CN110999787A - 一种山奈脱毒苗的繁育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种山奈脱毒苗的繁育方法。本发明方法包括以下步骤:外植体准备、无菌芽获得、无菌芽的继代壮芽、无菌苗增殖及生根、生根苗炼苗和移栽;待生根苗长至6‑8cm高时,室温炼苗后移至温室最后移栽到田里。采用本发明方法得到的芽增值系数为3.27‑5.2,获得组培苗的生根率为100%,移栽的成活率为100%且无病虫害的感染,有效的解决了山奈传统的种植方式容易受到病虫害感染的问题。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域,具体涉及一种山奈脱毒苗的繁育方法。
背景技术
山奈(Kaempferia galanga L.),别名沙姜、山辣等,属姜科山奈属多年生宿根草本;其性耐旱耐瘠怕浸,分布和栽培于广东、广西、云南、台湾等省区。山奈供药用或食用的部位为地下块状茎,单生或数枚连接,淡绿色或绿白色,芳香;山奈既是著名的中药,又是食用调味品并具有独特风味,也是食品加工香料、酱油等的原材料,在市场上深受欢迎。
山奈在常规栽培中,采用块状茎作为种植材料;收获时选用当年生、健壮、无病虫害及未受冻害的根茎,沙藏越冬做种苗;这样不仅消耗大量的商品山奈,而且需要大量的土地留种,生产成本较高,而且存在病虫害严重等问题。尤其是病毒病引起的灾害,在当前尚未有特效药进行防治。例如,最常见的病害沙姜瘟,其危害程度可达田块病株率为30%-50%,甚至高达80%以上,而且成片发生。因此,如能利用组织培养技术进行山奈脱毒培养获得快速繁殖无病毒种苗,可为较低成本地实现工厂化生产脱毒苗提供新途径。
发明内容
本发明的目的是针对常规留种育苗病株率高的缺陷,提供一种山奈脱毒苗的繁育方法。
本发明的山奈脱毒苗的繁育方法,包括以下步骤:
a.外植体准备:
取当年生的山奈地下块茎,清理干净表面后晾干,将芽切下至直径为0.5-1.0cm大小,去掉表皮和叶鞘,完成外植体准备;
b.无菌芽获得:
将外植体消毒处理后接种到初代培养基中,培养获得无菌芽;所述的初代培养基:每升含有6-BA1.0mg、NAA0.1-0.5mg、特美汀250-500mg、蔗糖30g、琼脂7g,余量为MS培养基,pH5.8;
c.无菌芽的继代壮芽:
将初代培养获得的山奈无菌芽转接到继代培养基中,培养长成无菌苗,所述的继代培养基:每升含有6-BA2.0mg、NAA0.1-0.5mg、特美汀250-500mg、蔗糖30g、琼脂7g,余量为MS培养基,pH5.8;
d.无菌苗增殖及生根:
将获得的无菌苗剪去叶片和茎后转接到增殖培养基中,培养获得生根苗;
e.生根苗炼苗及移栽:
将长至6-8cm高的生根苗炼苗,然后移栽。
优选,所述的增殖培养基:每升含有6-BA3.0mg、TDZ0.75mg、蔗糖30g、琼脂7g,余量为MS培养基,pH5.8。
优选,所述的增殖培养基:每升含有6-BA2.0mg、TDZ0.75mg、NAA0.1mg、蔗糖30g、琼脂7g,余量为MS培养基,pH5.8。
优选,所述的增殖培养基:每升含有TDZ0.25mg、NAA0.1mg、蔗糖30g、琼脂7g,余量为MS培养基,pH5.8。
优选,所述的步骤b中的外植体消毒处理是将外植体用无菌水冲洗两次,然后用体积分数70%-75%乙醇水溶液消毒40-60s,无菌水冲洗1次,用质量分数0.1%-0.2%HgCl2溶液加终浓度为质量分数0.02%的吐温-20消毒5-6min,无菌水冲洗1次,再用质量分数0.1%-0.2%HgCl2溶液消毒6-7min,无菌水彻底冲洗干净,然后吸去表面的水分。
优选,所述的步骤b、c和d中的培养条件:温度为25℃±2℃,相对湿度50%-80%,光照强度为1400-2000lx,光照时间为12h/d。
优选,所述的步骤e的生根苗炼苗,是将长至6-8cm高的生根苗放置在室温自然光照下半开盖培养2-3d,全开盖培养3-4d完成炼苗。
优选,所述的步骤e的移栽,是将炼苗后的生根苗取出,洗干净根部培养基,移栽到泥炭基质中,移栽后的10-15d内,每隔2-3d喷质量分数0.1%-0.3%的百菌清溶液消毒,待在泥炭基质中生长30-40d后再移栽到大田里。
本发明相对于现有技术具有以下优点和特点:
(1)外植体准备操作过程,如何选择芽及去除叶鞘组织是关键。用解剖刀轻轻刮掉芽的表皮及其周围的褐色组织,尤其是靠近芽的基部的部位,小心不要伤到幼嫩的芽。
(2)本发明通过在外植体初代培养、继代壮芽培养过程中结合使用抗生素特美汀,能保证高质量的获得山奈无菌苗。
(3)利用本发明的增殖培养基,同时进行无菌苗的增殖和生根,缩短培养时间及节约成本。
(4)利用本发明方法获得的无菌生根苗移栽后的成活100%,分蘖能力强;而常规留种育苗第二年种植死亡率达到80%(图10、11)。
采用本发明所述的方法得到的芽增值系数为3.27-5.2,获得组培苗的生根率为100%,移栽的成活率为100%且无病虫害的感染,有效的解决了山奈传统的种植方式容易受到病虫害感染的问题。
附图说明
图1是实施例1经初代培养基培养获得的无菌芽;
图2是实施例1在继代培养基中培养壮芽;
图3是实施例1增殖及生根培养获得的生根苗;
图4是实施例1获得的生根苗的根的生长情况;
图5是组培苗移栽大田生长三个月后的长势;
图6是组培苗移栽大田生长三个月后的单株山奈长势;
图7是实施例2增殖及生根培养获得的生根苗;
图8是实施例2获得的生根苗的根的生长情况;
图9是实施例3增殖及生根培养获得的生根苗;
图10是常规留种育苗大田生长情况;
图11是常规留种育苗单株山奈大田生长情况。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明,而不是对本发明的限制。
实施例1
本实施例的山奈脱毒苗的繁育方法,包括以下步骤:
(1)外植体准备:取当年生的生长旺盛的山奈地下块茎,剪掉块茎上的根,用流水将其表面的泥土冲掉,用毛刷轻轻刷干净表面,晾干,将芽切下至直径约1.0cm大小,用解剖刀轻轻刮掉表皮及其周围的褐色组织,尤其是靠近芽的基部的部位,小心不要伤到幼嫩的芽,直至完全剥掉表皮和叶鞘,完成外植体准备;然后放入无菌水中备用。
(2)无菌芽获得:将外植体在超净工作台上用无菌水冲洗两次,然后用体积分数75%乙醇水溶液消毒(消毒过程中要保持摇晃,使其消毒充分;下同)60s,无菌水冲洗1次,质量分数0.1%HgCl2溶液加终浓度为质量分数0.02%的吐温-20消毒5min,无菌水冲洗1次,质量分数0.1%HgCl2溶液消毒7min,无菌水冲洗五次以上将消毒溶液彻底冲洗干净后,用消毒滤纸吸去外植体表面的水分,接种到初代培养基中,培养获得无菌芽(如图1所示);所用的初代培养基:每升含有6-BA1.0mg、NAA0.5mg、特美汀500mg、蔗糖30g、琼脂7g,余量为MS培养基,pH5.8。培养条件:温度为25℃±2℃,相对湿度80%,光照强度为2000lx,光照时间为12h/d;初代培养获得无菌芽的成功率为74.04%。
(3)无菌芽的继代壮芽:将初代培养获得的山奈无菌芽转接到继代培养基中培养,生长壮芽(如图2所示)至长成无菌苗,所用的继代培养基:每升含有6-BA2.0mg、NAA0.5mg、特美汀500mg、蔗糖30g、琼脂7g,余量为MS培养基,pH5.8。该无菌芽的继代壮芽步骤可重复1-3次,后续重复的转接继代壮芽时继代培养基中可不加特美汀。培养条件:温度为25℃±2℃,相对湿度80%,光照强度为2000lx,光照时间为12h/d。
(4)无菌苗增殖及生根:将获得的无菌苗剪去叶片和茎后转接到增殖培养基中培养,增殖培养时同时生根,获得生根苗;所用的增殖培养基:每升含有6-BA3.0mg、TDZ0.75mg、蔗糖30g、琼脂7g,余量为MS培养基,pH5.8。培养条件:温度为25℃±2℃,相对湿度80%,光照强度为2000lx,光照时间为12h/d;增殖倍数为5.2,获得生根苗如图3所示,生根情况如图4所示。
(5)生根苗炼苗:将长至6-8cm高的生根苗放置在室温自然光照下半开盖培养2d,全开盖培养4d完成炼苗。
(6)移栽:将炼苗成功的山奈生根苗取出,洗干净根部培养基,小心不要伤到根,移栽到泥炭基质中,移栽后的15d内,每隔3d要喷质量分数0.3%的百菌清溶液消毒,待在泥炭基质中生长40d后再移栽到大田里。生长三个月后,组培苗长势旺盛,叶片葱绿无叶缘变黄、叶片长斑、溃烂现象(如图5、6所示)。
采用本实施例的培养方法得到的芽增值系数为5.2,获得组培苗的生根率为100%,移栽的成活率为100%,分蘖能力强,且无病虫害的感染,有效的解决了山奈传统的种植方式容易受到病虫害感染的问题。
实施例2
本实施例的山奈脱毒苗的繁育方法,包括以下步骤:
(1)外植体准备:取当年生的生长旺盛的山奈地下块茎,剪掉块茎上的根,用流水将其表面的泥土冲掉,用毛刷轻轻刷干净表面,晾干,将芽切下至直径约1.0cm大小,用解剖刀轻轻刮掉表皮及其周围的褐色组织,尤其是靠近芽的基部的部位,小心不要伤到幼嫩的芽,直至完全剥掉表皮和叶鞘,完成外植体准备;然后放入无菌水中备用。
(2)无菌芽获得:将外植体在超净工作台上用无菌水冲洗两次,然后用体积分数75%乙醇水溶液消毒(消毒过程中要保持摇晃,使其消毒充分;下同)60s,无菌水冲洗1次,质量分数0.2%HgCl2溶液加终浓度为质量分数0.02%的吐温-20消毒6min,无菌水冲洗1次,质量分数0.2%HgCl2溶液消毒6min,无菌水冲洗五次以上将消毒溶液彻底冲洗干净后,用消毒滤纸吸去外植体表面的水分,接种到初代培养基中,培养获得无菌芽;所用的初代培养基:每升含有6-BA1.0mg、NAA0.5mg、特美汀250mg、蔗糖30g、琼脂7g,余量为MS培养基,pH5.8。培养条件:温度为25℃±2℃,相对湿度80%,光照强度为2000lx,光照时间为12h/d;初代培养获得无菌芽的成功率为53.85%。
(3)无菌芽的继代壮芽:将初代培养获得的山奈无菌芽转接到继代培养基中培养,生长壮芽至长成无菌苗,所用的继代培养基:每升含有6-BA2.0mg、NAA0.5mg、特美汀250mg、蔗糖30g、琼脂7g,余量为MS培养基,pH5.8。该无菌芽的继代壮芽步骤可重复1-3次,后续重复的转接继代壮芽时继代培养基中可不加特美汀。培养条件:温度为25℃±2℃,相对湿度80%,光照强度为2000lx,光照时间为12h/d。
(4)无菌苗增殖及生根:将获得的无菌苗剪去叶片和茎后转接到增殖培养基中培养,增殖培养时同时生根,获得生根苗;所用的增殖培养基:每升含有6-BA2.0mg、TDZ0.75mg、NAA0.1mg、蔗糖30g、琼脂7g,余量为MS培养基,pH5.8。培养条件:温度为25℃±2℃,相对湿度80%,光照强度为2000lx,光照时间为12h/d;增殖倍数为5.03,获得生根苗如图7所示,生根情况如图8所示。
(5)生根苗炼苗:将长至6-8cm高的生根苗放置在室温自然光照下半开盖培养2d,全开盖培养4d完成炼苗。
(6)移栽:将炼苗成功的山奈生根苗取出,洗干净根部培养基,小心不要伤到根,移栽到泥炭基质中,移栽后的15d内,每隔3d要喷质量分数0.3%的百菌清溶液消毒,待在泥炭基质中生长40d后再移栽到大田里。生长三个月后,组培苗长势旺盛,叶片葱绿无叶缘变黄、叶片长斑、溃烂现象。
采用本实施例的培养方法得到的芽增值系数为5.03,获得组培苗的生根率为100%,移栽的成活率为100%,分蘖能力强,且无病虫害的感染,有效的解决了山奈传统的种植方式容易受到病虫害感染的问题。
实施例3
本实施例的山奈脱毒苗的繁育方法,包括以下步骤:
(1)外植体准备:取当年生的生长旺盛的山奈地下块茎,剪掉块茎上的根,用流水将其表面的泥土冲掉,用毛刷轻轻刷干净表面,晾干,将芽切下至直径约0.5cm大小,用解剖刀轻轻刮掉表皮及其周围的褐色组织,尤其是靠近芽的基部的部位,小心不要伤到幼嫩的芽,直至完全剥掉表皮和叶鞘,完成外植体准备;然后放入无菌水中备用。
(2)无菌芽获得:将外植体在超净工作台上用无菌水冲洗两次,然后用体积分数70%乙醇水溶液消毒(消毒过程中要保持摇晃,使其消毒充分;下同)40s,无菌水冲洗1次,质量分数0.1%HgCl2溶液加终浓度为质量分数0.02%的吐温-20消毒6min,无菌水冲洗1次,质量分数0.1%HgCl2溶液消毒6min,无菌水冲洗五次以上将消毒溶液彻底冲洗干净后,用消毒滤纸吸去外植体表面的水分,接种到初代培养基中,培养获得无菌芽;所用的初代培养基:每升含有6-BA1.0mg、NAA0.1mg、特美汀250mg、蔗糖30g、琼脂7g,余量为MS培养基,pH5.8。培养条件:温度为25℃±2℃,相对湿度50%,光照强度为1400lx,光照时间为12h/d;初代培养获得无菌芽的成功率为54.55%。
(3)无菌芽的继代壮芽:将初代培养获得的山奈无菌芽转接到继代培养基中培养,生长壮芽至长成无菌苗,所用的继代培养基:每升含有6-BA2mg、NAA0.1mg、特美汀250mg、蔗糖30g、琼脂7g,余量为MS培养基,pH5.8。该无菌芽的继代壮芽步骤可重复1-3次,后续重复的转接继代壮芽时继代培养基中可不加特美汀。培养条件:温度为25℃±2℃,相对湿度50%,光照强度为1400lx,光照时间为12h/d。
(4)无菌苗增殖及生根:将获得的无菌苗剪去叶片和茎后转接到增殖培养基中培养,增殖培养时同时生根,获得生根苗;所用的增殖培养基:每升含有TDZ0.25mg、NAA0.1mg、蔗糖30g、琼脂7g,余量为MS培养基,pH5.8。培养条件:温度为25℃±2℃,相对湿度50%,光照强度为1400lx,光照时间为12h/d;增殖倍数为3.27,获得生根苗如图9所示。
(5)生根苗炼苗:将长至6-8cm高的生根苗放置在室温自然光照下半开盖培养3d,全开盖培养3d完成炼苗。
(6)移栽:将炼苗成功的山奈生根苗取出,洗干净根部培养基,小心不要伤到根,移栽到泥炭基质中,移栽后的10d内,每隔2d要喷质量分数0.1%的百菌清溶液消毒,待在泥炭基质中生长30d后再移栽到大田里。生长三个月后,组培苗长势旺盛,叶片葱绿无叶缘变黄、叶片长斑、溃烂现象。
采用本实施例的培养方法得到的芽增值系数为3.27,获得组培苗的生根率为100%,移栽的成活率为100%,分蘖能力强,且无病虫害的感染,有效的解决了山奈传统的种植方式容易受到病虫害感染的问题。
Claims (8)
1.一种山奈脱毒苗的繁育方法,其特征在于,包括以下步骤:
a.外植体准备:
取当年生的山奈地下块茎,清理干净表面后晾干,将芽切下至直径为0.5-1.0cm大小,去掉表皮和叶鞘,完成外植体准备;
b.无菌芽获得:
将外植体消毒处理后接种到初代培养基中,培养获得无菌芽;所述的初代培养基:每升含有6-BA1.0 mg、NAA0.1-0.5mg、特美汀250-500mg、蔗糖30g、琼脂7g,余量为MS培养基,pH5.8;
c.无菌芽的继代壮芽:
将初代培养获得的山奈无菌芽转接到继代培养基中,培养长成无菌苗,所述的继代培养基:每升含有6-BA2.0 mg、NAA0.1-0.5mg、特美汀250-500mg、蔗糖30g、琼脂7g,余量为MS培养基,pH5.8;
d.无菌苗增殖及生根:
将获得的无菌苗剪去叶片和茎后转接到增殖培养基中,培养获得生根苗;
e.生根苗炼苗及移栽:
将长至6-8cm高的生根苗炼苗,然后移栽。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的增殖培养基:每升含有6-BA3.0 mg、TDZ0.75 mg、蔗糖30g、琼脂7g,余量为MS培养基,pH5.8。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的增殖培养基:每升含有6-BA2.0 mg、TDZ0.75 mg、NAA0.1 mg、蔗糖30g、琼脂7g,余量为MS培养基,pH5.8。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的增殖培养基:每升含有TDZ0.25 mg、NAA0.1 mg、蔗糖30g、琼脂7g,余量为MS培养基,pH5.8。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的步骤b中的外植体消毒处理是将外植体用无菌水冲洗两次,然后用体积分数70%-75%乙醇水溶液消毒40-60s,无菌水冲洗1次,用质量分数0.1%-0.2%HgCl2溶液加终浓度为质量分数0.02%的吐温-20消毒5-6min,无菌水冲洗1次,再用质量分数0.1%-0.2%HgCl2溶液消毒6-7min,无菌水彻底冲洗干净,然后吸去表面的水分。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的步骤b、c和d中的培养条件:温度为25℃±2℃,相对湿度50%-80%,光照强度为1400-2000lx,光照时间为12h/d。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的步骤e的生根苗炼苗,是将长至6-8cm高的生根苗放置在室温自然光照下半开盖培养2-3d,全开盖培养3-4d完成炼苗。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的步骤e的移栽,是将炼苗后的生根苗取出,洗干净根部培养基,移栽到泥炭基质中,移栽后的10-15d内,每隔2-3d喷质量分数0.1%-0.3%的百菌清溶液消毒,待在泥炭基质中生长30-40d后再移栽到大田里。
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GR01 | Patent grant | ||
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