CN105454043B - 竹节树的组织培养脱毒快繁方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了竹节树的组织培养脱毒快繁方法，经过竹节树材料前处理、竹节树材料选择处理、消毒过程、脱毒和脱污染过程、生根培养、温室驯化等过程即可。且在脱毒和脱污染过程中分别使用初代培养基、茎尖脱毒培养基、继代培养基、生根培养基对竹节树材料进行培养，使用改良MS培养基：大量元素中NH₄NO₃的浓度为1500mg/L，琼脂粉6g/L；pH5.8~6.0，使脱毒快繁能得以实现，速度快，繁殖系数大，继代周期约40天，生根周期约25天，可获得无毒苗，采用无性繁殖技术，其后代整齐一致，能很好保持母本的优良性状，经济效益高。

Description

竹节树的组织培养脱毒快繁方法

技术领域

本发明涉及植物脱毒快繁领域，具体是竹节树的组织培养脱毒快繁方法。

背景技术

竹节树属红树科,属高大乔木常绿树种,又名胭脂果,树高,干直,木材坚固,有光泽,纹理细致,易施工,是家具、装饰雕刻和小建筑物的良好用材；因其叶密，发芽多，耐旱、瘠，不仅可以在严重污染条件下成活，还能够适应恶劣的土壤环境，并达到净化环境的目的。对大气污染物尤其是SO₂,FH气体的抗性等级达到一级，竹节树因此而被誉为“绿色金刚” ，是理想的园林新优观赏和良好抗污染珍贵树种，树皮供药用,可治疟疾，是国家二级保护树种。

但竹节树繁育难度大，最常用种子育苗的方法，种子收集难度大，成熟度不整齐，繁殖速度慢，育苗周期长。且实生播种变异率高，很难保持母本优良性状。这种滞后的生产方式极难满足市场需求，相关的资料报道也极少。竹节树无性繁殖方面的育苗技术仍未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供质量高、保持母本优良性状的竹节树的组织培养脱毒快繁方法,以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

竹节树的组织培养脱毒快繁方法，具体步骤包括：

1）竹节树材料前处理：将竹节树材料移栽到花盆里，放入温室，栽培基质用经过消毒的泥炭土和珍珠岩；然后对竹节树材料新梢全部短剪处理，并用洁净的自来水、均衡肥加500倍的多菌灵乳液制成肥水浇灌竹节树材料，浇灌次数视天气变化和基质湿度而定；

2）竹节树材料选择处理：待新芽长到1.4-1.6cm时，取表面光滑、生长粗、无病虫害的新芽，用消毒过的剪刀将其两侧叶片至叶柄处剪掉，并将新芽段剪下放入干净容器内迅速带入组培室进行消毒处理，且整个过程只有剪刀与截取的竹节树材料接触；

3）消毒过程：将竹节树材料上滴两滴洗洁精，加蒸馏水震荡10分钟，然后用蒸馏水将泡沫洗净放入超净工作台；先用75%的酒精处理15秒，再用双蒸水清洗两次；再用0.5%次氯酸钠浸泡30分钟，每10分钟顺时针摇动一次，每次摇动1分钟，摇动后静置促使其内生菌缓慢渗出，处理完后再用双蒸水清洗两次，每次不少于3分钟；再用0.1%的氯化汞溶液顺时针摇动10分钟，然后用双蒸水清洗两次，再用0.05%的氯化汞溶液浸泡30分钟，处理过程同次氯酸钠，处理完后用双蒸水洗4次，用无菌滤纸吸干竹节树材料上水珠，将竹节树材料剪口切去0.4-0.6cm接种到初代培养基上；

4）脱毒和脱污染过程：经过14-16天的培养，菌类高发期过后待竹节树材料污染情况稳定时，挑选细菌比较少的竹节树材料，切掉与培养基接触的部分，重新接种到同样的初代培养基上，以后每隔3天换一次培养基；连续换3次后，部分竹节树材料内生菌基本脱除，将这些竹节树材料的茎尖切下2-3mm，接种到茎尖脱毒培养基上，等到分化出的芽点长到1cm长的茎段时，将这些芽从基部切下，接种到继代培养基上使其继续分化扩繁；

5）竹节树的生根培养：待分化的新芽长到1.5cm-2cm时，将其接种到生根培养基中，先暗培养一周后，再进行照光培养，18-22天开始生根，每株2-4条根，待根系长到1cm长时，将瓶苗移入炼苗温室，进行驯化培养；

6）温室驯化：该过程要经过闭瓶炼苗7天，开瓶炼苗3天，然后将生根小苗分级用1000倍的多菌灵溶液浸泡3~5分钟，捞出晾干水分，栽到72孔穴盘中，浇透水，再用1000倍多菌灵液喷洒一次，将空气湿度控制在90%以上；2周后开始长出新叶，58-62天后小苗长到9-11cm或8片叶以上，炼苗结束，即能移栽到大田进行正常的田间水肥管理；

所述初代培养基：3/4改良MS培养基附加6-苄氨基腺嘌呤2.0mg/L和萘乙酸0.05mg/L；

所述茎尖脱毒培养基：3/4改良MS培养基附加6-苄氨基腺嘌呤1.5mg/L和萘乙酸0.1mg/L；

所述继代培养基：3/4改良MS培养基附加6-苄氨基腺嘌呤1.2mg/L和萘乙酸0.05mg/L；

所述生根培养基：1/2改良MS培养基附加吲哚丁酸7mg/L，另外蔗糖调整为20g/L；

其中，所述改良MS培养基中大量元素的NH₄NO₃的浓度为1500mg/L，琼脂粉6g/L，其余成分与浓度不变；pH5.8~6.0。

作为本发明进一步的方案：培养环境条件：25℃±2℃，光照时间为14h/d，光强为1500lx~2000lx。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1.在材料处理上和培养及配方的设计上都进行了精心设计和改良调整，才使脱毒快繁能得以实现：

材料内生菌特别多，初培污染几乎100%。继代过程中材料基部易木栓化而死亡。两个条件都导致了竹节树组培苗无法按照常规的组织培养方法继续进行下去。经过多次反复的实验，对前处理的调控，反复脱污染结合茎尖脱毒才获得了无菌芽苗；基本培养基也经过多次试验调整改良后才使得竹节树的组织培养得以继续进行。

2.速度快，繁殖系数大，继代周期约40天，生根周期约25天：

用试管快繁技术繁殖，可节约繁殖材料，只取原材料上的一小块组织茎段就能在短期内生产出大量市场所需的优质苗木，每年可以繁殖出几万甚至数百万的小植株，既不损伤原材料又可获得较高的经济效益。

3.可获得无毒苗：

采用了茎尖脱毒技术，除去竹节树材料带有的绝大部分病毒、真菌和细菌，使植株生长势强、抗逆能力提高，生产的竹节树苗木生长整齐，树形好，观赏价值高，生长速度快；

4.可实现周年工厂化生产：

试管快繁是在人工控制的条件下进行的集约化生产，不受自然界季节性气候变化和恶劣天气的影响。从取材→接种→培养→生根→移栽，可以全年进行连续生产，可人为控制调整其扩繁分化数量，生产效率高。

5.本技术采用无性繁殖技术，其后代整齐一致，能很好保持母本的优良性状：

试管繁殖是一种微型的无性繁殖，它取材于同一个体的体细胞而不是性细胞，因此其后代遗传性非常一致，能保持原有品种的优良性状。对保质、保纯有着特殊作用。可获得大量的统一规格、高质量的苗木，苗木商品性好。

6.经济效益高：

由于竹节树组培苗的快速繁殖在培养瓶中生长，立体摆放，所需要的空间小，节省土地。生产可按一定的程序严格执行, 生产过程可以微型化、精密化，能最大限度发挥人力、物力和财力,取得很高的生产效率，如在一个200平方米的培养室内一年可生产试管苗上百万株。如按每株1元计算，每年产值上百万元。

附图说明

图1是本发明的工艺流程图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一、操作过程

请参阅图1，本发明实施例中，竹节树的组织培养脱毒快繁方法，

1.培养基配制：

1-1.母液配制：MS培养基的成分及比例是本领域普通技术人员所熟知的，包括硝酸钾，氯化钙，维生素等19种成分，附加的BA、NAA和IBA 也是本领域公知产品，均严格按说明要求配制即可。

1-2.培养基的配制：根据母液配比的扩大倍数，结合所需配制培养基的数量，量取相应数量的母液；待装有相应数量琼脂粉和糖的蒸馏水溶液加热全部融化后，将取好的母液加入其中，定溶后搅拌均匀，将pH值调到5.8~6.0准备分装。

1-3.分装:将配制好的培养基分装到200mL的培养容器中，每瓶分装约40mL，盖好盖。

1-4.灭菌：将分装好的培养瓶放入高压锅，在125℃下灭菌20分钟，冷却后即可使用。注意高压锅需专业人员操作。

配制的基本培养基为改良MS培养基：将MS大量元素中NH₄NO₃的浓度由原来的1650mg/L调整为1500mg/L，琼脂粉6g/L；蔗糖30g/L，pH5.8~6.0。初代培养基：3/4改良MS培养基附加6-苄氨基腺嘌呤2.0mg/L和萘乙酸0.05mg/L。茎尖脱毒培养基：3/4改良MS培养基附加6-苄氨基腺嘌呤1.5mg/L和萘乙酸0.1mg/L；增殖系数为3左右。继代培养基：3/4改良MS培养基附加6-苄氨基腺嘌呤1.2mg/L和萘乙酸0.05mg/L；分化系数2.5。生根培养基：1/2改良MS培养基附加吲哚丁酸7mg/L，另外蔗糖调整为20g/L；生根率为78%。其中3/4改良MS培养基是大量元素用量的3/4的改良MS培养基；1/2改良MS培养基是大量元素用量的1/2的改良MS培养基。

2.外植体进入

2-1.竹节树材料前处理：将竹节树材料移栽到花盆里，放入温室，栽培基质用经过消毒泥炭土和珍珠岩；然后对竹节树材料新梢全部短剪处理，并用洁净的自来水挑好的均衡肥加500倍的多菌灵乳液的肥水浇灌材料，浇灌次数视天气变化和基质湿度而定，加强水肥管理，尽快促使其从摘心后的叶腋间萌发新芽。

2-2.取材：竹节树材料选择处理：待新芽长到1.5cm长度时，取表面光滑，生长粗壮无病虫害的整齐一致新芽，用消毒过的剪刀将其两侧叶片至叶柄处剪掉，并将新芽段剪下放入备好的干净容器内迅速带入组培室进行消毒处理。注意：整个过程只有剪刀与截取的材料接触。

2-3.消毒过程：将竹节树材料上滴两滴洗洁精加蒸馏水不停的左右震荡10分钟，然后用蒸馏水将泡沫洗净放入超净工作台。先用75%的酒精处理15秒，再用双蒸水清洗两次；再用0.5%次氯酸钠浸泡30分钟，每10分钟顺时针摇动一次，每次1分钟后静置促使其内生菌缓慢渗出，处理完后再用双蒸水清洗两次，每次不少于3分钟；再用0.1%的氯化汞溶液顺时针摇动10分钟，还是用双蒸水清洗两次，再用0.05%的氯化汞溶液浸泡30分钟，处理过程同次氯酸钠，处理完后用双蒸水洗4次，用无菌滤纸吸干竹节树材料上水珠，将竹节树材料剪口切去0.5cm左右接种到初代培养基上。

接种时要求操作人员保持个人清洁，操作前对手、工作衣要经75%酒精过表面消毒，操作工具用消毒器具处理后才可使用。分切材料要操作迅速、简捷，材料切好后迅速接种到备好的培养基中，并做好标签记录。

3.脱毒和脱污染过程：经过约15天的培养，菌类高发期过后待竹节树材料污染情况比较稳定时，挑选细菌比较少的材料，切掉与培养基接触的部分，重新接种到同样的初代培养基上，以后每隔3天换一次培养基。连续换3次后，部分竹节树材料内生菌基本脱除，将这些材料的茎尖切下（大小约2-3mm），接种到茎尖脱毒培养基上，让其慢慢生长，等到分化出的芽点长到1cm长的茎段时，将这些芽从基部切下，接种到继代培养基上使其继续分化扩繁。

4.继代扩繁：将脱毒后长出的新芽按照常规方法切分，接种到继代培养基上，放入培养室培养即可。

5.竹节树的生根培养：待分化的新芽长到1.5cm-2cm时，将其接种到生根培养基中，先暗培养一周后在进行照光培养，20天左右开始生根，每株2-4条根，生根率达到80%，待根系长到1cm长时，将瓶苗移入炼苗温室，进行驯化培养。

6.温室驯化：该过程要经过闭瓶炼苗7天，开瓶炼苗3天，然后将生根小苗分级用1000倍的多菌灵溶液浸泡3~5分钟，捞出晾干水分，小心栽到72孔穴盘中，浇透水，再用1000倍多菌灵液喷洒一次，利用智能温室将空气湿度控制在90%以上。2周后开始长出新叶，并加强水肥管理，加强光照，空气湿度逐渐减低，约60天后小苗长到约10cm（8片叶以上），炼苗结束，可移栽到大田进行正常的田间水肥管理。

二、培养环境条件：25℃±2℃，光照时间为14h/d，光强为1500lx~2000lx。

三、各组分配比及配制方法：

基本培养基配方全部来自原MS培养基配方，包括硝酸铵，硝酸钾，等硫酸镁19种试剂组成，还需要细胞分裂素和生长素等植物激素，浓盐酸，氢氧化钠和杀菌液等。试剂和激素等均为分析纯的常规使用试剂。为了便于称量和使用方便，基本培养基试剂均按照常操作规程规配制方法，大量元素配制成50倍，微量元素和有机试剂配制成100倍，激素浓度根据平常需要量的大小配制成1~10g/L的母液备用。配制方法均按照药品说明方法进行配制。

四、杀菌液及其他溶液的配制方法及使用

1.本试验用的体积浓度为75%的酒精消毒液是用取3/4的分析纯酒精加1/4的蒸馏水摇匀配制而成，用于材料表面消毒。

2. 0.5%次氯酸钠溶液是用医用浓度较纯的次氯酸钠原液取0.5mL定容到100mL而成，用于材料表面和深层消毒。

3. 0.1%的氯化汞和0.05%的氯化汞是分别称取0.1g和0.05g的分析纯试剂，用蒸馏水溶解后定容到100mL即可，用于材料表面和深层消毒。

4. 1mol/L氢氧化钠溶液配制，称取4g氢氧化钠用双蒸水溶解，定溶到100mL，用于培养基配制中酸碱滴定。

5. 1mol/L盐酸溶液配制，量取10mL浓盐酸，用双蒸水稀释到100mL，注意浓盐酸有强腐蚀性刺激性气味，配制时要带手套在通风厨下操作，用于培养基配制中酸碱滴定。

本发明采用了组培脱毒快繁育苗技术，通过对竹节树材料的前处理结合组织培养技术和配方的改良达到了无性快繁的目的，进而既满足了市场需求，也节省了育苗成本。本技术有如下特点：

1.培养基配方不仅调整了MS培养基中NH₄NO₃的量，在整个生产的配方中，对改良MS中全部大量元素都做了调整，并且在不同阶段在激素的浓度和搭配上均作了调整，解决了竹节树在继代培养过程中，基部木栓化后材料逐渐死亡致使脱毒快繁中断的难题，进而建立了完整的脱毒快繁体系。

2. 竹节树材料前处理特殊

对竹节树材料种植的基质，水肥管理，生长环境都做了特别处理，并结合了整形修剪技术，这都是处理一般竹节树材料所没有的。这样的处理可以减轻病菌侵染的程度，为初培材料菌类污染的减少奠定了基础。

3.取材手法精细，尽可能的减少了竹节树材料的污染源。

4.消毒方法采用了三种消毒液四个浓度配比多次浸泡，多次长时间清洗的方法，最大限度的降低了初培污染程度。

5.用多次高频率更换培养基和茎尖培养的方式脱除了真菌、细菌和病毒对材料的侵染。

6.茎尖培养过程，不仅使材料脱除病毒和菌类，还使材料更易脱分化，诱导出芽。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (2)

1.竹节树的组织培养脱毒快繁方法，其特征在于，具体步骤包括：

1）竹节树材料前处理：将竹节树材料移栽到花盆里，放入温室，栽培基质用经过消毒的泥炭土和珍珠岩；然后对竹节树材料新梢全部短剪处理，并用洁净的自来水、均衡肥加500倍的多菌灵乳液制成肥水浇灌竹节树材料，浇灌次数视天气变化和基质湿度而定；

2）竹节树材料选择处理：待新芽长到1.4-1.6cm时，取表面光滑、生长粗、无病虫害的新芽，用消毒过的剪刀将其两侧叶片至叶柄处剪掉，并将新芽段剪下放入干净容器内迅速带入组培室进行消毒处理，且整个过程只有剪刀与截取的竹节树材料接触；

3）消毒过程：将竹节树材料上滴两滴洗洁精，加蒸馏水震荡10分钟，然后用蒸馏水将泡沫洗净放入超净工作台；先用75%的酒精处理15秒，再用双蒸水清洗两次；再用0.5%次氯酸钠浸泡30分钟，每10分钟顺时针摇动一次，每次摇动1分钟，摇动后静置促使其内生菌缓慢渗出，处理完后再用双蒸水清洗两次，每次不少于3分钟；再用0.1%的氯化汞溶液顺时针摇动10分钟，然后用双蒸水清洗两次，再用0.05%的氯化汞溶液浸泡30分钟，处理过程同次氯酸钠，处理完后用双蒸水洗4次，用无菌滤纸吸干竹节树材料上水珠，将竹节树材料剪口切去0.4-0.6cm接种到初代培养基上；

4）脱毒和脱污染过程：经过14-16天的培养，菌类高发期过后待竹节树材料污染情况稳定时，挑选细菌比较少的竹节树材料，切掉与培养基接触的部分，重新接种到同样的初代培养基上，以后每隔3天换一次培养基；连续换3次后，部分竹节树材料内生菌基本脱除，将这些竹节树材料的茎尖切下2-3mm，接种到茎尖脱毒培养基上，等到分化出的芽点长到1cm长的茎段时，将这些芽从基部切下，接种到继代培养基上使其继续分化扩繁；

5）竹节树的生根培养：待分化的新芽长到1.5cm-2cm时，将其接种到生根培养基中，先暗培养一周后，再进行照光培养，18-22天开始生根，每株2-4条根，待根系长到1cm长时，将瓶苗移入炼苗温室，进行驯化培养；

6）温室驯化：该过程要经过闭瓶炼苗7天，开瓶炼苗3天，然后将生根小苗分级用1000倍的多菌灵溶液浸泡3~5分钟，捞出晾干水分，栽到72孔穴盘中，浇透水，再用1000倍多菌灵液喷洒一次，将空气湿度控制在90%以上；2周后开始长出新叶，58-62天后小苗长到9-11cm或8片叶以上，炼苗结束，即能移栽到大田进行正常的田间水肥管理；

所述初代培养基：3/4改良MS培养基附加6-苄氨基腺嘌呤2.0mg/L和萘乙酸0.05mg/L；

所述茎尖脱毒培养基：3/4改良MS培养基附加6-苄氨基腺嘌呤1.5mg/L和萘乙酸0.1mg/L；

所述继代培养基：3/4改良MS培养基附加6-苄氨基腺嘌呤1.2mg/L和萘乙酸0.05mg/L；

所述生根培养基：1/2改良MS培养基附加吲哚丁酸7mg/L，另外蔗糖调整为20g/L；

其中3/4改良MS培养基是大量元素用量的3/4的改良MS培养基；1/2改良MS培养基是大量元素用量的1/2的改良MS培养基；

其中，所述改良MS培养基中大量元素的NH₄NO₃的浓度为1500mg/L，琼脂粉6g/L，其余成分与浓度不变；pH5.8~6.0。

2.根据权利要求1所述的竹节树的组织培养脱毒快繁方法，其特征在于，培养的环境条件：25℃±2℃，光照时间为14h/d，光强为1500lx~2000lx。