CN101133717B - 西伯利亚百合脱毒试管苗鳞片高效再生鳞茎方法 - Google Patents

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Abstract

一种西伯利亚百合脱毒试管苗鳞片高效再生鳞茎方法，其特征是选取1～1.5cm直径的试管鳞茎，剥取外侧1～3层鳞片，在无菌条件下用锋利的刀具将鳞片纵向切为厚度1～2mm的薄片，接种于诱导培养基上诱导不定芽的发生。当不定芽长到2～3cm高时再转入养鳞茎培养基培养，当鳞茎直径达到1.5～2.0cm时，分别进行冷库培养、常温炼苗后即可移栽入珍珠岩和草炭土基质中进行常规育苗。

Description

西伯利亚百合脱毒试管苗鳞片高效再生鳞茎方法
一、技术领域
本发明属生物科学中的组织培养技术领域，具体涉及一种百合试管苗鳞片高效再生试管微型鳞茎技术。
二、背景技术
百合是世界五大鲜切花之一，不仅花姿优美，色彩丰富，气味芬芳，而且其鳞茎还具有食用和药用价值。因此，近年来对百合的研究日趋深入和广泛，特别是在组织培养及快速繁殖方面已走向了成熟化和工业化。西伯利亚百合(Siberia)属于东方百合杂种系，是近年国内外花卉市场热销的百合品种之一。
传统的百合繁殖方法主要采用常规分球、分珠芽、鳞片扦插、鳞片包埋等。采用这些方法进行繁殖，繁殖系数较小，特别是经多代繁殖以后，常造成种性退化，甚至病毒积累，影响百合的产量和品质。
组织培养技术能够迅速去除病毒和更新品种，加快繁殖速度、缩短育种周期。百合的组织培养使用最多的外植体是鳞片。百合鳞片作为外植体具有容易获得，分化能力强，对培养基要求不高等优点，是目前百合组织培养中普遍采用的外植体。自1982年陈为民、黄济明分别采用百合鳞片作为外植体成功诱导产生了百合的再生植株以来，国内外关于百合鳞片组织培养的报道较多，主要是通过调节激素的配比来诱导其组织分化并再生植株，但未见研究鳞片纵切片不定芽状微型鳞茎分化的报道。
三、发明内容
本发明的目的是寻找更好的百合组织培养新材料和有针对性的组织培养新方法，使西伯利亚百合试管苗鳞片高效再生不定芽状微型鳞茎，为该品种的组培快繁及产业化、转基因研究等提供技术基础。
研究发现，百合鳞茎不同部位的鳞片，分化不定芽的能力有差异，从强到弱依次为：外层>中层>内层。鳞片不同部位切段的不定芽分化速率和数量也存在差异，依次为：鳞片基部>中部>上部。
本发明的技术解决方案为：一种西伯利亚百合脱毒试管苗鳞片高效再生鳞茎方法，其特征是该方法包括以下步骤：
a.将西伯利亚百合试管苗置于养鳞茎培养基上培养约1.5个月，培养温度25±2℃，光照20001ux，光照时间12小时/天；
b.选取1～1.5cm直径的试管鳞茎，剥取外侧1～3层鳞片，在无菌条件下用锋利的刀具将鳞片纵向切为厚度1～2mm的薄片，接种于诱导培养基上诱导不定芽(微型鳞茎)的发生；培养温度25±2℃，光照20001ux，光照时间12小时/天；培养15天后可见不定芽状小鳞茎的发生；
c.不定芽状微型鳞茎2～3cm高时，转接入养鳞茎培养基培养，培养温度25±2℃，光照20001ux，光照时间12小时/天；
d.鳞茎直径达到1.5～2.0cm时，移入2～4℃的冷库中培养30～50天；
e.打开瓶口在大棚中常温炼苗3～5天，自来水洗净根系上的培养基，移栽入珍珠岩和草炭土比例为1：3的移栽基质中自然生长育苗。
18天后可见地上茎抽出地面。植株生长健壮，且整齐一致。
上述方法中：养鳞茎(俗称养球，指在组织培养条件下，使微型鳞茎和小鳞茎直径迅速增大的培养过程。其中，直径0.5cm以下定义为微型鳞茎，0.5以上定义为小鳞茎)培养基配方为：MS培养基添加蔗糖80～100g/L。
附MS培养基(Murashing and Skoog medium)标准配方：
NH4NO3                 1650mg/l
KNO3                   1900mg/l
CaCl2·2H2O             440mg/l
MgSO4·7H2O            370mg/l
KH2PO4                 170mg/l
KI                     0.83mg/l
H3BO3                  6.2mg/l
MnSO4·H2O             16.9mg/l
ZnSO4·7H2O            8.6mg/l
Na2MoO4·2H2O          0.25mg/l
CuSO4·5H2O            0.025mg/l
CoCl2·6H2O            0.025mg/l
FeSO4·7H2O            27.8mg/l
Na2-EDTA               37.3mg/l
肌醇                   100mg/l
烟酸                   0.5mg/l
盐酸硫胺素             0.1mg/l
盐酸吡哆醇             0.5mg/l
甘氨酸                 2mg/l
诱导培养基为：MS+2，4-D0.5mg/L+TDZ0.006mg/L+蔗糖30g/L；
在步骤(c)中，不定芽状微型鳞茎首次转接入养鳞茎培养基时，应在无菌条件下剪去上部约2/3的叶片，第二次养鳞茎时在无菌条件下，将完整小鳞茎取出，切除周围杂乱组织和叶片，接种到养鳞茎培养基。
本发明与现有技术相比，其显著优点是极大的提高了试管鳞片的再生微型鳞茎的效率和繁殖系数，为快速繁殖百合试管微型鳞茎和转基因研究提供了技术基础。
四、附图说明
图1剥取鳞片的鳞茎；
图2接种在诱导培养基上的鳞片纵向切片；
图3鳞片纵向的分化效果；
图4箭头所指处为养鳞茎之前的不定芽状微型鳞茎；
图5进入冷库的试管鳞茎；
图6TDZ不浓度对鳞片纵切片分化不定芽状微型鳞茎的影响曲线。
五、具体实施方式
实施例1：
选取1～1.5cm直径的试管鳞茎，剥取外侧1～3层鳞片，在无菌条件下用锋利的刀具将鳞片纵向切为厚度1～2mm的薄片，每个鳞片平均可得到6～8片鳞片纵切片，切片形状参见附图2。
实施例2：
诱导培养基中，2，4-D添加浓度对鳞片纵切片分化不定芽状微型鳞茎的影响见表1。
表1 2，4-D浓度对鳞片纵切片分化不定芽状微型鳞茎的影响
鳞片纵切片接种于诱导培养基上五天开始逐渐转绿。十天可见基部有芽点出现，近轴面与远轴面表皮轻微愈伤化。十二天时轻微愈伤化的表皮有出现芽点，十五天形成完整不定芽状微型鳞茎。表1说明TDZ用量在0.005mg/L时随2，4-D用量加大平均不定芽状微型鳞茎数增加，在0.5mg/L时最大，随后逐渐降低。不定芽状微型鳞茎发生频率与2，4-D用量没有太大关联。确定0.5mg/L2，4-D为鳞片纵切片不定芽状微型鳞茎诱导的最佳用量。
实施例3：
诱导培养基中，TDZ不同浓度对鳞片纵切片分化不定芽状微型鳞茎的影响见表2和附图6。
表2 TDZ不浓度对鳞片纵切片分化不定芽状微型鳞茎的影响
Figure S071D0821720070913D000032
Figure S071D0821720070913D000041
对TDZ使用浓度测试表明：在TDZ用量为0.002mg/L时平均不定芽状微型鳞茎数达到最高，但总不定芽状微型鳞茎数量少，发生频率降低。TDZ用量为0.006mg/L时虽然平均不定芽状微型鳞茎数略低于0.002mg/L，但是不定芽状微型鳞茎总数高于0.002mg/L，发生频率可以达到100％。所以确定0.006mg/L TDZ为鳞片纵切片不定芽状微型鳞茎诱导的最佳用量。
采用本发明提供的的方法，极大的提高了试管鳞片的再生微型鳞茎的效率和繁殖系数，为快速繁殖百合试管微型鳞茎和转基因研究提供了技术基础。

Claims (2)

1.一种西伯利亚百合脱毒试管苗鳞片高效再生鳞茎方法，用MS培养基添加蔗糖80～100g/L作为养鳞茎培养基，用MS培养基添加2，4-D 0.1～1.2mg/L+TDZ 0.001～0.05mg/L+蔗糖30g/L作为诱导培养基，其特征是该方法包括以下步骤：
a.将西伯利亚百合试管苗置于养鳞茎培养基上培养1.5个月，培养温度25±2℃，光照2000lux，光照时间12小时/天；
b.选取1～1.5cm直径的试管鳞茎，剥取外侧1～3层鳞片，在无菌条件下用锋利的刀具将鳞片纵向切为厚度1～2mm的薄片，接种于诱导培养基上诱导不定芽状微型鳞茎发生；培养温度25±2℃，光照2000lux，光照时间12小时/天；
c.不定芽状微型鳞茎叶片2～3cm高时，转接入养鳞茎培养基培养，培养温度25±2℃，光照2000lux，光照时间12小时/天；
d.鳞茎直径达到1.5～2.0cm时，移入2～4℃的冷库中培养30～50天；
e.打开瓶口在大棚中常温炼苗3～5天，自来水洗净根系上的培养基，移栽入珍珠岩和草炭土比例为1∶3的移栽基质中自然生长育苗。
2.如权利要求1所述的西伯利亚百合脱毒试管苗鳞片高效再生鳞茎方法，其特征是诱导培养基的最佳配方为：MS+2，4-D 0.5mg/L+TDZ 0.006mg/L+蔗糖30g/L。
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