CN107593443A - 一种小花山奈的组织培养快速繁殖方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小花山奈的组织培养快速繁殖方法。该方法包括外植体前处理、芽基部增殖、丛生芽诱导、继代增殖、生根壮苗和炼苗移栽。将消毒好的芽基部外植体接种到增殖培养基上培养，直至外植体基部形成球状；切割增殖的芽基部，转接到丛生芽诱导培养基上诱导丛生芽；当继代丛生芽苗高4～6cm时，切下丛生芽转移至壮苗生根培养基上进行培养，当壮苗生根培养基上的苗高6～8cm时，在温室自然光照下炼苗7～10d，取出苗，洗净根部培养基，培养后得到移栽苗。本发明可在短期内获得能保持母株优良性状的组培苗，对母株损伤不大，投入低产出高，可提供大量的小花山奈组培苗。

Description

一种小花山奈的组织培养快速繁殖方法

技术领域

本发明涉及小花山奈，具体涉及一种小花山奈的组织培养快速繁殖方法，属于植物组织培养快速繁殖技术领域。

背景技术

姜科(Zingiberaceae)植物可通过播种、切分根茎、扦插和组织培养的方法繁殖(高江云等，2006；熊友华等，2005，2007；吴繁花等，2009；黄赛等，2016；吴德邻等，2016；李冬梅等，2017)。小花山奈(Kaempferia parviflora)属于姜科山奈属(Kaempferia)植物，株高约30cm，叶丛生，叶片椭圆形，叶面绿色，叶缘红色，叶背具暗红色斑纹；花序包藏于一钟状总苞内，花多数较小，依次开放，花白色，唇瓣具紫红色斑纹；花期5‐10月；根茎块状，药用；观叶类，株形好，叶漂亮可赏，可作为室内观叶和林下地被植物(高江云等，2006；吴德邻等，2016)。小花山奈由于不结果，故不能进行播种繁殖；其也没有茎杆，也不能用扦插繁殖；其根茎块状，也不能用带叶根茎扦插；因此，只能采用切分根茎和组织培养的方法繁殖。但因为母本量不足，切分根茎分株繁殖速度慢，而且对母株损伤也很大，短期内得不到大量种苗。

姜科山奈(Kaempferia galanga)的组织培养选用块茎上刚萌发的芽为外植体时，采用75％酒精消毒1min，无菌水漂洗1次，0.1％升汞消毒10min，无菌水漂洗2次，0.1％升汞消毒6min的消毒效果最好，存活率平均达56.66％，其污染率只有6.67％，但外植体存活数天后，植株有细菌污染现象，这可能是山奈自身带有内生菌所致，导致外植体灭菌困难(吴繁花等，2009)。由于山奈属植物的多样性和块茎自身带有内生菌，故采用常规组织培养的消毒程序灭菌困难。山奈块茎刚萌发的芽为外植体时，适宜的诱导培养基为MS+6‐BA3.0mg/L+NAA 0.1mg/L，芽的萌发率达100％，分化率为146.67％(吴繁花等，2009)。但取小花山奈块茎上萌发的芽基部为外植体时，接种至诱导培养基MS+6‐BA 3.0‐5.0mg/L+NAA0.1mg/L+椰汁10.0％+蔗糖20g/L+卡拉胶粉9.5g/L，芽的诱导率为0。目前，尚未见对小花山奈进行组织培养和种苗大规模生产的报道。

发明内容

本发明所解决的技术问题在于提供一种小花山奈的组织培养快速繁殖方法，可在短期内获得大量性状稳定的种苗，能保持母株的优良特性，具有投入低产出高的优势。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种小花山奈的组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：

(a)外植体前处理：采集小花山奈的根茎用自来水清洗干净，剪掉根茎上的须根后，消毒后晾干；再放入洗净消毒的河沙中，恒温发芽，洗净根茎芽，取其芽基部为外植体材料；

(b)芽基部增殖：将消毒好的芽基部外植体接种到增殖培养基上培养，直至外植体基部形成球状；所述的芽基部增殖培养基成分为MS、6‐苄氨基腺嘌呤8.0～10.0mg/L、奈乙酸0.01～0.10mg/L、椰汁10.0～15.0％、蔗糖20～30g/L、卡拉胶粉9.5～10.0g/L；

(c)丛生芽诱导：切割增殖的芽基部，转接到诱导培养基中诱导丛生芽；所述丛生芽诱导培养基成分为MS、6‐苄氨基腺嘌呤3.0～5.0mg/L、奈乙酸0.01～0.10mg/L、椰汁10.0～15.0％、蔗糖20～30g/L、卡拉胶粉9.5～10.0g/L；

(d)继代增殖：将诱导出的不定芽切掉叶片后留芽基部，继代培养于增殖培养基中继续增殖芽基部；所述继代增殖培养基成分为MS、6‐苄氨基腺嘌呤8.0～10.0mg/L、奈乙酸0.01～0.10mg/L、椰汁10.0～15.0％、蔗糖20～30g/L、卡拉胶粉9.5～10.0g/L；

(e)生根壮苗：当继代丛生芽苗高4～6cm时，切下接种到生根培养基中，所述生根壮苗培养基成分为MS、奈乙酸0.10～0.50mg/L、香蕉泥10.0～15.0％、活性炭0.5～1.0g/L、蔗糖20～30g/L、卡拉胶粉9.5～10.0g/L；

(f)炼苗移栽：当生根壮苗培养基上的苗高6～8cm时，在温室自然光照下炼苗7～10d，取出瓶苗，洗净根部培养基，百菌清溶液消毒后，移栽到进口泥炭的基质中，保持通风透气，湿度在70～85％，温度在20～32℃，自然光照条件培养后得移栽苗。

为了进一步实现本发明目的，优选地，步骤(a)所述的消毒后晾干的消毒是将小花山奈的根茎放入质量浓度0.1～0.3％的多菌灵粉剂溶液中浸泡消毒30～40min，然后再放入质量浓度0.1～0.3％的高猛酸钾溶液浸泡消毒30～40min。

优选地，步骤(a)所述的洗净消毒的河沙，是将河沙先用灭菌水冲洗3～4次，再用质量浓度0.1～0.3％的高猛酸钾溶液浸泡消毒3～5h，然后室温晾干。

优选地，步骤(a)所述的恒温发芽是在培养箱中30～33℃下进行。

优选地，步骤(a)所述的根茎芽的芽高为2～5cm。

优选地，步骤(a)所述的外植体为切掉小花山奈根茎芽上的茎尖后留下的1～2cm的芽基部。

优选地，以质量百分比浓度计，步骤b)所述外植体的消毒是先用0.1～0.3％高锰酸钾溶液浸泡根茎芽30～40min，再在自来水下反复冲洗根茎芽30～40min；晾干表面水分后，在超净工作台上，切掉根茎芽上的茎尖，留2～3cm高的根茎芽基部，用棉球蘸取70％酒精擦拭芽基部，最后用0.1～0.2％升汞溶液消毒12～15min，灭菌水冲洗4～5次，切掉距离芽基部两头各约0.3～0.5cm的部分，留1～2cm的根茎芽基部，并将根茎芽基部接种到芽基部增殖培养基中。

优选地，步骤(f)中如果温度高于32℃，用风机和水帘降温。

优选地，所述芽基部增殖培养基、丛生芽诱导培养基、继代增殖培养基和生根壮苗培养基的pH为5.6～5.8；培养基灭菌条件为125℃，30～40min。

优选地，步骤(b)、步骤(c)、步骤(d)和步骤(e)所述培养的温度为25～30℃，光照强度为2000～2300lx，光照时间控制为14h/d。

优选地，步骤(f)所述消毒使用百菌清溶液消毒，百菌清溶液的浓度为0.1～0.3％，消毒浸泡的时间为30～40min。

本发明步骤(f)的泥炭类基质优选为进口泥炭，进口泥炭优选为荷兰捷菲国际集团生产，产地爱沙尼亚，型号705，粒径0‐10mm，pH 5.8±0.2，为结构良好的棕黄色泥炭。

本发明先将小花山奈的根茎在多菌灵粉剂溶液和高锰酸钾溶液中浸泡消毒，再将河沙用灭菌水洗净和高锰酸钾溶液浸泡消毒，然后将消毒的根茎放入洗净消毒的河沙中发芽，再将根茎芽用高锰酸钾溶液中浸泡消毒后，然后再采用常规的组织培养消毒程序，消毒成活率可达到70～80％，污染率3.58～4.68％，7～15d能在根茎芽基部上形成膨大的绿点。

相对于现有技术，本发明的优点和有益效果为：

1)本发明在采用常规的组织培养消毒程度前，分别将根茎消毒、河沙消毒和外植体用高锰酸钾溶液浸泡消毒，有效抑制了外植体的内生菌；本发明可大大提高外植体的成活率，降低外植体在芽基部增殖培养基中的污染率。

2)本发明将根茎芽基部先接种增殖培养基(MS+6‐BA 8.0～10.0mg/L+NAA 0.01～0.10mg/L+椰汁10.0～15.0％、蔗糖20～30g/L+卡拉胶粉9.5～10.0g/L)，可促使芽基部增殖，后再切割增殖的芽基部转接入诱导培养基(MS+6‐BA3.0～5.0mg/L+NAA 0.01～0.10mg/L+椰汁10.0～15.0％+蔗糖20～30g/L+卡拉胶粉9.5～10.0g/L)，这一过程可有效诱导丛生芽，从而提高工作效率。

3)本发明只需简单的植物组织培养设备就可在125～145d内完成从外植体根茎芽基部到组培苗形成的一个周期，大大加快了小花山奈的繁殖速度，经过继代增殖，每个继代增殖周期可增殖5～8倍大的根茎芽基部。因此，本发明可在短时间内获得大量的组培苗。本发明繁殖的小花山奈种苗，能保持母株的优良特性，移栽成活率可达85％以上，具有投入低产出高的优势。

4)对小花山奈的组织培养快速繁殖研究，对提高其种苗繁殖速度、在园艺上和作为药用植物种苗种植的推广应用上具有重要意义。

附图说明

图1为实施例1小花山奈洗净消毒后的根茎照片。

图2为实施例1小花山奈根茎在干净河沙中萌发的根茎芽照片。

图3为实施例1小花山奈根茎芽基部外植体接种芽基部增殖培养基7d的芽基部萌动照片。

图4为实施例1小花山奈根茎芽基部外植体接种芽基部增殖培养基50d的芽基部照片。

图5为实施例1增殖的芽基部切割后接种诱导培养基8d诱导出的丛生芽照片。

图6为实施例1增殖的芽基部切割后接种诱导培养基30d诱导出的丛生芽照片。

图7为实施例1生根培养形成的根系照片。

图8为实施例1洗净根部培养基消毒后的组培苗照片。

图9为实施例1移栽成活的组培苗照片。

具体实施方式

为更好地理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，但实施例并不构成对本发明保护范围的限定。除非特别说明，本发明所采用的试剂和设备为本技术领域常规试剂和设备。

诱导培养基、增殖继代培养基和生根培养基的MS，为国际通用的培养基，其成分和配制方法如下：

MS大量元素母液100倍：称100L量溶解在1L蒸馏水中，配1L培养基取母液10mL。母液的具体配法为：分别称硝酸铵165g，硝酸钾190g，二水氯化钙44g，七水硫酸镁37g，磷酸二氢钾17g，分别加蒸馏水溶解后再混合，最后定容于1L。

MS微量元素母液1000倍：称1000L量溶解在1L蒸馏水中，配1L培养基取母液1mL。母液的具体配法为：分别称四水硫酸锰22.3g，七水硫酸锌8.6g，硼酸6.2g，碘化钾0.83g，二水钼酸钠2.5g，五水硫酸铜0.25g，六水氯化钴0.25g，分别加蒸馏水溶解后再混合，最后定容于1L。

MS铁盐母液100倍：称100L量溶解在在1L蒸馏水中，配1L培养基取母液10mL。母液的具体配法为：分别称乙二胺四乙酸二钠3.73g，七水硫酸亚铁2.78g，分别加蒸馏水溶解后再混合，最后定容于1L。

MS有机母液100倍：称100L量溶解在在1L蒸馏水中，配1L培养基取母液10mL。母液的具体配法为：分别称烟酸0.05g，盐酸吡哆素0.05g，盐酸硫胺素0.01g，肌醇10g，甘氨酸0.2g，分别加蒸馏水溶解后再混合，最后定容于1L。

实施例1

一种小花山奈的组织培养快速繁殖方法，包括如下步骤：

a)外植体前处理：采集小花山奈的根茎用自来水清洗干净，剪掉根茎上的须根后，放入质量浓度0.3％的多菌灵粉剂溶液中浸泡消毒30min，然后再放入质量浓度0.3％的高猛酸钾溶液浸泡消毒30min，取出晾干表面水分，如图1所示。再放入洗净消毒的河沙中，培养箱中30℃恒温发芽，如图2所示。洗净根茎芽，取其芽基部为外植体材料。

步骤a)所述的洗净消毒的河沙，是将河沙先用灭菌水冲洗3次，再用质量浓度0.1％的高猛酸钾溶液浸泡消毒5h，然后室温晾干。

b)芽基部增殖：将消毒好的芽基部外植体接种到增殖培养基上培养，接种20d后，外植体的成活率为70％，污染率为3.58％[注：成活率＝(成活的芽基部数/接种芽基部总数)×100％；污染率＝(污染的芽基部数/接种芽基部总数)×100％]。如图3所示，外植体为根茎芽基部，高约1～2cm，在增殖培养基上培养7d就可肉眼观察到芽基部绿点膨大。外植体在增殖培养基上继续培养，直至外植体基部增殖形成球状；如图4所示，外植体在芽基部增殖培养基上培养50d就可形成5倍大的芽基部。增殖培养基成分为MS、6‐苄氨基腺嘌呤8.0mg/L、奈乙酸0.10mg/L、椰汁15.0％、蔗糖30g/L、卡拉胶粉10.0g/L。

步骤b)所述外植体的消毒是先用0.3％高锰酸钾溶液浸泡根茎芽30min，再在自来水下反复冲洗根茎芽30min；晾干表面水分后，在超净工作台上，切掉根茎芽上的茎尖，留2～3cm高的根茎芽基部，用棉球蘸取70％酒精擦拭芽基部，最后用0.1％升汞溶液消毒15min，灭菌水冲洗4次，切掉距离芽基部两头各约0.3～0.5cm的部分，留1～2cm的根茎芽基部，并将根茎芽基部接种到芽基部增殖培养基中。

c)丛生芽诱导：切割增殖的芽基部，转接到诱导培养基中诱导丛生芽；如图5所示，切割的芽基部在诱导培养基上培养8d诱导出小的丛生芽；如图6所示，切割的芽基部在诱导培养基上培养30d就可形成的4～7个丛生芽，切割的芽基部的启动率为100％，出芽指数为5.80[注：启动率＝(启动的芽基部数/接种芽基部总数)×100％；出芽指数：切割的芽基部上的出芽数的平均数]。诱导培养基成分为MS、6‐苄氨基腺嘌呤5.0mg/L、奈乙酸0.10mg/L、椰汁10.0％、蔗糖30g/L、卡拉胶粉10.0g/L。

d)继代增殖：将诱导出的不定芽切掉叶片和茎后，留芽基部，继代培养于增殖培养基中继续增殖芽基部，培养45d，可获得5倍大的芽基部。增殖培养基成分为MS、6‐苄氨基腺嘌呤8.0mg/L、奈乙酸0.10mg/L、椰汁15.0％、蔗糖30g/L、卡拉胶粉10.0g/L。

e)生根壮苗：当继代丛生芽苗高4～6cm时，切下接种到生根培养基中；如图7所示，为在生根培养基上培养20d就可形成白色的根。生根培养基成分为MS、奈乙酸0.10mg/L、香蕉泥15.0％、活性炭1.0g/L、蔗糖30g/L、卡拉胶粉10.0g/L。

f)炼苗移栽：当生根培养基上的苗高6～8cm时，在温室自然光照下炼苗10d，取出瓶苗，洗净根部培养基，用0.3％的百菌清溶液浸泡30min取出晾干表面水分，如图8所示，组培苗粗壮；移栽到进口泥炭(荷兰捷菲国际集团生产，产地爱沙尼亚，型号705，粒径0‐10mm，pH 5.8±0.2，为结构良好的棕黄色泥炭)的基质中，如图9所示，保持通风透气，湿度在70～85％，温度在20～32℃，自然光照条件培养后得移栽苗。

上述芽基部增殖的增殖培养基、丛生芽诱导的诱导培养基、继代增殖的增殖培养基和生根培养的生根培养基的pH都为5.8；培养基灭菌条件为125℃，40min。

步骤b)、步骤c)、步骤d)和步骤e)所述培养温度为25～30℃，光照强度为2300lx，光照时间控制为14h/d。

步骤f)中如果温度高于32℃，用风机和水帘降温。

移栽苗注意通风、浇水肥和遮荫，由于进口泥炭较疏松、氮磷钾养分含量高，实施例1的组培苗移栽后的成活率[注：成活率＝(移栽10d后成活的苗数/移栽时的总苗数)×100％)]可达85％以上；实施例1从芽基部增殖、丛生芽诱导、继代增殖到生根苗约需时145d。

实施例2

一种小花山奈的组织培养快速繁殖方法，包括如下步骤：

(a)外植体前处理：采集小花山奈的根茎用自来水清洗干净，剪掉根茎上的须根后，放入质量浓度0.1％的多菌灵粉剂溶液中浸泡消毒40min，然后再放入质量浓度0.1％的高猛酸钾溶液浸泡消毒40min，取出晾干表面水分。再放入洗净消毒的河沙中，培养箱中32℃恒温发芽。洗净根茎芽，取其芽基部为外植体材料。

步骤(a)所述的洗净消毒的河沙，是将河沙先用灭菌水冲洗4次，再用质量浓度0.3％的高猛酸钾溶液浸泡消毒3h，然后室温晾干。

(b)芽基部增殖：将消毒好的芽基部外植体接种到增殖培养基上培养，接种20d后，外植体的成活率为75％，污染率为3.98％[注：成活率＝(成活的芽基部数/接种芽基部总数)×100％；污染率＝(污染的芽基部数/接种芽基部总数)×100％]。培养40d后，可获得8倍大的芽基部。增殖培养基成分为MS、6‐苄氨基腺嘌呤10.0mg/L、奈乙酸0.10mg/L、椰汁10.0％、蔗糖20g/L、卡拉胶粉9.5g/L。

步骤(b)所述外植体的消毒是先用0.1％高锰酸钾溶液浸泡根茎芽40min，再在自来水下反复冲洗根茎芽40min；晾干表面水分后，在超净工作台上，切掉根茎芽上的茎尖，留2～3cm高的根茎芽基部，用棉球蘸取70％酒精擦拭芽基部，最后用0.2％升汞溶液消毒12min，灭菌水冲洗5次，切掉距离芽基部两头各约0.3～0.5cm的部分，留1～2cm的根茎芽基部，并将根茎芽基部接种到芽基部增殖培养基中。

(c)丛生芽诱导：切割增殖的芽基部，转接到诱导培养基中诱导丛生芽，切割的芽基部在诱导培养基上培养35d就可形成的3～5个丛生芽，切割的芽基部的启动率为100％，出芽指数为4.50。诱导培养基成分为MS、6‐苄氨基腺嘌呤3.0mg/L、奈乙酸0.10mg/L、椰汁10.0％、蔗糖20g/L、卡拉胶粉9.5g/L。

(d)继代增殖：将诱导出的不定芽切掉叶片后留芽基部，继代培养于增殖培养基中继续增殖芽基部，培养35d，可获得8倍大的芽基部。增殖培养基成分为MS、6‐苄氨基腺嘌呤10.0mg/L、奈乙酸0.10mg/L、椰汁10.0％、蔗糖20g/L、卡拉胶粉9.5g/L。

(e)生根壮苗：当继代丛生芽苗高4～6cm时，切下苗接种到生根培养基中；培养15d就可形成白色的根。所述生根壮苗培养基成分为MS、奈乙酸0.50mg/L、香蕉泥10.0％、活性炭0.5g/L、蔗糖20g/L、卡拉胶粉9.5g/L。

(f)炼苗移栽：当生根培养基上的苗高6～8cm时，在温室自然光照下炼苗7d，取出瓶苗，洗净根部培养基，用0.1％的百菌清溶液浸泡30min取出晾干表面水分；移栽到进口泥炭(荷兰捷菲国际集团生产，产地爱沙尼亚，型号705，粒径0‐10mm，pH 5.8±0.2，为结构良好的棕黄色泥炭)的基质中，保持通风透气，湿度在70～85％，温度在20～32℃，自然光照条件培养后得移栽苗。

上述芽基部增殖的增殖培养基、丛生芽诱导的诱导培养基、继代增殖的增殖培养基和生根培养的生根培养基的pH都为5.6；培养基灭菌条件为125℃，30min。

步骤(b)、步骤(c)、步骤(d)和步骤(e)所述培养温度为25～30℃，光照强度为2000lx，光照时间控制为14h/d。

步骤(f)中如果温度高于32℃，用风机和水帘降温。

移栽苗注意通风、浇水肥和遮荫，由于进口泥炭较疏松、氮磷钾养分含量高，实施例2的组培苗移栽后的成活率[注：成活率＝(移栽10d后成活的苗数/移栽时的总苗数)×100％)]可达90％以上；实施例2从芽基部增殖、丛生芽诱导、继代增殖到生根苗约需时125d。

实施例3

一种小花山奈的组织培养快速繁殖方法，包括如下步骤：

(a)外植体前处理：采集小花山奈的根茎用自来水清洗干净，剪掉根茎上的须根后，放入质量浓度0.2％的多菌灵粉剂溶液中浸泡消毒30min，然后再放入质量浓度0.2％的高猛酸钾溶液浸泡消毒30min，取出晾干表面水分。再放入洗净消毒的河沙中，培养箱中33℃恒温发芽。洗净根茎芽，取其芽基部为外植体材料。

步骤(a)所述的洗净消毒的河沙，是将河沙先用灭菌水冲洗4次，再用质量浓度0.2％的高猛酸钾溶液浸泡消毒4h，然后室温晾干。

(b)芽基部增殖：将消毒好的芽基部外植体接种到增殖培养基上培养，接种20d后，外植体的成活率为80％，污染率为4.68％[注：成活率＝(成活的芽基部数/接种芽基部总数)×100％；污染率＝(污染的芽基部数/接种芽基部总数)×100％]。培养45d后，可获得7倍大的芽基部。增殖培养基成分为MS、6‐苄氨基腺嘌呤10.0mg/L、奈乙酸0.01mg/L、椰汁10.0％、蔗糖20g/L、卡拉胶粉9.5g/L。

步骤(b)所述外植体的消毒是先用0.2％高锰酸钾溶液浸泡根茎芽30min，再在自来水下反复冲洗根茎芽30min；晾干表面水分后，在超净工作台上，切掉根茎芽上的茎尖，留2～3cm高的根茎芽基部，用棉球蘸取70％酒精擦拭芽基部，最后用0.2％升汞溶液消毒12min，灭菌水冲洗5次，切掉距离芽基部两头各约0.3～0.5cm的部分，留1～2cm的根茎芽基部，并将根茎芽基部接种到芽基部增殖培养基中。

(c)丛生芽诱导：切割增殖的芽基部，转接到诱导培养基中诱导丛生芽，切割的芽基部在诱导培养基上培养37d就可形成的3～5个丛生芽，切割的芽基部的启动率为100％，出芽指数为4.20，丛生芽诱导的诱导培养基成分为MS、6‐苄氨基腺嘌呤3.0mg/L、奈乙酸0.01mg/L、椰汁10.0％、蔗糖20g/L、卡拉胶粉9.5g/L。

(d)继代增殖：将诱导出的不定芽切掉叶片后留芽基部，继代培养于增殖培养基中继续增殖芽基部，培养40d，可获得7倍大的芽基部。继代增殖的增殖培养基成分为MS、6‐苄氨基腺嘌呤10.0mg/L、奈乙酸0.01mg/L、椰汁10.0％、蔗糖20g/L、卡拉胶粉9.5g/L。

(e)生根壮苗：当继代丛生芽苗高4～6cm时，切下苗接种到生根培养基中；培养18d就可形成白色的根。生根壮苗的生根培养基成分为MS、奈乙酸0.30mg/L、香蕉泥10.0％、活性炭0.5g/L、蔗糖20g/L、卡拉胶粉9.5g/L。

(f)炼苗移栽：当生根培养基上的苗高6～8cm时，在温室自然光照下炼苗7d，取出瓶苗，洗净根部培养基，用0.2％的百菌清溶液浸泡30min取出晾干表面水分；移栽到进口泥炭(荷兰捷菲国际集团生产，产地爱沙尼亚，型号705，粒径0‐10mm，pH 5.8±0.2，为结构良好的棕黄色泥炭)的基质中，保持通风透气，湿度在70～85％，温度在20～32℃，自然光照条件培养后得移栽苗。

上述芽基部增殖的增殖培养基、丛生芽诱导的诱导培养基、继代增殖的增殖培养基和生根培养的生根培养基的pH都为5.6；培养基灭菌条件为125℃，30min。

步骤(b)、步骤(c)、步骤(d)和步骤(e)所述培养温度为25～30℃，光照强度为2000lx，光照时间控制为14h/d。

步骤(f)中如果温度高于32℃，用风机和水帘降温。

移栽苗注意通风、浇水肥和遮荫，由于进口泥炭较疏松、氮磷钾养分含量高，实施例3的组培苗移栽后的成活率[注：成活率＝(移栽10d后成活的苗数/移栽时的总苗数)×100％)]可达90％以上；实施例3从芽基部增殖、丛生芽诱导、继代增殖到生根苗约需时140d。

对比例1

本对比例小花山奈的外植体前处理和消毒方式为：采集小花山奈的根茎用自来水清洗干净，剪掉根茎上的须根后，再放入用自来水洗净的河沙中，培养箱中30℃恒温发芽。再用自来水加少量洗涤剂反复冲洗根茎芽40min。晾干表面水分后，在超净工作台上，切掉根茎芽茎尖，留约2～3cm高的根茎芽基部，用棉球蘸取70％酒精擦拭根茎芽基部，最后用0.1％升汞溶液消毒10min，灭菌水冲洗4次，切掉距离芽基部两头各约0.3～0.5cm的部分，留1～2cm的根茎芽基部，并将根茎芽基部接种到芽基部增殖培养基中。本对比例的芽基部增殖培养基与实施例1的条件都相同。接种1周左右观察发现，芽基部增殖培养基100％污染。

对比例2

本对比例小花山奈的外植体前处理和消毒方式为：采集小花山奈的根茎用自来水清洗干净，剪掉根茎上的须根后，再放入用自来水洗净的河沙中，培养箱中33℃恒温发芽。将根茎芽用自来水洗净，在自来水下反复冲洗根茎芽30min。晾干表面水分后，在超净工作台上，切掉根茎芽茎尖，留约2～3cm高的根茎芽基部，用棉球蘸取70％酒精擦拭根茎芽基部，最后用0.1％升汞溶液消毒15min，灭菌水冲洗5次，切掉距离芽基部两头各约0.3～0.5cm的部分，留1～2cm的根茎芽基部，并将根茎芽基部接种到芽基部增殖培养基中。本对比例的芽基部增殖培养基与实施例1的条件都相同。接种1周左右观察发现，芽基部增殖培养基100％污染。

对比例3

本对比例小花山奈的外植体前处理和消毒方式同实施例1，所不同是外植体先接入诱导培养基，其成分为MS、6‐苄氨基腺嘌呤3.0mg/L、奈乙酸0.10mg/L、椰汁10.0％、蔗糖20g/L、卡拉胶粉9.5g/L。接种60d后，芽基部没有反应。

对比例4

本对比例小花山奈的外植体前处理和消毒方式同实施例1，所不同是外植体先接入诱导培养基，其成分为MS、6‐苄氨基腺嘌呤5.0mg/L、奈乙酸0.10mg/L、椰汁10.0％、蔗糖20g/L、卡拉胶粉9.5g/L。接种60d后，芽基部没有反应。

对比例1和对比例2的小花山奈的根茎在发芽前没有消毒、河沙也没有消毒、根茎萌发芽也没有消毒，就进行常规的组织培养外植体消毒程序，内生菌灭菌困难，所以外植体在芽基部增殖培养基中100％污染。本发明首次发现，针对小花山奈，先河沙洗净消毒、根茎洗净消毒、根茎萌发芽洗净消毒后，再按常规的组织培养外植体消毒程序，可有效抑制内生菌的生长，大大降低了外植体在芽基部增殖培养基中的污染率。

对比例3和对比例4的小花山奈的外植体前处理和消毒方式同实施例1，芽基部外植体在诱导培养基中的污染率降低，但芽基部外植体在诱导培养基(MS+6‐BA 3.0‐5.0mg/L+NAA 0.1mg/L+椰汁10.0％+蔗糖20g/L+卡拉胶粉9.5g/L)中接种60d后芽的诱导率为0。本发明首次发现，先将芽基部接入增殖培养基(MS+6‐BA 8.0‐10.0mg/L+NAA 0.1mg/L，其它成分同实施例1‐3)中，使其启动芽基部增殖，再将增殖的芽基部分割后转接入诱导培养基(MS+6‐BA 3.0‐5.0mg/L+NAA 0.1mg/L，其它成分同实施例1‐3)，这一过程可有效诱导丛生芽，可在短期内获得大量性状稳定的种苗，从而提高了工作效率。

Claims (10)

1.一种小花山奈的组织培养快速繁殖方法，其特征在于包括以下步骤：

(a)外植体前处理：采集小花山奈的根茎清洗干净，剪掉根茎上的须根后，消毒后晾干；再放入洗净消毒的河沙中，恒温发芽，洗净根茎芽，取芽基部为外植体材料；

(b)芽基部增殖：将消毒好的芽基部外植体接种到增殖培养基上培养，直至外植体基部形成球状；

(c)丛生芽诱导：切割增殖的芽基部，转接到诱导培养基中诱导丛生芽；所述诱导培养基成分为MS、6‐苄氨基腺嘌呤3.0～5.0mg/L、奈乙酸0.01～0.10mg/L、椰汁10.0～15.0％、蔗糖20～30g/L、卡拉胶粉9.5～10.0g/L；

(d)继代增殖：将诱导出的不定芽切掉叶片和茎后留芽基部，继代培养于增殖培养基中继续增殖芽基部；

(e)生根壮苗：当继代丛生芽苗高4～6cm时，切下接种到生根培养基中，所述生根培养基成分为MS、奈乙酸0.10～0.50mg/L、香蕉泥10.0～15.0％、活性炭0.5～1.0g/L、蔗糖20～30g/L、卡拉胶粉9.5～10.0g/L；

(f)炼苗移栽：当生根培养基上的苗高6～8cm时，在温室自然光照下炼苗7～10d，取出瓶苗，洗净根部培养基，消毒后，移栽到泥炭类基质中，保持通风透气，湿度在70～85％，温度在20～32℃，自然光照条件培养后得移栽苗；

步骤(b)和步骤(d)所述的增殖培养基成分为MS、6‐苄氨基腺嘌呤8.0～10.0mg/L、奈乙酸0.01～0.10mg/L、椰汁10.0～15.0％、蔗糖20～30g/L、卡拉胶粉9.5～10.0g/L。

2.根据权利要求1所述的小花山奈的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，步骤(a)所述的消毒后晾干的消毒是将小花山奈的根茎放入质量浓度0.1～0.3％的多菌灵粉剂溶液中浸泡消毒30～40min，然后再放入质量浓度0.1～0.3％的高猛酸钾溶液浸泡消毒30～40min；

步骤(a)所述的洗净消毒的河沙是将河沙先用灭菌水冲洗3～4次，再用质量浓度0.1～0.3％的高猛酸钾溶液浸泡消毒3～5h，然后室温晾干。

3.根据权利要求1所述的小花山奈的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，步骤(a)所述的恒温发芽是在培养箱中30～33℃下进行。

4.根据权利要求1所述的小花山奈的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，步骤(a)所述的根茎芽的芽高为2～5cm。

5.根据权利要求1所述的小花山奈的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，步骤(a)所述的外植体为切掉小花山奈根茎芽上的茎尖后留下的1～2cm的芽基部。

6.根据权利要求1所述的小花山奈的组织培养快速繁殖方法，其特征在于：以质量百分比浓度计，步骤b)所述外植体的消毒是先用0.1～0.3％高锰酸钾溶液浸泡根茎芽30～40min，再在自来水下反复冲洗根茎芽30～40min；晾干表面水分后，在超净工作台上，切掉根茎芽上的茎尖，留2～3cm高的根茎芽基部，用棉球蘸取70％酒精擦拭芽基部，最后用0.1～0.2％升汞溶液消毒12～15min，灭菌水冲洗4～5次，切掉距离芽基部两头各约0.3～0.5cm的部分，留1～2cm的根茎芽基部，并将根茎芽基部接种到芽基部增殖培养基中。

7.根据权利要求1所述的小花山奈的组织培养快速繁殖方法，其特征在于：步骤(f)中如果温度高于32℃，用风机和水帘降温。

8.根据权利要求1所述的小花山奈的组织培养快速繁殖方法，其特征在于：所述增殖培养基、诱导培养基和生根培养基的pH都为5.6～5.8；培养基灭菌条件为125℃，30～40min。

9.根据权利要求1所述的小花山奈的组织培养快速繁殖方法，其特征在于：步骤(b)、步骤(c)、步骤(d)和步骤(e)培养的温度为25～30℃，光照强度为2000～2300lx，光照时间控制为14h/d。

10.根据权利要求1所述的小花山奈的组织培养快速繁殖方法，其特征在于：步骤(f)所述消毒使用百菌清溶液消毒，百菌清溶液的浓度为0.1～0.3％，消毒浸泡的时间为30～40min。