CN112741001B - 一种黄荆愈伤组织诱导方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种黄荆愈伤组织诱导方法，包括：步骤1：外植体的准备,从健壮植株上切取带有腋芽的幼嫩枝条作为离体培养材料，整个植株的1/3以上部分，将切取的嫩枝去除叶片，切成4～6cm长且带有2～3个腋芽的节段；步骤2：材料预处理,将步骤1获得的茎段用流水冲去表面脏物，用浓度为5％洗衣粉溶液浸泡10min，用软毛刷轻轻刷洗外植体表面，除去附着在外植体表面的尘土和菌体；步骤3：消毒灭菌,流水冲洗茎段30min,沥干水后，放置到超净工作台上消毒灭菌，处理后用无菌水冲洗6～10次，切除茎段的伤口部位，在无菌滤纸上截取带有腋芽长4～5mm的小段；步骤4：愈伤组织诱导培养,将经消毒处理后的黄荆幼茎段接种到诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养。

Description

一种黄荆愈伤组织诱导方法

技术领域

本发明属于组织培养技术领域，具体涉及一种黄荆愈伤组织诱导方法。

背景技术

黄荆(Vitex negundo L.)又名布荆、五指柑、五指风、埔姜仔、埔姜，马鞭草科牡荆属落叶灌木或小乔木。我国常见于长江以南地区、北达秦岭淮河；山东亦有分布；国外分布于非洲东部经马达加斯加、亚洲东南部及南美洲的玻利维亚等。黄荆具有止咳、祛痰及缓解支气管痉挛的作用，主治感冒、咳嗽,哮喘,风痹、疟疾、胃痛、疝气、痔漏。黄荆叶清热解表、利湿解毒,主治感冒、中暑、吐泻、痢疾、疟疾、黄疸、风湿、跌打肿痛、疮痛疥癣,并能防止甲醛性关节炎肿胀的发展。黄荆籽、黄荆根煎剂对金黄色葡萄球菌和卡他球菌均有抑制作用，黄荆亦被日本医药界确认为有效的中草药，有祛痰、滋补等功能。我国《本草纲目》、《全国中草药汇编》等记载其果实(黄荆籽)及根、茎、叶均可入药，但极少地区利用，唯客家人有利用习俗。至今，梅州等地客家地区仍习惯以其果实做枕头，以其叶代茶待客或馈赠亲友。已有商家以黄荆为材料开发出系列产品，行销海内外。此外，黄荆还是优良的护坡绿化与水土保持树种、蜜源植物、芳香驱虫植物、纤维植物及盆景制作材料，具有广泛而重要的利用价值和巨大的开发前景。

随着人们对黄荆开发利用价值的不断挖掘，社会对黄荆的需求量将日益扩大。黄荆系列产品的原材料完全由野生资源采集供给的模式，将无法适应市场发展的需要。人工种植黄荆，培育黄荆林，势在必行。所以，亟待大量繁殖黄荆苗木，以备市场发展之需。虽然黄荆可用播种、扦插、分株繁殖，但上述方法既受发芽率、生根率低或母株数量限制，也受地理环境和季节等因素制约，很难达到快速、高效繁殖黄荆苗木的目的。微体快繁(组织培养)技术则能克服上述问题，在较短时间内繁殖大量优质黄荆苗木，从单个植物细胞，培养出许多植株。对此，国外马来西亚和印度等已经进行了试验，积累了可资借鉴的有关技术资料，国内则尚未见相关研究。

发明内容

本发明旨在研发一种快速、有效繁殖黄荆的技术，为生产大量优质黄荆苗木提供理论依据和技术路线，有利于黄荆苗木生产，促进黄荆的人工种植和黄荆林的培育，推动黄荆的综合开发利用及其系列产品的大规模生产与深度开发。

本发明采用的技术方案：

一种黄荆愈伤组织诱导方法，包括以下步骤：

步骤1：外植体的准备

从健壮植株上切取带有腋芽的幼嫩枝条作为离体培养材料，整个植株的1/3以上部分，将切取的嫩枝去除叶片，切成4～6cm长且带有2～3个腋芽的节段；

步骤2：材料预处理

将步骤1获得的茎段用流水冲去表面脏物，用浓度为5％洗衣粉溶液浸泡10min，用软毛刷轻轻刷洗外植体表面，除去附着在外植体表面的尘土和菌体；

步骤3：消毒灭菌

流水冲洗茎段30min,沥干水后，放置到超净工作台上消毒灭菌，处理后用无菌水冲洗6～10次，切除茎段的伤口部位，在无菌滤纸上截取带有腋芽长4～5mm的小段；

步骤4：愈伤组织诱导培养

将经消毒处理后的黄荆幼茎段接种到诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养3天以上。

优选的，在上述步骤3中，黄荆茎段进行消毒灭菌处理的过程为：使用70％酒精处理5s后，再用0.1％HgCl₂溶液消毒6min。

优选的，在上述步骤4中，诱导培养基的组成是：以MS培养基为基本培养基，添加TDZ和KT，其中，TDZ的浓度为1.00～2.00μM，KT的浓度为0.25～1.00μM；灭菌前pH值为5.8～6.0；100～130℃高压灭菌。

优选的，所述诱导培养基的组成为MS培养基+1.50μM TDZ+0.50μM KT。

优选的，MS培养基包括含有琼脂0.9％，蔗糖3％。

优选的，在上述步骤4中培养的光照周期为12h光/12h暗，光照强度为2000lx，培养温度为25℃，相对湿度为50％～70％。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明中黄荆茎段采用70％酒精处理5s后，再用0.1％HgCl₂溶液消毒6min，获得的黄荆茎段污染率最低，为3.33％，出愈率最高，可达100％；并采用MS培养基+1.50μM TDZ+0.50μM KT的诱导培养基进行愈伤组织诱导，在光周期为12h/12h时，产生愈伤组织时间只需3.82±0.22天，分化指数最高，其诱导率高达95％以上，而且生长量最多。

附图说明

图1为被污染外植体；

图2为褐变的外植体；

图3为愈伤组织诱导培养；a、b：7d的愈伤组织；c、d：15d有大小各异的突起；e、f：丛生芽萌发；

图4为培养基组成为MS+1.0μM TDZ的愈伤组织(25d)；

图5为培养基组成为MS+1.5μM TDZ的愈伤组织(25d)；

图6为培养基组成为MS+2.0μM TDZ的愈伤组织(25d)；

图7为不同培养基组成形成的愈伤组织对比图；由左至右培养基组成为：MS+TDZ1.00；MS+TDZ 1.50；MS+TDZ 2.00；

图8为培养基组成为MS+1.5μM TDZ+0.25μM KT的愈伤组织(25d)；

图9为培养基组成为MS+1.5μM TDZ+0.5μM KT的愈伤组织(25d)；

图10为培养基组成为MS+1.5μM TDZ+1.0μM KT的愈伤组织(25d)；

图11为加入KT后不同培养基组成形成的愈伤组织对比图；由左至右培养基组成为：MS+TDZ 1.50+KT 0.25；MS+TDZ 1.50+KT 0.50；MS+TDZ 1.50+KT 1.00。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

本发明具体提供了一种黄荆愈伤组织诱导方法，包括以下步骤：

步骤1：外植体的准备

从健壮植株上切取带有腋芽的幼嫩枝条作为离体培养材料，将切取的嫩枝去除叶片，切成4～6cm长且带有2～3个腋芽的节段；

步骤2：材料预处理

将步骤1获得的茎段用流水冲去表面脏物，用浓度为5％洗衣粉溶液浸泡10min，用软毛刷轻轻刷洗外植体表面，除去附着在外植体表面的尘土和菌体；

步骤3：消毒灭菌

流水冲洗茎段30min,沥干水后，放置到超净工作台上消毒灭菌，处理后用无菌水冲洗6～10次，切除茎段的伤口部位，在无菌滤纸上截取带有腋芽长4～5mm的小段；

步骤4：愈伤组织诱导培养

将经消毒处理后的黄荆幼茎段接种到诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养3天以上。

下面结合上述制备方法，研究其消毒技术，试验以噻二唑苯基脲(TDZ)和细胞分裂素(KT)为植物生长调节剂以及不同光暗处理对愈伤组织诱导的影响。

1.材料及仪器

1.1试验生物材料

实验所用的黄荆植株种植于广东省梅州市嘉应学院生命科学学院资源植物引种驯化园内,从健壮植株上(整个植株的1/3以上部分)切取带有腋芽的幼嫩枝条作为离体培养材料。

1.2试验仪器

植物组织培养室、室内光照培养室。

表1试验主要仪器设备

一般果园用的果树修剪刀、培养皿(35mm、60mm、100mm)、锥形瓶(50mL、100mL、250mL)、烧杯(100mL、1000mL)、手术用刀及剪刀、镊子、纱布、标签纸、保鲜膜、牛皮纸、精密PH试纸。

1.3试验试剂

TDZ、KT、NaOH(1mol/L)、70％酒精、0.1％HgCl₂溶液、琼脂、蔗糖

母液Ⅰ(20倍浓缩液)：NH₄NO₃、KNO₃、CaCl₂·2H₂O、MgSO₄·7H₂O、KH₂PO₄

母液Ⅱ(200倍浓缩液)：KI、H₃BO₃、ZnSO₄·7H₂O、Na₂MoO₄·2H₂O、CuSO₄·5H₂O、CoCl₂·6H₂O

母液Ⅲ(200倍浓缩液)：FeSO₄·7H₂O、Na₂-EDTA·2H₂O

母液Ⅳ(200倍浓缩液)：IVA肌醇、IVB烟酸、盐酸吡哆醇(维生素B6)、盐酸硫胺素(维生素B1)、甘氨酸

2.试验方法

2.1材料预处理

将切取的嫩枝去除叶片，切成4～6cm长且带有2～3个腋芽的节段，流水冲去表面脏物，用浓度为5％洗衣粉溶液浸泡10min，用软毛刷轻轻刷洗外植体表面，除去附着在外植体表面的尘土和菌体；流水冲洗约30min，沥水后，在超净工作台上消毒灭菌。各处理后均用无菌水冲洗6～10次。切除茎段与消毒试剂接触的伤口部位，在无菌滤纸上截取带有腋芽长4～5mm的小段。

2.2基本培养基与培养条件

基本培养基采用MS培养基，培养基中含有琼脂0.9％，蔗糖3％；pH值在灭菌前为5.8～6.0；121℃高压灭菌20min；培养温度25℃；光照强度2000lx；相对湿度50％～70％。

2.3不同消毒方法的筛选

研究不同消毒方式对黄荆幼茎段愈伤组织诱导的影响。以MS为基本培养基，添加1.0μM TDZ。材料消毒方法采用正交试验设计，两因素分别为70％酒精(记为a)、0.1％HgCl₂溶液(记为b)，3水平为这两种消毒方式的处理时间。试验设计见表2。

表2不同消毒方法正交试验因子水平

以上试验设计均使用直径35mm、高10mm的培养皿为培养容器，每套大约盛装2-3mL培养基。每套接种1个外植体，每个处理接种10套。试验重复3次。接种后每天观察是否出现愈伤组织及其长势，记录污染开始时间、污染数目、褐化死亡数目；30d后统计比较各处理的污染率、褐化率、诱导率。培养期间要及时取出被污染的培养皿，以避免交叉感染。

污染率＝污染的外植体数/接种总数

褐化率＝褐化数/没被污染的外植体数

诱导率＝能诱导出愈伤组织的外植体数/没被污染的外植体数

2.4不同光照周期与试验方案

研究不同光暗处理对黄荆幼茎段外植体分化的影响。以MS为基本培养基，添加1.0μM TDZ。除黑暗培养外，其余光照条件为光照强度2000lx。不同处理见表3。

表3不同光照周期处理

以上试验设计均使用直径35mm、高10mm的培养皿为培养容器，每套大约盛装2～3mL培养基。每套接种1个外植体，每个处理接种9套，实验重复3次。接种后每天观察是否出现愈伤组织及其长势；30d后调查生长点生长分化情况，为便于精确统计，按其生长分化情况划分3个等级，计算分化指数。A级为生长势良好，已分化的外植体，积2分；B级为趋于分化的外植体，但生长较迟缓，积1分；C级为生长势差、近于褐化或已褐化的外植体，积0分。培养期间要及时取出被污染的培养皿，以避免交叉感染。

2.5植物生长调节剂处理与试验方案

研究不同植物生长调节物质种类及浓度配比对黄荆幼茎段愈伤组织诱导的影响。以MS为基本培养基，根据试验目的，生长调节剂种类采用TDZ和KT，TDZ的浓度为：1.00，1.50，2.00μM；KT浓度为：0.25，0.50，1.00μM。根据不同的激素种类配比及浓度配比,进行单因子分析。培养基组成见表4。

表4 TDZ和KT对黄荆幼茎段愈伤组织诱导的处理

以上试验设计均使用直径35mm、高10mm的培养皿为培养容器，每套大约盛装2～3mL培养基。每套接种1个外植体，每个处理接种20套。试验重复3次。接种后每天观察是否出现愈伤组织及其长势，并记录；20d后统计比较各处理的愈伤组织诱导率，生长量、生长速度及愈伤组织的形态学生长势。培养期间要及时取出被污染的培养皿，以避免交叉感染。

2.6数据统计与分析

用Microsoft Office Excel 2003进行数据初步处理，对结果进行极差分析，用SPSS数据处理软件系统进行单因素方差分析。

3结果与分析

3.1不同消毒方式对黄荆幼茎段愈伤组织诱导的影响

不同消毒方法对黄荆幼茎段愈伤组织诱导的影响见图1和图2以及表5。

表5不同消毒方法对黄荆幼茎段愈伤组织诱导的影响

极差分析结果表明，对黄荆幼茎段愈伤组织消毒的最佳组合是a2b2,即用70％酒精处理5s后，用0.1％HgCl₂溶液消毒6min，此处理污染率最低，为3.33％，出愈率最高，为100％。对黄荆幼茎段外植体污染率极差分析的结果表明，0.1％HgCl₂溶液处理时间对控制黄荆幼茎段消毒效果的影响最大，因此0.1％HgCl₂溶液是控制外植体污染效果的最主要因素。从表中可看出，各处理消毒时间的延长可以延迟污染开始的时间，降低污染率，但却增高褐化死亡率；0.1％HgCl₂溶液处理时间太短，黄荆幼茎段外植体污染情况较严重；0.1％HgCl₂溶液处理时间过长，会对黄荆幼茎段的组织细胞产生毒害作用，而造成褐化死亡，所以浸泡处理的时间不宜过长，一般不超过8min。对黄荆幼茎段外植体出愈率极差分析表明，0.1％HgCl₂溶液的处理时间也是诱导外植体产生愈伤组织的主要因素，0.1％HgCl₂溶液的处理时间过长，也会引起黄荆幼茎段愈伤组织的出愈率的降低。

3.2不同光暗处理对黄荆幼茎段愈伤组织诱导的影响

虽然光照不是在组织培养中的至关重要的因素，但其对愈伤组织的诱导确实有一定的影响，其影响在于褐化率以及分化的情况，不同光暗处理对黄荆幼茎段外植体分化的影响见表6。

表6不同光暗处理对黄荆幼茎段外植体分化的影响

注：同列数字后不同小写字母表示在0.05水平有显著差异。

结果表明，光周期为12h光/12h暗的处理有最高的分化指数，培养3.82±0.22天后产生愈伤组织，A级外植体数目最多；反之4h光/20h暗的处理A级外植体数目最少，C级最多，分化指数也最低。3个光暗处理相比，处理1(4h光/20h暗)最迟产生愈伤组织，而处理3(12h光/12h暗)则最快产生愈伤组织，虽然经过软件统计后，跟处理2(8h光/16h暗)的差异性不大，但从数目上看确实略胜一筹；从褐化率来看，处理1(4h光/20h暗)的褐化率几乎是处理3(12h光/12h暗)的3倍多，跟处理2和处理3有显著的差异性；从各级外植体个数来看，处理2(8h光/16h暗)和处理3(12h光/12h暗)的A级外植体数目在统计学上没有差异，处理1显著较低；B级和C级的外植体之间也无差异。综合各个指标，光照周期对于黄荆幼茎段外植体的分化有一定的影响，影响在于褐化率和分化指数上，处理3(12h光/12h暗)产生愈伤组织天数较少，褐化率较低，分化指数最高。因此可以分析比较得出，最适合黄荆幼茎段愈伤组织诱导的光周期为12h光/12h暗。

3.3植物生长调节剂对黄荆幼茎段愈伤组织诱导的影响

将经过消毒处理(70％酒精处理5min后，0.1％HgCl₂溶液处理6min)的黄荆幼茎段接种到不同植物生长调节剂及浓度配比的培养基中。接种3d后就发现外植体明显膨大；随后开始长出愈伤组织(图3a、b)；15d以后可以观察到有数量和大小各异的突起(图3c、d)；30d后，丛生芽萌发(图3e、f)。

不同生长调节剂及配比对愈伤组织的产生均有诱导作用，诱导效果存在一定的差异(表7)。

表7 TDZ、KT对黄荆幼茎段愈伤组织诱导的作用

Table6 Effect of TDZ and KT on induction of young segments callus inVitexnegundo L.

注：同列数字后不同小写字母表示在0.05水平有显著差异。(“+”表示生长量小；“++”表示生长量中等；“+++”表示生长量大；“++++”表示生长量极大。)

在这9种处理中，处理5(MS+1.50μM TDZ+0.50μM KT)为最优组合。在编号1-3的处理中，处理2(MS+1.50μM TDZ)的诱导率最高，愈伤组织的生长量也最多，生长速度最快，故在处理1-3中最优组合为处理2(MS+1.50μM TDZ)。为了探究更为有效的诱导方法，挑选单因子处理(处理1-3)中的最优组合，再添加不同浓度的KT，从而得出更优的组合。由表7可以看出，添加KT以后，诱导出的愈伤组织生长速度比上述无添加KT培养基的快，生长量也相对较大。处理5(MS+1.50μM TDZ+0.50μM KT)的愈伤组织诱导率及生长量明显比其它处理要大，而且生长速度也最快。

从形态学上观察，愈伤组织的质地和颜色以及分化情况根据培养基组成的不同而有所改变(如表8及图4-11)，处理1(MS+1.00μM TDZ)的愈伤组织质地较为疏松，为黄绿色，仅出现少量胚状体，但处理2(MS+1.50μM TDZ)的愈伤组织则疏松，浅绿色，而且出现较多的胚状体，证明其愈伤组织的生长势较好；处理3(MS+2.00μM TDZ)则为暗黄色，表现出有些初步老化的状态。在只添加TDZ的培养基组成中，均无丛生芽产生。添加KT后，在处理5(MS+1.50μM TDZ+0.50μM KT)中，愈伤组织质地疏松，表现出淡绿色，颜色较接近白色，并出现了丛生芽。在形态学上作比较，得出处理5(MS+1.50μM TDZ+0.50μM KT)为最适的培养基组成。因此，综合各项指标得出，培养黄荆幼茎段愈伤组织的最适培养基组成为MS+1.50μM TDZ+0.50μM KT。

表8 TDZ、KT对黄荆幼茎段愈伤组织的形态学影响

4讨论

4.1不同消毒方式对黄荆幼茎段愈伤组织诱导的影响

有效的消毒方法能控制黄荆幼茎段愈伤组织的污染率。70％酒精灭菌效果好，可以排除外植体中表层组织的空气，有利于渗入其它灭菌剂，但渗透性强，控制灭菌时间是关键。有研究指出，HgCl₂溶液对外植体材料表面的灭菌效果最好，但残留在外植体的汞难以除去，在培养一段时间后其毒害作用才表现出来，因此灭菌后材料需要经多次冲洗干净。在本实验中，有使用70％酒精和0.1％HgCl₂溶液作为消毒剂进行试验。结果表明，使用70％酒精处理5s后，用0.1％HgCl₂溶液处理6min，污染率最低，出愈率最高，效果最好。原因是HgCl₂是一种重金属盐，其带正电荷的汞离子可与带负电荷的蛋白质结合，使存在于外植体的菌体蛋白变性，酶失活，有效地杀死附着在表面的细菌及芽孢，是一种效果极好的灭菌剂；乙醇是脱水剂和脂溶剂，可使细胞膜损伤，同时也能使蛋白质变性，具有一定的灭菌能力，但70％酒精穿透力较强，很容易渗入组织内使其褐化死亡。在各种处理中，相同时间0.1％HgCl₂溶液消毒处理时，比较不同70％酒精的处理时间，得出的愈伤组织褐化率比无70％酒精处理的要高，因此在使用70％酒精处理时要注意时间，处理时间过长会引起毒害作用。0.1％HgCl₂溶液虽然难以除去，但经过蒸馏水润洗多次以后，这个问题还是可以解决的，0.1％HgCl₂溶液用于表面灭菌效果最好，但用作处理时时间要把握谨慎，在6min时为最佳。

4.2不同光暗处理对黄荆幼茎段愈伤组织诱导的影响

本试验探究了3种光周期(4light/20dark、8light/16dark、12light/12dark)对于黄荆幼茎段愈伤组织诱导的影响。将外植体放于不同光暗周期处理条件下，控制光照强度保持2000lx不变，筛选出合适的培养条件，提高外植体分化率。虽然光周期对于愈伤组织诱导不是至关重要的因素，但是其确实对于愈伤组织的萌发有一定的影响作用。试验表明，在光周期为4h/20h时，分化指数最低，而且产生愈伤组织的时间长达5.22±0.69天，在光周期为12h/12h时，产生愈伤组织时间只需3.82±0.22天，分化指数最高。暗培养有利于愈伤组织生长旺盛，因此增长暗周期，可以使外植体愈伤组织的长势更好，也就是说A级外植体数目也会增多。本试验中，可以看出12h的暗周期A级外植体数目明显比8h、16h暗周期的数目多，因此也可以说明适当的暗处理有利于愈伤组织的形成。总而言之，黄荆幼茎段愈伤组织的生长的最适光周期为12light/12dark。

4.3植物生长调节剂对黄荆幼茎段愈伤组织诱导的影响

在本试验中，使用了TDZ和KT两种植物生长调节剂来探究对黄荆幼茎段愈伤组织诱导的影响。TDZ具有细胞分裂素和植物生长素双重作用的特殊功能，能诱导外植体从愈伤组织的形成到体细胞胚胎发生的一系列不同反应。Capelle等学者研究表明，利用TDZ诱导利马豆愈伤组织生长，其速率是其他植物生长调节剂的30倍。在多次预实验中首先对不同浓度TDZ的愈伤组织诱导效果有充分的了解，得知对1.5μM TDZ对黄荆幼茎段愈伤组织诱导速度最快，但愈伤组织生长量较小，单独使用TDZ也没有丛生芽的萌发。诱导组织和器官分化的生长素和细胞分裂素对于植物器官分化有着共同的调控作用。众多科学试验证明，细胞分裂素对芽的分化有促进作用。D.NISHA RAN等人研究认为KT对于促进愈伤组织丛生芽生长量有较好的作用。故在试验中加入不同浓度KT的处理，以探究最适合黄荆幼茎段愈伤组织诱导的调节剂配比。试验表明，1.5μM TDZ对黄荆幼茎段丛生芽诱导率较高，但加入KT以后发现，1.5μM TDZ+0.50μM KT对黄荆幼茎段丛生芽诱导表现最好，并且愈伤组织生长量比1.5μM TDZ的愈伤组织生长量大，生长速度也最快。从形态学上观察，只添加TDZ时并未产生丛生芽，但添加KT后，在处理5(MS+TDZ 1.50+KT 0.50)中，愈伤组织质地疏松，表现出淡绿色，颜色较接近白色，并出现了丛生芽。结合各项指标分析得出，培养黄荆幼茎段愈伤组织的最适培养基组成为MS+TDZ 1.50+KT 0.50。

通过本次试验，可以得出一下几个结论：

1.用70％酒精消毒5s后，再用0.1％HgCl₂溶液消毒6min，黄荆幼茎段污染率最低，出愈率最高，0.1％HgCl₂溶液处理时间对消毒效果的影响最大，是控制污染效果的主要因素。

2.最适合愈伤组织诱导的光周期为12h光/12h暗。

3.黄荆幼茎段愈伤组织诱导的最佳培养基为MS+1.5μM TDZ+0.50μM KT。以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。

Claims (3)

1.一种黄荆愈伤组织诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：外植体的准备

从健壮植株上切取带有腋芽的幼嫩枝条作为离体培养材料，将切取的嫩枝去除叶片，切成4～6cm长且带有2～3个腋芽的节段；

步骤2：材料预处理

将步骤1获得的茎段用流水冲去表面脏物，用浓度为5%洗衣粉溶液浸泡10min，用软毛刷轻轻刷洗外植体表面，除去附着在外植体表面的尘土和菌体；

步骤3：消毒灭菌

流水冲洗茎段30min, 沥干水后，放置到超净工作台上消毒灭菌，处理后用无菌水冲洗6～10次，切除茎段的伤口部位，在无菌滤纸上截取带有腋芽长4～5mm的小段；

步骤4：愈伤组织诱导培养

将经消毒处理后的黄荆幼茎段接种到诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养3天以上；

在上述步骤4中，诱导培养基的组成是：以MS培养基为基本培养基，添加TDZ和KT，琼脂0.9%，蔗糖3%，其中，TDZ的浓度为1.50μM，KT的浓度为0.50μM；pH值在灭菌前为5.8～6.0，100～130℃高压灭菌。

2.根据权利要求1所述的一种黄荆愈伤组织诱导方法，其特征在于，在上述步骤3中，黄荆茎段进行消毒灭菌处理的过程为：使用70%酒精处理5s后，再用0.1%HgCl₂溶液消毒6min。

3.根据权利要求1所述的一种黄荆愈伤组织诱导方法，其特征在于，在上述步骤4中培养的光照周期为12h光/12h暗，光照强度为2000lx，培养温度为25℃，相对湿度为50%～70%。

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