CN108077071A - 穗花牡荆组织培养用培养基及快速繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种穗花牡荆组织培养用培养基及其快速繁殖方法，该培养基包括芽诱导培养基、增殖培养基和生根培养基；三者采用特定的培养基配方，显著提高了穗花牡荆组培的增殖系数和生根率，从而提高了穗花牡荆的繁殖效率。同时，本发明方法选择穗花牡荆当年生枝条作为外植体材料，其生长旺盛、分生能力强，在进行组织培养过程中不易产生褐变。本发明提高了穗花牡荆的繁殖效率，适应大规模生产的需要。
Description
技术领域
本发明涉及穗花牡荆组织培养用培养基及快速繁殖方法，属于植物组织培养繁殖技术领域。
背景技术
穗花牡荆(Vitex agnus-castus L.)为马鞭草科牡荆属植物，芳香灌木，花期6-9月，原产于地中海地区，我国江苏、上海等地也有栽培。穗花牡荆花朵美丽，是夏季难得的时令花卉，其蓝紫色大型花序在植物造景中不可多得，在园林绿化上也有广泛的用途。穗花牡荆中含多种黄酮类化合物，其果实长期以来一直用于治疗女性疾病，作为药材已被收录于德国Commission E植物药专论中。
穗花牡荆目前主要靠播种或扦插进行繁殖培育，但繁殖率低、生长慢，无法快速高效地满足科研及大规模生产的需要，因此有必要研究一种穗花牡荆的快速繁殖方法。组织培养技术是目前植物快繁最有效的方法之一，具有繁殖系数高、成苗时间短和便于商品化和产业化生产的优势，但由于组织培养一直存在的褐变、菌类污染、玻璃化现象等难题，目前对于穗花牡荆的组织培养快速繁殖技术研究较少。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种穗花牡荆组织培养用的培养基及其快速繁殖方法，以提高穗花牡荆的繁殖效率，适应大规模生产的需要。
为解决以上技术问题，本发明的技术方案首先提供了一种穗花牡荆组织培养用培养基，它包括芽诱导培养基、增殖培养基和生根培养基；
所述芽诱导培养基的成分包括MS+0.1mg/L NAA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂；
所述增殖培养基的成分包括MS+1.0mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂；
所述生根培养基的成分包括1/2MS+1.0mg/L IBA+20g/L蔗糖+6g/L琼脂。
同时，本发明还提供了一种穗花牡荆组织培养快速繁殖方法，它包括以下步骤：
(1)外植体的选择和处理：选择穗花牡荆当年生枝条作为组织培养的外植体；将外植体用洗涤剂仔细刷洗，再于流水下冲洗，然后在超净工作台上将外植体转入酒精溶液中振荡10s取出，无菌水清洗1次，再转入质量浓度0.1％的升汞溶液中振荡8-10min取出，无菌水清洗3-5次，无菌滤纸吸干水分，将外植体剪成带单芽的茎段；
(2)芽诱导培养：将步骤(1)处理好的外植体接种到上述的芽诱导培养基上进行培养，培养条件为温度25±2℃，光照2000Lx，光周期14/10h；
(3)增殖培养：将步骤(2)芽诱导培养基上培养得到的腋芽切下，每个茎段保留1-2个芽点，接种到上述的增殖培养基上进行丛生芽诱导培养，培养条件为温度25±2℃，光照2000Lx，光周期14/10h；
(4)生根培养：将步骤(3)增殖培养基上培养得到的丛生芽剪成带2个芽点的茎段或茎尖，接种到上述的生根培养基上进行生根培养得到组培苗，培养条件为温度25±2℃，光照2000Lx，光周期14/10h；
(5)移栽：将组培苗栽入苗床基质中；所述苗床基质包括珍珠岩和蛭石，其体积比为1︰1；在苗移栽前，苗床基质用百菌清进行灭菌；移栽完成后，用多菌灵1000倍溶液喷雾浇水，然后用塑料薄膜覆盖保湿，用遮阳网进行遮荫，控制温度为25℃，相对湿度为95％；待移栽的组培苗生出新根，去掉塑料薄膜和遮阳网，控制相对湿度为75％。
进一步的，所述步骤(1)中的洗涤剂为质量浓度0.3-0.5％的肥皂水。
进一步的，所述步骤(1)中所述外植体用洗涤剂仔细刷洗后于流水下冲洗的时间为30-35min。
进一步的，所述步骤(1)中酒精溶液的体积浓度为75％。
进一步的，所述步骤(4)中将丛生芽剪成带2个芽点的茎段或茎尖,下端芽点距离下方切口0.5-1cm。
进一步的，所述步骤(4)与步骤(5)中间还包括炼苗步骤，将步骤(4)得到的组培苗移到组培室外，进行常温闭瓶炼苗2天后再进行步骤(5)。
与现有技术相比，本发明首先提供了一种用于组织培养穗花牡荆的培养基，该培养基包括芽诱导培养基、增殖培养基和生根培养基，三者采用特定的培养基配方，显著提高了穗花牡荆组培的增殖系数和生根率，从而提高了穗花牡荆的繁殖效率。同时，本发明方法选择穗花牡荆当年生枝条作为外植体材料，其生长旺盛、分生能力强，在进行组织培养过程中不易产生褐变。
综上，本发明提高了穗花牡荆的繁殖效率，适应大规模生产的需要。
附图说明
图1为穗花牡荆芽诱导培养3周的生长情况示意图；
图2为穗花牡荆增殖培养8周的生长情况示意图；
图3为穗花牡荆生根培养30天的生长情况示意图；
图4为组培苗移栽成活苗的示意图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
一、本发明方法步骤简介
本发明提供的穗花牡荆的组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：
1、外植体的选择和处理
选择穗花牡荆当年生枝条作为组织培养的外植体材料；将外植体用质量浓度0.3-0.5％的肥皂水仔细刷洗，再于流水下冲洗30-35min，然后在超净工作台上将外植体转入体积浓度75％的酒精溶液中振荡10s取出，无菌水清洗1次，再转入质量浓度0.1％的升汞溶液中振荡8-10min取出，无菌水清洗3-5次，无菌滤纸吸干水分，将外植体剪成带单芽的茎段。
2、芽诱导培养
将步骤1处理好的外植体接种到芽诱导培养基上进行培养，所述芽诱导培养基的成分为MS+0.1mg/L NAA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂，灭菌前的pH值用1M的NaOH溶液调至6.0；培养条件为温度25±2℃，光照2000Lx，光周期14/10h；茎段培养1周后，开始萌发出1对腋芽，3周后，腋芽可伸长至2-3cm，详见图1。
3、增殖培养
将步骤2芽诱导培养基上培养得到的腋芽切下，每个茎段保留1-2个芽点，接种到增殖培养基上进行丛生芽诱导培养，所述增殖培养基的成分为MS+1.0mg/L 6-BA+0.2mg/LIBA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂；培养条件为温度25±2℃，光照2000Lx，光周期14/10h；培养4周后，丛生芽可长到2-5cm，培养8周后，丛生芽可长至8-10cm，详见图2，增殖系数平均可达12，高可达20；每个芽可剪切出2-3个带1-2个芽点的继代材料；此后每隔8周左右，将丛生芽剪成带1-2个芽点的材料，进行继代培养。
4、生根培养
将步骤3增殖培养基上培养得到的丛生芽剪成带2个芽点的茎段或茎尖，下端芽点距离下方切口0.5-1cm,接种到生根培养基上进行生根培养得到组培苗，所述生根培养基的成分为1/2MS+1.0mg/L IBA+20g/L蔗糖+6g/L琼脂；培养条件为温度25±2℃，光照2000Lx，光周期14/10h；培养10天左右开始生根，30天左右生根率可达95％，平均生根5.5根，根长最长可达5cm，详见图3。
5、闭瓶炼苗
为了提高移栽苗的成活率，将步骤4得到的组培苗移到组培室外，进行常温闭瓶炼苗2天。
6、移栽
炼苗完成后，将组培苗栽入苗床基质中；所述苗床基质包括珍珠岩和蛭石，其体积比为1︰1；在苗移栽前，苗床基质用百菌清进行灭菌；移栽完成后，用多菌灵1000倍溶液喷雾浇水，然后用塑料薄膜覆盖保湿，用遮阳网进行遮荫，控制温度为25℃，相对湿度为95％；待移栽的组培苗生出新根，去掉塑料薄膜和遮阳网，控制相对湿度为75％；其移栽成活率为95％。
二、培养基最优试验
(1)芽诱导培养基最优试验
选择穗花牡荆当年生枝条为外植体试验对象，将外植体按照上述步骤1的方法处理后分别接种到下述培养基中按照步骤2的培养条件进行培养，观察其生长情况，具体见下表1。
表1.不同培养基组成对穗花牡荆外植体芽诱导培养的影响
(2)增殖培养基最优试验
将上述步骤2芽诱导培养基上培养得到的腋芽切下，每个茎段保留1-2个芽点，分别接种到下述不同成分的增殖培养基上按照步骤3的培养条件进行培养，56天后观察其增殖情况，具体见下表2。
表2.不同培养基组成对穗花牡荆增殖培养的影响
(3)生根培养基最优试验
将上述步骤3增殖培养基上培养得到的丛生芽剪成带2个芽点的茎段或茎尖，分别接种到下表中不同成分的生根培养基上按照步骤4的培养条件进行生根培养30天，观察其生长情况，计算其生根率，具体见下表3。
表3.不同培养基组成对穗花牡荆生根培养的影响
综上，本发明提供的穗花牡荆组织培养快速繁殖方法，显著提高了穗花牡荆组培的增殖系数和生根率，从而提高了穗花牡荆的繁殖效率，以适应大规模生产的需要。
前述MS均指现有植物组培领域中常规使用的培养基MS组分，1/2MS即指常规使用的培养基MS组分中大量元素减半、其余成分保持不变。
WPM指现有植物组培领域中常规使用的培养基WPM组分。
NAA为市售萘乙酸，是一种促进植物根系生长的植物生长调节剂，具有促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根，增加坐果，防止落果，改变雌、雄花比率等作用。
6-BA为市售6-苄氨基腺嘌呤，是一种常用于组织培养的细胞分裂素类植物生长调节剂，主要作用是促进芽的形成，诱导愈伤组织发生。
IBA为市售吲哚丁酸，是一种植物生长素类似物，用于促使插条生根，具有促进植物主根生长，提高发芽率、成活率的作用。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种穗花牡荆组织培养用培养基，其特征在于：包括芽诱导培养基、增殖培养基和生根培养基；
所述芽诱导培养基的成分包括MS+0.1mg/L NAA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂；
所述增殖培养基的成分包括MS+1.0mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂；
所述生根培养基的成分包括1/2MS+1.0mg/L IBA+20g/L蔗糖+6g/L琼脂。
2.根据权利要求1所述的一种穗花牡荆组织培养用培养基，其特征在于：所述芽诱导培养基在灭菌前的pH值为6.0。
3.一种穗花牡荆组织培养快速繁殖方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)外植体的选择和处理：选择穗花牡荆当年生枝条作为组织培养的外植体；将外植体用洗涤剂仔细刷洗，再于流水下冲洗，然后在超净工作台上将外植体转入酒精溶液中振荡10s取出，无菌水清洗1次，再转入质量浓度0.1％的升汞溶液中振荡8-10min取出，无菌水清洗3-5次，无菌滤纸吸去水分，将外植体剪成带单芽的茎段；
(2)芽诱导培养：将步骤(1)处理好的外植体接种到权利要求1所述的芽诱导培养基上进行培养，培养条件为温度25±2℃，光照2000Lx，光周期14/10h；
(3)增殖培养：将步骤(2)芽诱导培养基上培养得到的腋芽切下，每个茎段保留1-2个芽点，接种到权利要求1所述的增殖培养基上进行丛生芽诱导培养，培养条件为温度25±2℃，光照2000Lx，光周期14/10h；
(4)生根培养：将步骤(3)增殖培养基上培养得到的丛生芽剪成带2个芽点的茎段或茎尖，接种到权利要求1所述的生根培养基上进行生根培养得到组培苗，培养条件为温度25±2℃，光照2000Lx，光周期14/10h；
(5)移栽：将组培苗栽入苗床基质中；所述苗床基质包括珍珠岩和蛭石，其体积比为1︰1；在苗移栽前，苗床基质用百菌清进行灭菌；移栽完成后，用多菌灵1000倍溶液喷雾浇水，然后用塑料薄膜覆盖保湿，用遮阳网进行遮荫，控制温度为25℃，相对湿度为95％；待组培苗生出新根，去掉塑料薄膜和遮阳网，控制相对湿度为75％。
4.根据权利要求3所述的一种穗花牡荆组织培养快速繁殖方法，其特征在于：所述步骤(1)中的洗涤剂为质量浓度0.3-0.5％的肥皂水。
5.根据权利要求3所述的一种穗花牡荆组织培养快速繁殖方法，其特征在于：所述步骤(1)中所述外植体用洗涤剂仔细刷洗后于流水下冲洗的时间为30-35min。
6.根据权利要求3所述的一种穗花牡荆组织培养快速繁殖方法，其特征在于：所述步骤(1)中酒精溶液的体积浓度为75％。
7.根据权利要求3所述的一种穗花牡荆组织培养快速繁殖方法，其特征在于：所述步骤(4)中将丛生芽剪成带2个芽点的茎段或茎尖,下端芽点距离下方切口0.5-1cm。
8.根据权利要求3所述的一种穗花牡荆组织培养快速繁殖方法，其特征在于：所述步骤(4)与步骤(5)中间还包括炼苗步骤，将步骤(4)得到的组培苗移到组培室外，进行常温闭瓶炼苗2天后再进行步骤(5)。
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