CN107182783A - 一种海南三七根茎芽基部诱导再生植株的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种海南三七根茎芽基部诱导再生植株的方法,属于植物诱导再生技术领域。该方法将海南三七根茎芽前处理后,切掉根茎芽上的叶片和茎尖,留芽基部为外植体;将消毒好的外植体接种到诱导培养基上培养,直至外植体基部形成丛生芽;当初代芽基部丛生芽长至4~6cm时,切下芽,截取芽基部1.0‐1.5cm接种到增殖培养基中诱导丛生芽;再切下丛生芽转移至生根培养基上进行生根,当生根培养基上的苗高5~8cm时,在温室自然光照下炼苗7~10d,取出苗,洗净根部培养基,培养后得到移栽苗。本发明显著提高海南三七的组培繁殖效率。
Description
技术领域
本发明涉及海南三七,具体涉及一种海南三七根茎芽基部诱导再生植株的方法,属于植物组织培养快速繁殖技术领域。
背景技术
姜科(Zingiberaceae)植物的繁殖方法可通过种子有性繁殖和切分根茎营养繁殖(高江云等,2006)。然而,有些种类是自交不亲和的,有些是多倍体,均不能结种子,只能通过根茎繁殖(高江云等,2006)。切分根茎分株时,不要分得太小,一般不要少于3‐4个,太少会导致生长缓慢或死亡,同时需要带有新生的块茎,新分开的块茎去掉所有茎、叶,以减少水分的丧失(高江云等,2006)。有的属的植物可以通过茎杆扦插来繁殖,如闭鞘姜属、舞花姜属、姜花属、姜属的部分种类,将成熟的茎杆切成带3‐4个节的茎段,直立插入沙土中2节,或茎段平放,用沙土稍微覆盖,保持湿润和遮荫,一段时间后,其节上的芽就会萌蘖形成小植株,稍大后分离栽培(高江云等,2006)。
海南三七(Kaempferia rotunda)属于姜科山奈属(Kaempferia)植物,分布于广东、广西、云南、台湾及亚洲南部至东南部(吴德邻等,1981)。其叶丛生,叶片长椭圆形,叶面淡绿色,具暗绿色斑纹,不耐霜冻,冬季地上部分枯死;花先于叶直接从根茎抽出,头状花序具4‐6朵花,花白色,唇瓣较大,紫红色;花期3‐4月;根茎药用有消肿止痛的功效;观叶类,株形好,叶漂亮,花晶莹美丽,在夏秋季节可作为观赏价值高的室内观叶植物(吴德邻等,1981;高江云等,2006;路国辉和王英强,2011;吴德邻等,2016)。由于海南三七不结果,所以不能进行有性繁殖。其也没有茎杆,因此,只能采用上述的切分根茎营养繁殖。因为母本量不足,切分根茎分株繁殖速度有限,而且对母株的损伤也很大,短期内得不到大量植株。
现有技术中,采用外植体诱导愈伤组织再分化成苗进行繁殖是可行的方法,但出苗率低,而且周期长。刘盼盼(华南师范大学硕士毕业论文,2013)将海南三七外植体分为假茎段(叶至块根之间的假茎)、叶片、根状茎、芽和茎尖(盆栽和组培苗),结果盆栽的块茎、假茎段和叶片通过诱导愈伤组织再分化获得无菌苗的途径均失败;组培苗的假茎段和叶片诱导愈伤分化来获得无菌苗,由于愈伤组织增殖及诱导时间较久,并且愈伤至苗的诱导率不足10%,很难快速达到所需的无菌苗株数,故不采用此方法;组培苗的幼芽或茎尖,接种到MS+6‐BA 3.0mg/L+2,4‐D 1.0mg/L的培养基中,20d左右有愈伤组织产生,30d左右有绒毛状根生成,但也发现,接种到两种培养基MS+6‐BA 2.0/3.0mg/L+NAA 0.10mg/L上诱导,均只有10%诱导成苗,此种方法愈伤组织分化成苗率低。吴丹(华南师范大学硕士毕业论文,2014)将海南三七无菌苗的三个不同部位(叶片、假茎段和假茎段基部)接种在含有不同浓度的6‐BA和2,4‐D组合的愈伤诱导培养基上,置于黑暗条件下培养,40d后统计愈伤组织诱导情况,发现只有假茎段基部成功诱导出愈伤组织,最佳生长调节剂组合为6‐BA2.0mg/L+2,4‐D1.0mg/L,再接种到愈伤组织分化第一阶段转绿需时30d,再将转绿的愈伤组织块转接入芽分化培养基中,40d左右可逐渐有苗长成,分化率大多集中在42%‐67%之间,此种方法愈伤分化出苗率仍然低,而且从外植体诱导愈伤到分化成苗就需时110d,周期长。
发明内容
本发明针对现有技术的不足,本发明采用根茎芽基部作为外植体,提供了一种海南三七根茎芽基部诱导再生植物的方法,建立了高效的海南三七植株再生体系,显著提高海南三七的组培繁殖效率。
本发明的目的通过如下技术方案实现:
一种海南三七根茎芽基部诱导再生植株的方法,其特征在于包括以下步骤:
(a)外植体前处理:采集海南三七的根茎用自来水清洗干净,剪掉根茎上的贮藏根和须根后,消毒后晾干;再放入洗净消毒的河沙中,恒温发芽,洗净根茎芽,取其芽基部为外植体材料;
(b)丛生芽诱导:将消毒好的外植体接种到诱导培养基上培养,直至外植体基部形成丛生芽;所述的诱导培养基成分为MS、6‐苄氨基腺嘌呤1.0~3.0mg/L、萘乙酸0.01~0.10mg/L、椰汁10.0~15.0%、蔗糖20~30g/L、卡拉胶粉9.5~10.0g/L;
(c)增殖继代:当初代芽基部丛生芽长至4~6cm时,切下芽,截取芽基部1.0‐1.5cm接种到增殖培养基中诱导丛生芽;所述增殖继代培养基成分为MS、6‐苄氨基腺嘌呤3.0~8.0mg/L、萘乙酸0.05~0.10mg/L、椰汁10.0~15.0%、蔗糖20~30g/L、卡拉胶粉9.5~10.0g/L;
(d)生根培养:当继代苗高4~7cm时,切下接种到生根培养基中,所述生根培养基成分为MS、萘乙酸0.10~0.50mg/L、香蕉泥10.0~15.0%、活性炭1.0~1.5g/L、蔗糖20~30g/L、卡拉胶粉9.5~10.0g/L;
(e)炼苗移栽:当生根培养基上的苗高5~8cm时,在温室自然光照下炼苗7~10d,取出瓶苗,洗净根部培养基,百菌清溶液消毒后,移栽到进口泥炭的基质中,保持通风透气,湿度在70~85%,温度在20~32℃,自然光照条件培养后得移栽苗。
为了进一步实现本发明目的,优选地,步骤(a)所述的根茎芽的芽高为6‐18cm,有1片叶。
优选地,步骤(a)所述的消毒后晾干的消毒是将海南三七的根茎放入质量浓度0.1‐0.3%的多菌灵粉剂溶液中浸泡消毒30‐40min。
优选地,步骤(a)所述的恒温发芽是在培养箱中33℃恒温发芽下进行。
优选地,步骤(a)所述的外植体为切掉海南三七根茎芽上的叶片和茎尖后留下的1~2cm的芽基部。
优选地,以质量百分比浓度计,步骤b)所述外植体的消毒是先用0.1%‐0.3%高锰酸钾溶液浸泡根茎芽30~40min,再用0.1%~0.3%的百菌清溶液,浸泡根茎芽30~40min,接着在自来水下反复冲洗根茎芽30~40min;晾干表面水分后,在超净工作台上,切掉根茎芽上的叶片和茎尖,留2~3cm高的根茎芽基部,用棉球蘸取70%酒精擦拭芽基部,最后用0.1~0.2%升汞溶液消毒15‐18min,灭菌水冲洗4~5次,切掉距离芽基部两头各约0.3~0.5cm的部分,留1~2cm的芽基部,并将芽基部接种到诱导培养基中。
优选地,步骤(e)中如果温度高于32℃,用风机和水帘降温。
优选地,所述诱导培养基、增殖继代培养基和生根培养基的pH都为5.6~5.8;培养基灭菌条件为125℃,30~40min。
优选地,步骤(b)、步骤(c)和步骤(d)所述培养的温度为25~30℃,光照强度为2000~2300lx,光照时间控制为14h/d。
优选地,步骤(e)所述百菌清溶液消毒是用0.1%~0.3%的百菌清溶液浸泡30~40min。
应用本发明的外植体消毒方法,消毒成活率可达到85~90%,15~20d能在外植体上观察到肉眼可见的绿点。
相对于现有技术,本发明的优点和有益效果为:
(1)本发明采用海南三七根茎芽基部为外植体,建立了高效的以芽繁芽途径的植株再生体系,外植体初代培养60~65d,启动率87.50%~98.50%,出芽指数2.15~4.60,外植体大部分可以分化出2‐5个丛生芽,长势较好;继代增殖经约20~25d培养,单个丛生芽基部可分化出4~9个丛生芽,可在100~108d内完成从外植体诱导丛生芽、继代增殖到生根苗形成的一个周期,单个丛生芽基部经过继代增殖,每个继代增殖周期可增殖4.69~7.56倍个丛生芽,即单个外植体在100~108d内可出芽10.08~34.77个。现有技术中,从外植体诱导愈伤到分化成苗就需时110d,而且每块愈伤分化成苗2.38~3.75个。对比现有技术,本发明单个外植体在100~108d内可出芽10.08~34.77个,大大提高了海南三七的繁殖系数和减短了海南三七的繁殖周期。
(2)本发明只需简单的植物组织培养设备,就可在100~108d内完成从外植体诱导丛生芽、继代增殖到生根苗形成的一个周期,因此,可在短时间内获得大量的组培苗。本发明繁殖的海南三七种苗,能保持母株的优良特性,移栽成活率可达90%以上,具有投入低、产出高的优势。
附图说明
图1实施例1洗净的海南三七根茎图片。
图2实施例1在河沙中萌发洗净的根茎芽图片。
图3实施例1海南三七根茎芽基部外植体接种诱导培养基15d出现芽萌动图片。
图4实施例1外植体诱导出的丛生芽图片。
图5实施例1继代增殖的丛生芽图片。
图6实施例1生根培养形成的根系图片。
图7实施例1洗净根部培养基消毒后的组培苗图片。
图8实施例1移栽成活的组培苗图片。
具体实施方式
为更好地理解本发明,下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明,但实施例并不构成对本发明保护范围的限定。除非特别说明,本发明所采用的试剂和设备为本技术领域常规试剂和设备。
诱导培养基、增殖继代培养基和生根培养基的MS,为国际通用的培养基,其成分和配制方法如下:
MS大量元素母液100倍:称100L量溶解在1L蒸馏水中,配1L培养基取母液10mL。母液的具体配法为:分别称硝酸铵165g,硝酸钾190g,二水氯化钙44g,七水硫酸镁37g,磷酸二氢钾17g,分别加蒸馏水溶解后再混合,最后定容于1L。
MS微量元素母液1000倍:称1000L量溶解在1L蒸馏水中,配1L培养基取母液1mL。母液的具体配法为:分别称四水硫酸锰22.3g,七水硫酸锌8.6g,硼酸6.2g,碘化钾0.83g,二水钼酸钠2.5g,五水硫酸铜0.25g,六水氯化钴0.25g,分别加蒸馏水溶解后再混合,最后定容于1L。
MS铁盐母液100倍:称100L量溶解在在1L蒸馏水中,配1L培养基取母液10mL。母液的具体配法为:分别称乙二胺四乙酸二钠3.73g,七水硫酸亚铁2.78g,分别加蒸馏水溶解后再混合,最后定容于1L。
MS有机母液100倍:称100L量溶解在在1L蒸馏水中,配1L培养基取母液10mL。母液的具体配法为:分别称烟酸0.05g,盐酸吡哆素0.05g,盐酸硫胺素0.01g,肌醇10g,甘氨酸0.2g,分别加蒸馏水溶解后再混合,最后定容于1L。
实施例1
一种海南三七根茎芽基部诱导再生植株的方法,包括如下步骤:
(a)外植体前处理:采集海南三七的根茎用自来水清洗干净,剪掉根茎上的贮藏根和须根后,放入质量浓度0.3%的多菌灵粉剂溶液中浸泡消毒30min,然后取出晾干表面水分,如图1所示。再放入洗净消毒的河沙中,培养箱中33℃恒温发芽,洗净芽,如图2所示,芽高6~18cm。消毒后,切掉根茎芽上的叶片和茎尖,留取芽基部为外植体材料。
(b)丛生芽诱导:将消毒好的外植体接种到诱导培养基上培养;如图3所示,外植体为根茎芽基部,高约1~2cm,在诱导培养基上培养15d就可观察到肉眼可见的绿点。外植体在诱导培养基上继续培养,直至外植体基部形成丛生芽;如图4所示,外植体在诱导培养基上培养60d就可形成3~5个丛生芽,外植体的启动率为98.50%,出芽指数为4.60[注:启动率=(启动的外植体数/接种外植体总数)×100%;出芽指数:外植体上的出芽数的平均数]。所述的诱导培养基成分为MS、6‐苄氨基腺嘌呤3.0mg/L、萘乙酸0.10mg/L、椰汁15.0%、蔗糖30g/L、卡拉胶粉10.0g/L。
步骤(b)所述外植体的消毒是先用0.3%高锰酸钾溶液浸泡根茎芽30min,再用0.3%的百菌清溶液浸泡根茎芽30min,接着在自来水下反复冲洗根茎芽40min;晾干表面水分后,在超净工作台上,切掉根茎芽上的叶片和茎尖,留2~3cm高的根茎芽基部,用棉球蘸取70%酒精擦拭芽基部,最后用0.1%升汞溶液消毒18min,灭菌水冲洗4次,切掉距离芽基部两头各约0.3~0.5cm的部分,留约1~2cm的芽基部,并将芽基部接种到诱导培养基中。
(c)增殖继代:当初代芽基部丛生芽长至4~6cm左右时,切下芽,截取芽基部1.0~1.5cm接种到增殖培养基中诱导丛生芽;如图5所示,为在继代增殖培养基上培养20d就可形成6‐9个丛生芽,增殖系数为7.56(增殖系数=统计时的总芽数/接种时总芽数)。所述增殖继代培养基成分为MS、6‐苄氨基腺嘌呤8.0mg/L、萘乙酸0.10mg/L、椰汁15.0%、蔗糖30g/L、卡拉胶粉10.0g/L。
(d)生根培养:当继代苗高4~7cm时,切下接种到生根培养基中;如图6所示,为在生根培养基上培养20d就可形成白色的根。所述生根培养基成分为MS、萘乙酸0.10mg/L、香蕉泥15.0%、蔗糖30g/L、活性炭1.0g/L、卡拉胶粉10.0g/L。
(e)炼苗移栽:当生根培养基上的苗高5~8cm时,在温室自然光照下炼苗10d,取出组培苗,洗净根部培养基,用0.3%的百菌清溶液浸泡30min取出晾干表面水分,如图7所示,组培苗粗壮。移栽到进口泥炭的基质中,保持通风透气,湿度在70‐85%,温度在20‐32℃,自然光照条件培养后得到移栽苗;如图8所示,为在进口泥炭中种植25d后得到长势良好的移栽苗。
上述诱导培养基、增殖继代培养基和生根培养基的pH都为5.8;培养基灭菌条件为125℃,40min。
步骤(b)、步骤(c)和步骤(d)所述培养温度为25~30℃,光照强度为2300lx,光照时间控制为14h/d。
步骤(e)中如果温度高于32℃,用风机和水帘降温。
实施例1从外植体诱导、继代增殖到生根苗约需时100d的时间。
实施例2
一种海南三七根茎芽基部诱导再生植株的方法,包括以下步骤:
(a)外植体前处理:采集海南三七的根茎用自来水清洗干净,剪掉根茎上的贮藏根和须根后,放入质量浓度0.1%的多菌灵粉剂溶液中浸泡消毒40min,然后取出晾干表面水分。再放入洗净消毒的河沙中,培养箱中33℃恒温发芽,洗净根茎芽。消毒后,切掉根茎芽上的叶片和茎尖,留取芽基部为外植体材料。
(b)丛生芽诱导:将消毒好的外植体接种到诱导培养基上培养,直至外植体基部形成丛生芽,需时约65d就可长出2~3个丛生芽,外植体的启动率为83.60%,出芽指数为2.15;所述的诱导培养基成分为MS、6‐苄氨基腺嘌呤1.0mg/L、萘乙酸0.01mg/L、椰汁10.0%、蔗糖20g/L、卡拉胶粉9.5g/L;
步骤(b)所述外植体的消毒是以质量百分比浓度计,先用0.1%高锰酸钾溶液浸泡根茎芽40min,再用0.1%的百菌清溶液浸泡根茎芽40min,接着在自来水下反复冲洗根茎芽30min;晾干表面水分后,在超净工作台上,切掉根茎芽上的叶片和茎尖,留2~3cm高的根茎芽基部,用棉球蘸取70%酒精擦拭芽基部,最后用0.2%升汞溶液消毒15min,灭菌水冲洗5次,切掉距离芽基部两头各约0.3~0.5cm的部分,留约1~2cm的芽基部,并将芽基部接种到诱导培养基中。
(c)增殖继代:当初代芽基部丛生芽长至4~6cm左右时,切下芽,截取芽基部1.0~1.5cm接种到增殖培养基中培养25d就可形成4~6个丛生芽,增殖系数为4.69;所述增殖继代培养基成分为MS、6‐苄氨基腺嘌呤3.0mg/L、萘乙酸0.05mg/L、椰汁10.0%、蔗糖20g/L、卡拉胶粉9.5g/L;
(d)生根培养:当继代苗高4~7cm时,切下接种到生根培养基中,需时约18d;所述生根培养基成分为MS、萘乙酸0.30mg/L、香蕉泥10.0%、活性炭1.5g/L、蔗糖20g/L、卡拉胶粉9.5g/L;
(e)炼苗移栽:当生根培养基上的苗高5~8cm时,在温室自然光照下炼苗7d,取出试管苗,洗净根部培养基,用0.1%的百菌清溶液浸泡30min,移栽到进口泥炭的基质中,保持通风透气,湿度在70‐85%,温度在20‐32℃,自然光照条件培养后得到移栽苗。
上述诱导培养基、增殖继代培养基和生根培养基的pH都为5.6;培养基灭菌条件为125℃,30min。
步骤(b)、步骤(c)和步骤(d)所述培养温度为25~30℃,光照强度为2000lx,光照时间控制为14h/d。
步骤(e)中如果温度高于32℃,用风机和水帘降温。
实施例2从外植体诱导、继代增殖到生根苗约需时108d的时间。
实施例3
一种海南三七根茎芽基部诱导再生植株的方法,包括如下步骤:
(a)外植体前处理:采集海南三七的根茎用自来水清洗干净,剪掉根茎上的贮藏根和须根后,放入质量浓度0.2%的多菌灵粉剂溶液中浸泡消毒35min,然后取出晾干表面水分。再放入洗净消毒的河沙中,培养箱中33℃恒温发芽,洗净芽。消毒后,切掉根茎芽上的叶片和茎尖,留取芽基部为外植体材料。
(b)丛生芽诱导:将消毒好的外植体接种到诱导培养基上培养,直至外植体基部形成丛生芽,需时约63d,可形成3~4个丛生芽,外植体的启动率为95.70%,出芽指数为3.50;所述的诱导培养基成分为MS、6‐苄氨基腺嘌呤2.0mg/L、萘乙酸0.10mg/L、椰汁10.0%、蔗糖30g/L、卡拉胶粉10.0g/L;
步骤(b)所述外植体的消毒是先用0.2%高锰酸钾溶液浸泡根茎芽30min,再用0.2%的百菌清溶液浸泡根茎芽30min,接着在自来水下反复冲洗根茎芽40min;晾干表面水分后,在超净工作台上,切掉根茎芽上的叶片和茎尖,留2~3cm高的根茎芽基部,用棉球蘸取70%酒精擦拭芽基部,最后用0.1%升汞溶液消毒18min,灭菌水冲洗4次,切掉距离芽基部两头各约0.3~0.5cm的部分,留约1~2cm的芽基部,并将芽基部接种到诱导培养基中。
(c)增殖继代:当初代芽基部丛生芽长至4~6cm左右时,切下芽,截取芽基部1.0~1.5cm接种到增殖培养基中培养22d就能诱导5~7个丛生芽,增殖系数为5.87;所述增殖继代培养基成分为MS、6‐苄氨基腺嘌呤5.0mg/L、萘乙酸0.10mg/L、椰汁10.0%、蔗糖30g/L、卡拉胶粉10.0g/L;
(d)生根培养:当继代苗高4~7cm时,切下接种到生根培养基中,需时约17d,所述生根培养基成分为MS、萘乙酸0.50mg/L、香蕉泥10.0%、蔗糖30g/L、活性炭1.0g/L、卡拉胶粉10.0g/L;
(e)炼苗移栽:当生根培养基上的苗高5~8cm时,在温室自然光照下炼苗10d,取出组培苗,洗净根部培养基,用0.2%的百菌清溶液浸泡30min取出晾干表面水分,移栽到进口泥炭的基质中,保持通风透气,湿度在70‐85%,温度在20‐32℃,自然光照条件培养后得到移栽苗。
上述诱导培养基、增殖继代培养基和生根培养基的pH都为5.8;培养基灭菌条件为125℃,40min。
步骤(b)、步骤(c)和步骤(d)所述培养温度为25~30℃,光照强度为2300lx,光照时间控制为14h/d。
步骤(e)中如果温度高于32℃,用风机和水帘降温。
实施例3从外植体诱导、继代增殖到生根苗约需时102d的时间。
本发明采用海南三七的根茎芽基部为外植体,建立了高效的以芽繁芽途径的植株再生体系,外植体初代培养60~65d,启动率87.50%~98.50%,出芽指数2.15~4.60,外植体大部分可以分化出2‐5个丛生芽,长势较好;继代增殖经约20~25d培养,单个丛生芽基部可分化出4~9个丛生芽,可在100~108d内完成从外植体诱导丛生芽、继代增殖到生根苗形成的一个周期,单个丛生芽基部经过继代增殖,每个继代增殖周期可增殖4.69~7.56倍个丛生芽,即单个外植体在100~108d内可出芽10.08~34.77个。
现有技术中,刘盼盼(华南师范大学硕士毕业论文,2013)将海南三七外植体分为假茎段(叶至块根之间的假茎)、叶片、根状茎、芽和茎尖(盆栽和组培苗),结果盆栽的块茎、假茎段和叶片通过诱导愈伤组织再分化获得无菌苗的途径均失败;组培苗的假茎段和叶片诱导愈伤分化来获得无菌苗,由于愈伤组织增殖及诱导时间较久,并且愈伤至苗的诱导率不足10%,很难快速达到所需的无菌苗株数;组培苗的幼芽或茎尖,接种到MS+6‐BA3.0mg/L+2,4‐D 1.0mg/L的培养基中,20d左右有愈伤组织产生,30d左右有绒毛状根生成,但也发现,接种到两种培养基MS+6‐BA 2.0/3.0mg/L+NAA 0.10mg/L上诱导,均只有10%诱导成苗,此种方法愈伤组织分化成苗率低。
吴丹(华南师范大学硕士毕业论文,2014)将海南三七无菌苗的假茎段基部接种在MS+6‐BA 2.0mg/L+2,4‐D 1.0mg/L培养基上,置于黑暗下培养,40d后诱导出愈伤组织,再接种到愈伤组织分化第一阶段转绿需时30d,此时每块愈伤平均可得到5.69个芽点,再将转绿的愈伤组织块转接入芽分化培养基中,40d左右可逐渐有苗长成,分化率在42%~67%,即仅仅从外植体诱导愈伤到分化成苗就需时110d,每块愈伤分化成苗2.38~3.75个。
现有技术从外植体诱导愈伤到分化成苗就需时110d,而且每块愈伤分化成苗2.38~3.75个;本发明单个外植体在100~108d内可出芽10.08~34.77个,大大提高了海南三七的繁殖系数和减短了海南三七的繁殖周期,可在短时间内获得大量的组培苗。本发明繁殖的海南三七种苗,能保持母株的优良特性,移栽成活率可达90%以上,具有投入低、产出高的优势。
Claims (10)
1.一种海南三七根茎芽基部诱导再生植株的方法,其特征在于包括以下步骤:
(a)外植体前处理:采集海南三七的根茎用自来水清洗干净,剪掉根茎上的贮藏根和须根后,消毒后晾干;再放入洗净消毒的河沙中,恒温发芽,洗净根茎芽,取其芽基部为外植体材料;
(b)丛生芽诱导:将消毒好的外植体接种到诱导培养基上培养,直至外植体基部形成丛生芽;所述的诱导培养基成分为MS、6‐苄氨基腺嘌呤1.0~3.0mg/L、萘乙酸0.01~0.10mg/L、椰汁10.0~15.0%、蔗糖20~30g/L、卡拉胶粉9.5~10.0g/L;
(c)增殖继代:当初代芽基部丛生芽长至4~6cm时,切下芽,截取芽基部1.0‐1.5cm接种到增殖培养基中诱导丛生芽;所述增殖继代培养基成分为MS、6‐苄氨基腺嘌呤3.0~8.0mg/L、萘乙酸0.05~0.10mg/L、椰汁10.0~15.0%、蔗糖20~30g/L、卡拉胶粉9.5~10.0g/L;
(d)生根培养:当继代苗高4~7cm时,切下接种到生根培养基中,所述生根培养基成分为MS、萘乙酸0.10~0.50mg/L、香蕉泥10.0~15.0%、活性炭1.0~1.5g/L、蔗糖20~30g/L、卡拉胶粉9.5~10.0g/L;
(e)炼苗移栽:当生根培养基上的苗高5~8cm时,在温室自然光照下炼苗7~10d,取出瓶苗,洗净根部培养基,百菌清溶液消毒后,移栽到进口泥炭的基质中,保持通风透气,湿度在70~85%,温度在20~32℃,自然光照条件培养后得移栽苗。
2.根据权利要求1所述的海南三七根茎芽基部诱导再生植株的方法,其特征在于,步骤(a)所述的根茎芽的芽高为6‐18cm,有1片叶。
3.根据权利要求1所述的海南三七根茎芽基部诱导再生植株的方法,其特征在于,步骤(a)所述的消毒后晾干的消毒是将海南三七的根茎放入质量浓度0.1‐0.3%的多菌灵粉剂溶液中浸泡消毒30‐40min。
4.根据权利要求1所述的海南三七根茎芽基部诱导再生植株的方法,其特征在于,步骤(a)所述的恒温发芽是在培养箱中33℃恒温发芽下进行。
5.根据权利要求1所述的海南三七根茎芽基部诱导再生植株的方法,其特征在于,步骤(a)所述的外植体为切掉海南三七根茎芽上的叶片和茎尖后留下的1~2cm的芽基部。
6.根据权利要求1所述的海南三七根茎芽基部诱导再生植株的方法,其特征在于:以质量百分比浓度计,步骤b)所述外植体的消毒是先用0.1%‐0.3%高锰酸钾溶液浸泡根茎芽30~40min,再用0.1%~0.3%的百菌清溶液,浸泡根茎芽30~40min,接着在自来水下反复冲洗根茎芽30~40min;晾干表面水分后,在超净工作台上,切掉根茎芽上的叶片和茎尖,留2~3cm高的根茎芽基部,用棉球蘸取70%酒精擦拭芽基部,最后用0.1~0.2%升汞溶液消毒15‐18min,灭菌水冲洗4~5次,切掉距离芽基部两头各约0.3~0.5cm的部分,留1~2cm的芽基部,并将芽基部接种到诱导培养基中。
7.根据权利要求1所述的海南三七根茎芽基部诱导再生植株的方法,其特征在于:步骤(e)中如果温度高于32℃,用风机和水帘降温。
8.根据权利要求1所述的海南三七根茎芽基部诱导再生植株的方法,其特征在于:所述诱导培养基、增殖继代培养基和生根培养基的pH都为5.6~5.8;培养基灭菌条件为125℃,30~40min。
9.根据权利要求1所述的海南三七根茎芽基部诱导再生植株的方法,其特征在于:步骤(b)、步骤(c)和步骤(d)所述培养的温度为25~30℃,光照强度为2000~2300lx,光照时间控制为14h/d。
10.根据权利要求1所述的海南三七根茎芽基部诱导再生植株的方法,其特征在于:步骤(e)所述百菌清溶液消毒是用0.1%~0.3%的百菌清溶液浸泡30~40min。
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