CN103314863B - 一种高效获得郁金香愈伤组织的方法 - Google Patents

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本发明公开了高效获得郁金香愈伤组织的方法，包括外植体选择、外植体消毒灭菌、外植体脱分化培养以及愈伤组织保存，其特征在于：所述外植体选择包括将选用的外植体置于5℃下低温保存1小时；所述脱分化过程采用蓝光照射；所述外植体脱分化培养和愈伤组织保存中所用的培养基，其中生长素类物质和细胞分裂素类物质浓度比均为1:1。本发明解决了郁金香在脱分化形成愈伤组织过程中，易生根、易分化，愈伤组织较难保存等问题。

Description

一种高效获得郁金香愈伤组织的方法
技术领域
本发明涉及一种郁金香组织培养的方法，具体涉及一种高效获得郁金香愈伤组织的方法。
背景介绍
郁金香原产地中海南北沿岸及中亚细亚和伊朗、土耳其、东至中国的东北地区等地，其为百合科郁金香球根花卉。目前全世界约有2000多种郁金香品种，被大量生产的大约只有150种左右。由于郁金香的花色优美、高雅脱俗、清新隽永，令人百看而不厌，深受人们的厚爱，被视为园林观赏花卉的首选。传统苗圃工艺常采用分球繁殖法进行繁殖，增殖速度较慢，且易受病毒、病害等因素影响，其品质退化和死亡现象非常严重。人们逐渐采用组织培养法繁殖郁金香，运用该方法培育的郁金香不仅能够保持品种的优良性状外，其繁殖系数比传统方法高出20倍左右，且生长速度快等，该方法越来越多地被运用到郁金香的培育过程中。但由于郁金香在脱分化形成愈伤组织过程中，一直存在易生根、易分化，愈伤组织较难保存等问题。因此需要寻求一种能高效脱分化培育郁金香愈伤组织和愈伤组织保存的方法。
发明内容
本发明的目的是针对郁金香在脱分化形成愈伤组织过程中，易生根、易分化，愈伤组织较难保存等问题，提供了一种能高效脱分化培育郁金香愈伤组织和愈伤组织保存的方法。
为达到上述目的，本发明采取的技术方案为：高效获得郁金香愈伤组织的方法，包括外植体选择、外植体消毒灭菌、外植体脱分化培养以及愈伤组织保存，其特征在于：所述外植体选择包括将选用的外植体置于5℃下低温保存1小时；所述脱分化过程采用蓝光照射；所述外植体脱分化培养和愈伤组织保存中所用的培养基，其中生长素类物质和细胞分裂素类物质浓度比均为1:1。
进一步，本发明所述的的高效获得郁金香愈伤组织的方法，具体步骤如下：
1）外植体选择
直接采摘野外或者公园种植的3-7个月间的生长强壮的郁金香，取其新生的叶尖、根尖或者茎尖作为外植体的选材，并将选用的外植体置于5℃下低温保存1小时；叶尖、根尖或者茎尖这些生长旺盛的组织，具有很好的细胞全能性，且容易获得；
2）外植体消毒灭菌
将经过低温保存的外植体自然升温至室温，然后首先经过重量比为0.1%的升汞中消毒4分钟，再浸泡在体积比为75%的酒精中灭菌13秒，取出后用无菌水反复冲洗3次，每次3分钟；
3）外植体脱分化培养
将消毒灭菌处理后的外植体从无菌水中取出，放在洁净无菌的一次性培养皿中，用灼烧灭菌后的刀片将外植体切成大小均为1mm2的小碎片，并将小碎片移入到灭菌后的培养基中，然后繁殖在人工气候箱中进行脱分化培养，具体培养条件：温度设定为27℃，相对湿度设定为80%，采用蓝光进行照射，光照强度设置为300lux，光照12h/d，处理8-12天后，形成愈伤组织；
4）愈伤组织保存
将步骤3）脱分化培育出的愈伤组织切成1mm2大小的小块，接种到愈伤组织保存培养基MB培养基中培养，具体培养条件：温度设定为27℃，相对湿度设定为80%，采用蓝光进行照射，光照强度设置为350lux，光照12h/d，每隔45天转接一次继续传代培养，传代培养所用的培养基同样为MB培养基。
进一步地，所述的脱分化培养所用的培养基为MT培养基，其配方及配制方法为(mg/L)：NH4NO3为780，KNO3为1000，CaCl2·2H2O为350，MgSO4·7H2O为370，KH2PO4为175，KI为0.83，H3BO3为6.2，MnSO4·4H2O为22.3，ZnSO4·7H2O为8.6，Na2MnO4·2H2O为0.25，CuSO4·5H2O为0.023，CoCl2·6H2O为0.023，FeSO4·7H2O为28.1，Na2-EDTA·2H2O为37.3，肌醇200，烟酸0.5，盐酸吡哆醇0.3，盐酸硫胺素0.1，维生素B6为0.5，维生素B1为0.1，甘氨酸2.0，生长素类物质1.0-2.5mg/L，细胞分裂素类物质1.0-2.5mg/L，蔗糖25g/L，琼脂条10g/L，pH6.6；
称取上述重量的培养基配方，进行溶解，然后移入到组培瓶中，每瓶装大约50ml，然后进行高压蒸汽灭菌处理，待用。
进一步地，所述的MB培养基配方为(mg/L)：NH4NO3为1500，KNO3为2000，CaCl2·2H2O为440，MgSO4·7H2O为370，KH2PO4为170，KI为0.83，H3BO3为6.2，MnSO4·4H2O为22.3，ZnSO4·7H2O为8.6，Na2MnO4·2H2O为0.25，CuSO4·5H2O为0.025，CoCl2·6H2O为0.025，FeSO4·7H2O为27.8，Na2-EDTA·2H2O为37.3，肌醇100，烟酸0.5，维生素B60.5，维生素B1为0.1，甘氨酸2.0，生长素类物质0.5-1.5mg/L，细胞分裂素类物质0.5-1.5mg/L，蔗糖30g/L，琼脂条10g/L，pH6.6。
进一步地，所述生长素类物质为吲哚乙酸、吲哚丙酸、吲哚丁酸，萘乙酸、萘乙酸钠、萘氧乙酸、萘乙酰胺、2,4-D、2,4,5-T、4-碘苯氧乙酸或2,4-D丁酯中的至少三种以上的组合。其中，所述的2,4-D即2,4-二氯苯氧乙酸，所述的2,4,5-T即2,4,5三氯苯酚代乙酸，2,4-D丁酯为2，4-二氯苯氧乙酸丁酯。优选地：MT培养基中所述生长素类物质为萘乙酸0.5mg/L，6-苄氨基嘌呤0.5mg/L和2,4-D1.0mg/L的混合；MB培养基中所述生长素类物质为萘乙酸0.3mg/L，6-苄氨基嘌呤0.3mg/L和2,4-D0.6mg/L的混合。
进一步地，所述细胞分裂素类物质为玉米素、还有玉米素核苷、二氢玉米素、异戊烯基腺嘌呤、激动素、6-苄基腺嘌呤、四氢吡喃苄基腺嘌呤、二苯脲或KT-30中的至少三种以上的组合。其中KT-30的化学名为1-(2-氯-4-吡啶基)-3’-苯基脲。优选地，MT培养基中所述细胞分裂素类物质为：四氢吡喃苄基腺嘌呤0.7mg/L，6-苄基腺嘌0.7mg/L和KT-30为0.6mg/L的混合物；MB培养基中所述细胞分裂素类物质为：四氢吡喃苄基腺嘌呤0.2mg/L，6-苄基腺嘌0.3mg/L和KT-30为0.7mg/L的混合物。
本发明所述的一种高效获得郁金香愈伤组织的方法，与现有技术相比其有益效果为：1、通过升汞和70%-75%酒精联合使用，能够有效对外植体进行消毒处理，减少因细菌病毒侵害导致的试验失败，提高实验成功率；2、外植体经过低温处理，并且脱分化是采用蓝光照射，大大缩短了愈伤组织形成时间，并提高了愈伤组织成功率；3、设计了一种郁金香诱导脱分化培养基，通过改变生长素种类以及细胞分裂素的种类组合和浓度配比，将脱分化培养基中的生长素类物质和细胞分裂素类物质比例调为1:1，可以有效避免愈伤组织褐化、生根等现象，有效地提高了愈伤组织形成的成功率；4、通过对愈伤组织进行分切处理形成大小为1mm2的小碎片，并将碎片移入到愈伤组织保存培养基中，不仅能够起到保存愈伤组织的作用，同时还能使愈伤组织在培育过程中薄壁细胞不断地进行分裂，愈伤组织不断地生长；5、通过改变愈伤组织保存培养基中的生长素类物质和细胞分裂素物质的含量，能够有效避免愈伤组织出现易生根、易分化，愈伤组织较难保存等问题，大大提高愈伤组织的繁殖系数；6、通过改变诱导培养郁金香外植体和愈伤组织保存的培养条件，能够有效获得愈伤组织和保存愈伤组织；7、通过对郁金香愈伤组织进行传代培养，在再分化培养过程中省去了外植体选择、脱分化培养等流程，能够明显缩短郁金香组织培养培育周期，提高郁金香的繁殖系数，同时获得性状优良的郁金香幼苗。本发明所述的方法，诱导愈伤组织成功率基本保持在95%以上。
具体实施方式
以下结合具体实施方式，对本发明进行详细说明。
实施例1
一种高效获得郁金香愈伤组织的方法，具体步骤如下：
1）外植体选择
直接采摘野外或者公园种植的3-7个月间的生长强壮的郁金香，取其新生的叶尖、根尖或者茎尖作为外植体的选材，并将选用的外植体置于5℃下低温保存1小时；叶尖、根尖或者茎尖这些生长旺盛的组织，具有很好的细胞全能性，且容易获得；
2）外植体消毒灭菌
将经过低温保存的外植体自然升温至室温，然后首先经过重量比为0.1%的升汞中消毒4分钟，再浸泡在体积比为75%的酒精中灭菌13秒，取出后用无菌水反复冲洗3次，每次3分钟；
3）外植体脱分化培养
将消毒灭菌处理后的外植体从无菌水中取出，放在洁净无菌的一次性培养皿中，用灼烧灭菌后的刀片将外植体切成大小均为1mm2的小碎片，并将小碎片移入到灭菌后的培养基中，然后繁殖在人工气候箱中进行脱分化培养，具体培养条件：温度设定为27℃，相对湿度设定为80%，采用蓝光进行照射，光照强度设置为300lux，光照12h/d，处理8天后，形成愈伤组织；
4）愈伤组织保存
将步骤3）脱分化培育出的愈伤组织切成1mm2大小的小块，接种到愈伤组织保存培养基MB培养基中培养，具体培养条件：温度设定为27℃，相对湿度设定为80%，采用蓝光进行照射，光照强度设置为350lux，光照12h/d，每隔45天转接一次继续传代培养，传代培养所用的培养基同样为MB培养基。
其中：所述的脱分化培养所用的培养基为MT培养基，其配方及配制方法为(mg/L)：NH4NO3为780，KNO3为1000，CaCl2·2H2O为350，MgSO4·7H2O为370，KH2PO4为175，KI为0.83，H3BO3为6.2，MnSO4·4H2O为22.3，ZnSO4·7H2O为8.6，Na2MnO4·2H2O为0.25，CuSO4·5H2O为0.023，CoCl2·6H2O为0.023，FeSO4·7H2O为28.1，Na2-EDTA·2H2O为37.3，肌醇200，烟酸0.5，盐酸吡哆醇0.3，盐酸硫胺素0.1，维生素B6为0.5，维生素B1为0.1，甘氨酸2.0，萘乙酸0.5mg/L，6-苄氨基嘌呤0.5mg/L，2,4-D1.0mg/L，四氢吡喃苄基腺嘌呤0.7mg/L，6-苄基腺嘌0.7mg/L，KT-30为0.6mg/L，蔗糖25g/L，琼脂条10g/L，pH6.6；
称取上述重量的培养基配方，进行溶解，然后移入到组培瓶中，每瓶装大约50ml，然后进行高压蒸汽灭菌处理，待用。
进一步地，所述的MB培养基配方为(mg/L)：NH4NO3为1500，KNO3为2000，CaCl2·2H2O为440，MgSO4·7H2O为370，KH2PO4为170，KI为0.83，H3BO3为6.2，MnSO4·4H2O为22.3，ZnSO4·7H2O为8.6，Na2MnO4·2H2O为0.25，CuSO4·5H2O为0.025，CoCl2·6H2O为0.025，FeSO4·7H2O为27.8，Na2-EDTA·2H2O为37.3，肌醇100，烟酸0.5，维生素B60.5，维生素B1为0.1，甘氨酸2.0，萘乙酸0.3mg/L，6-苄氨基嘌呤0.3mg/L，2,4-D0.6mg/L，四氢吡喃苄基腺嘌呤0.2mg/L，6-苄基腺嘌0.3mg/L，KT-30为0.7mg/L，蔗糖30g/L，琼脂条10g/L，pH6.6。
实施例2
实施例2与实施例1的不同在于：所述的MT培养基中所述生长素类物质为萘乙酰胺0.4mg/L，吲哚丁酸0.6mg/L和2,4-D1.0mg/L的混合；MB培养基中所述生长素类物质为2,4,5-T0.4mg/L，6-苄氨基嘌呤0.3mg/L和2,4-D丁酯0.5mg/L的混合。
实施例3
实施例3与实施例1的不同在于：所述的MT培养基中所述细胞分裂素类物质为：二氢玉米素0.6mg/L，激动素0.7mg/L和二苯脲0.7mg/L的混合物；MB培养基中所述细胞分裂素类物质为：玉米素核苷0.4mg/L，6-苄基腺嘌0.5mg/L和激动素0.3mg/L的混合物。
采用实施例1-3所述的高效获得郁金香愈伤组织的方法，重复试验，最终对愈伤组织形成的情况统计如表1所示。
表1愈伤组织形成情况统计
通过上表可得，本发明所述的高效获得郁金香愈伤组织的方法，与现有技术相比，将脱分化培养基中的生长素类物质和细胞分裂素类物质比例调为1:1，可以有效避免愈伤组织褐化、生根等现象；且通过改变生长素种类以及细胞分裂素的种类组合和浓度配比，能够有效地提高了愈伤组织形成的成功率，诱导愈伤组织成功率基本保持在95%以上。

Claims (1)

1.一种高效获得郁金香愈伤组织的方法，包括外植体选择、外植体消毒灭菌、外植体脱分化培养以及愈伤组织保存，其特征在于：所述外植体选择包括将选用的外植体置于5℃下低温保存1小时；所述外植体脱分化培养过程采用蓝光照射；所述外植体脱分化培养和愈伤组织保存中所用的培养基，其中包含生长素类物质和细胞分裂素类物质，且二者的浓度比均为1:1；其具体步骤如下：
1)外植体选择
直接采摘野外或者公园种植的3-7个月间的生长强壮的郁金香，取其新生的叶尖、根尖或者茎尖作为外植体的选材，并将选用的外植体置于5℃下低温保存1小时；
2)外植体消毒灭菌
将经过低温保存的外植体自然升温至室温，然后首先经过重量比为0.1%的升汞中消毒4分钟，再浸泡在体积比为75%的酒精中灭菌13秒，取出后用无菌水反复冲洗3次，每次3分钟；
3)外植体脱分化培养
将消毒灭菌处理后的外植体从无菌水中取出，放在洁净无菌的一次性培养皿中，用灼烧灭菌后的刀片将外植体切成大小均为1mm2的小碎片，并将小碎片移入到灭菌后的培养基中，然后繁殖在人工气候箱中进行脱分化培养，具体培养条件：温度设定为27℃，相对湿度设定为80%，采用蓝光进行照射，光照强度设置为300lux，光照12h/d，处理8-12天后，形成愈伤组织；
4)愈伤组织保存
将步骤3）脱分化培育出的愈伤组织切成1mm2大小的小块，接种到愈伤组织保存培养基，即MB培养基中进行保存培养，具体培养条件为：温度设定为27℃，相对湿度设定为80%，光照强度设置为350lux，光照12h/d，每隔45天转接一次，继续进行传代培养，传代培养所用的培养基同样为MB培养基;
所述的脱分化培养所用的培养基为MT培养基，其配方及配制方法为：NH4NO3为780mg/L，KNO3为1000mg/L，CaCl2·2H2O为350mg/L，MgSO4·7H2O为370mg/L，KH2PO4为175mg/L，KI为0.83mg/L，H3BO3为6.2mg/L，MnSO4·4H2O为22.3mg/L，ZnSO4·7H2O为8.6mg/L，Na2MnO4·2H2O为0.25mg/L，CuSO4·5H2O为0.023mg/L，CoCl2·6H2O为0.023mg/L，FeSO4·7H2O为28.1mg/L，Na2-EDTA·2H2O为37.3mg/L，肌醇200mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸吡哆醇0.3mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，维生素B6为0.5mg/L，维生素B1为0.1mg/L，甘氨酸2.0mg/L，生长素类物质1.0-2.5mg/L，细胞分裂素类物质1.0-2.5mg/L，蔗糖25g/L，琼脂条10g/L，pH为6.6；
称取上述重量的培养基配方，先将琼脂条和蔗糖进行加热溶解，再将其他物质加入，溶解混匀，然后移入到组培瓶中，每个组培瓶装50ml，然后进行统一的高压蒸汽灭菌处理，待用;
所述的MB培养基配方为：NH4NO3为1500mg/L，KNO3为2000mg/L，CaCl2·2H2O为440mg/L，MgSO4·7H2O为370mg/L，KH2PO4为170mg/L，KI为0.83mg/L，H3BO3为6.2mg/L，MnSO4·4H2O为22.3mg/L，ZnSO4·7H2O为8.6mg/L，Na2MnO4·2H2O为0.25mg/L，CuSO4·5H2O为0.025mg/L，CoCl2·6H2O为0.025mg/L，FeSO4·7H2O为27.8mg/L，Na2-EDTA·2H2O为37.3mg/L，肌醇100mg/L，烟酸0.5mg/L，维生素B60.5mg/L，维生素B1为0.1mg/L，甘氨酸2.0mg/L，生长素类物质0.5-1.5mg/L，细胞分裂素类物质0.5-1.5mg/L，蔗糖30g/L，琼脂条10g/L，pH为6.6。
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