用，培养条件调整为13±2℃，光照强度为10μmol/(m2·s)，光照12h/d，继代周期可延长至4年以上；
所述的移栽步骤是当宝兴百合鳞茎生根达4条以上，根长为1-2cm时，先将瓶苗放在大棚内炼苗2天，后半开盖炼苗5天，然后进行移栽；移栽基质为经5％甲醛水溶液消毒过的腐叶土∶沙土∶珍珠岩＝1∶1∶1，栽好后浇透定根水，先期用塑料薄膜覆盖保湿，视苗生长状况进行及时通风以防过湿霉变，待试管苗长出新叶后，揭膜粗放管理，移栽成苗率达90％以上。
与现有技术相比，本发明的优益性在于：
本发明以宝兴百合的鳞片为外植体，通过不定芽诱导、鳞茎增殖、生根和离体保存等步骤，建立了宝兴百合的组培快繁和离体保存体系，增值系数高达1∶10，离体保存继代周期达4年以上。该方法有效地解决了宝兴百合的组培快繁问题，大大延长了离体保存周期，有利于宝兴百合种质资源的保存和开发利用，为宝兴百合的育种工作奠定了基础。
具体实施方式：
为了更好地说明本发明的实质，下面用本发明的实施例来进一步说明本发明，但本发明的内容并不局限于此。根据本发明技术方案和实施例的描述，也许同领域技术人员在本发明的基础上还可以对本发明技术方案进行一些修改和改进。因此，在不偏离本发明主要技术方案的基础上所做的修改和改进，均应属于本发明要求保护的范围。
实施例1：
1、材料：宝兴百合(Lilium duchartrei Franch.)。
2、材料类别：宝兴百合的中层鳞片。
3、培养条件：(1)不定芽诱导和增殖培养基：MS+BA 0.5mg/L+2,4-D 1.0mg/L；(2)鳞茎增大及生根培养基：MS+PPP3332.0mg/L+NAA 0.5mg/L；(3)离体保存培养基：MS+PPP3330.3mg/L+BA 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L+TDZ0.06mg/L。以上培养基(1)和(3)添加蔗糖20g/L，(2)添加蔗糖90g/L，(2)和(3)添加活性炭1-2g/L。所有培养基均添加琼脂5.6g/L固化，pH5.8，除离体保存培养条件为13±2℃外，其余培养温度均为25±2℃，光照强度10-20μmol/(m2·s)，光照12h/d。
4、生长与分化情况
4.1、外植体的获得：野外获取宝兴百合的鳞茎，用湿苔藓包裹带回实验室，将鳞茎表面泥土用纱布搽洗干净，选取中层鳞片放入已滴加2-3滴洗洁精的自来水中浸泡5min，再用流动自来水冲洗30-40min以清除鳞片表面杂质。将经过初步清洗的鳞片用75％酒精进行表面消毒20-30s，并用无菌水冲洗5遍，用0.1％HgCl2水溶液进行消毒16-20min，在无菌条件下用无菌水反复水洗3遍，用滤纸吸干表面水分，切去已经损伤的组织待用。
4.2、不定芽的诱导与增殖培养：将鳞片接种至不定芽诱导培养基(1)上，每瓶接种5个外植体；15天后长出愈伤组织，30天后出现芽分化，并有新叶片长出，继续在此培养条件下继代培养2-3次，20天继代一次，增值率可达1∶10。
4.3、鳞茎增大及生根培养基：将新增殖的鳞茎转接在培养基(2)上，每瓶接种5个，培养15天，可长根4条以上，生根率100％。在此培养基中继续培养，在诱导生根的同时鳞茎能增大至直径1.5-2.0cm。
4.4、离体保存：将成功诱导生根且增大的鳞茎去除根叶，转至培养基(3)中，每瓶接种5个，培养瓶口用保鲜膜缠绕6圈以上封严，以减弱后期瓶苗的呼吸作用，培养条件调整为13±2℃，光照强度为10μmol/(m2·s)，光照12h/d，继代周期可延长至4年以上。
4.5、移栽：当宝兴百合鳞茎生根4条左右、根长为1-2cm时，即可作移栽准备。首先将瓶苗放在大棚内炼苗2天，后半开盖炼苗5天，然后进行移栽。移栽基质为经5％甲醛水溶液消毒过的腐叶土∶沙土∶珍珠岩＝1∶1∶1，栽好后浇透定根水，先期可用塑料薄膜覆盖保湿，但需视苗生长状况进行及时通风以防过湿霉变，待试管苗长出新叶后，可揭膜粗放管理，移栽成苗率90％以上。

Claims (3)

1.宝兴百合的组培快繁和离体保存方法，所述的宝兴百合的组培快繁是取宝兴百合的中层鳞片进行消毒后，接种在不定芽诱导和增殖培养基上，获得小鳞茎后，转接到使鳞茎增大及生根的培养基中，经过炼苗处理后，移栽；所述的宝兴百合的离体保存是去除长根且增大的鳞茎的根和叶，置于离体保存培养基中，在低温条件下培养，离体保存周期延长至4年；所述不定芽诱导和增殖培养基为(1)：MS+BA 0.5mg/L+2,4-D 1.0mg/L；使鳞茎增大及生根培养基为(2)：MS+PPP333 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L；离体保存培养基为(3)：MS+PPP333 0.3mg/L+BA 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L+TDZ 0.06mg/L；以上培养基(1)和(3)添加蔗糖20g/L，(2)添加蔗糖90g/L，(2)和(3)添加活性炭1-2g/L；所有培养基均添加琼脂5.6g/L固化，pH5.8，除离体保存培养条件为13±2℃外，其余培养温度均为25±2℃，光照强度10-20μmol/(m2·s)，光照12h/d。
2.根据权利要求1所述的宝兴百合的组培快繁和离体保存方法，其特征在于所述的宝兴百合的组培快繁方法中，取野生宝兴百合的鳞茎，洗净，选取中层鳞片放入已滴加2-3滴洗洁精的自来水中浸泡5min后，用流动自来水冲洗30-40min，再用75％酒精进行表面消毒20-30s，并用无菌水冲洗5遍，再用0.1％HgCl2水溶液进行消毒16-20min，在无菌条件下用无菌水反复水洗3遍，将鳞片接种至不定芽诱导培养基MS+BA 0.5mg/L+2,4-D 1.0mg/L中，待长出愈伤组织，出现芽分化，长出新叶片后，继续在此培养条件下继代培养2-3次，20天继代一次；将新增殖的鳞茎转接在生根培养基MS+PPP333 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L，培养15天，长根后，在此培养基中继续培养，待鳞茎增大至直径1.5-2.0cm，将已生根增大的鳞茎去除根叶，转至培养基MS+PPP333 0.3mg/L+BA 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L+TDZ 0.06mg/L中，培养瓶口用保鲜膜封严，在培养温度为13±2℃条件下，继代周期延长至4年以上；将生根3-6条、根长为1-2cm的小苗炼苗处理后，移栽至经5％甲醛水溶液消毒过的腐叶土∶沙土∶珍珠岩＝1∶1∶1的基质中。
3.宝兴百合的组培快繁和离体保存方法，包括获取外植体、诱导不定芽与增殖培养、鳞茎增大及生根培养、离体保存、移栽步骤，其特征在于该方法的培养条件为：(1)不定芽诱导和增殖培养基：MS+BA 0.5mg/L+2,4-D 1.0mg/L；(2)鳞茎增大及生根培养基：MS+PPP3332.0mg/L+NAA 0.5mg/L；(3)离体保存培养基：MS+PPP333 0.3mg/L+BA0.5mg/L+NAA 0.5mg/L+TDZ 0.06mg/L，以上培养基(1)和(3)添加蔗糖20g/L，(2)添加蔗糖90g/L，(2)和(3)添加活性炭1-2g/L，所有培养基均添加琼脂5.6g/L固化，pH5.8，除离体保存培养条件为13±2℃外，其余培养温度均为25±2℃，光照强度10-20μmol/(m2·s)，光照12h/d；
所述的获取外植体步骤是取野生宝兴百合的鳞茎，洗净，选取中层鳞片放入已滴加2-3滴洗洁精的自来水中浸泡5min，再用流动自来水冲洗30-40min以清除鳞片表面杂质，将经过初步清洗的鳞片用75％酒精进行表面消毒20-30s，并用无菌水冲洗5遍，用0.1％HgCl2水溶液进行消毒16-20min，在无菌条件下用无菌水反复水洗3遍，用滤纸吸干表面水分，切去已经损伤的组织待用；
所述的诱导不定芽与增殖培养步骤是将鳞片接种至不定芽诱导培养基(1)上，每瓶接种5个外植体；待长出愈伤组织，出现芽分化，长出新叶片后，继续在此培养条件下继代培养2-3次，20天继代一次，增值率达1∶10；
所述的鳞茎增大及生根培养是将新增殖的鳞茎转接在培养基(2)上，每瓶接种5个，培养15天，长根4条以上，生根率100％；在此培养基中继续培养，在诱导生根的同时鳞茎增大至直径达1.5-2.0cm；
所述的离体保存步骤是将生根且增大的鳞茎去除根叶，转至培养基(3)中，每瓶接种5个，培养瓶口用保鲜膜缠绕6圈以上封严，以减弱后期瓶苗的呼吸作用，培养条件调整为13±2℃，光照强度为10μmol/(m2·s)，光照12h/d，继代周期延长至4年以上；
所述的移栽步骤是当宝兴百合鳞茎生根达4条以上，根长为1-2cm时，先将瓶苗放在大棚内炼苗2天，后半开盖炼苗5天，然后进行移栽；移栽基质为经5％甲醛水溶液消毒过的腐叶土∶沙土∶珍珠岩＝1∶1∶1，栽好后浇透定根水，先期用塑料薄膜覆盖保湿，视苗生长状况进行及时通风以防过湿霉变，待试管苗长出新叶后，揭膜粗放管理，移栽成苗率达90％以上。
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