CN109479721B - 一种花生植株再生方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种花生植株再生方法，使用该方法可以缩短获得再生苗的时间。所述方法的主要步骤是：将消毒并清洗后的花生种子的每片子叶从靠近子叶节的位置横切下1/5~1/3放入添加2,4‑D和TDZ的丛生芽点诱导培养基上，培养2周后将形成丛生芽点的子叶节外植体，转移到添加TDZ的植株再生培养基上得到再生植株，以再生植株作为接穗，珍珠岩中无菌萌发的花生种子实生苗作为砧木进行无菌嫁接，经炼苗后移栽塑料大棚、温室或田间。本发明以花生子叶节作为外植体，子叶节部位内原激素水平较高，分化能力强，不但植株再生频率高，并且植株再生快，操作简便，节省大量人力物力财力。

Description

一种花生植株再生方法

技术领域

本发明属于花生组织培育领域，具体涉及一种花生植株再生方法。

背景技术

花生是我国重要的油料作物和经济作物，在农业乃至整个国民经济中均具有重要地位。然而，由于花生栽培种遗传基础狭窄、抗逆性差，尤其易感多种病虫害，严重影响其产量和质量，尽管育种家们试图培育抗逆品种，但由于花生栽培种中缺乏高抗性品种资源，抗病品种的选育一直是个难以解决的问题。目前，抗性基因的遗传转化及离体诱变育种受到国内外广泛重视。而能否将基因转化和离体诱变成功应用于花生育种，关键依赖于花生组织培养高效植株再生体系的建立。

近年来，国内外研究者开展了利用花生不同外植体离体培养再生植株的研究，但一般植株再生频率比较低，并且植株再生慢。如国家授权发明专利“一种花生体胚诱导及植株再生的方法”，利用种子胚小叶作为外植体，在体胚诱导培养基上培养30天后，转移到体胚萌发培养基上培养，每隔25～30d继代一次，继代两次得到再生苗，也即从接种至得到再生苗需要将近4个月的时间，耗费培养室空间和电能，转接培养基操作次数多，耗费大量人力物力财力。

发明内容

本发明的目的是提供一种花生植株再生方法，使用本发明的技术方案可以显著缩短获得再生苗的时间。

为实现上述发明目的，本发明通过以下技术方案来实现：

本发明提供了一种花生植株再生方法，所述方法包括以下步骤：

(1)制备丛生芽点诱导培养基：选取MS为基本培养基，在所述基本培养基中添加TDZ和2，4-D制成丛生芽点诱导培养基；

制备植株再生培养基：选取MS为基本培养基，在所述基本培养基中添加TDZ制成植株再生培养基；

(2)选择外植体材料：花生种子去种胚后的子叶节为外植体材料；

(3)丛生芽点诱导及植株再生：

a将花生种子进行消毒，用无菌水清洗后，将种子浸泡在无菌水中；

b从无菌水中取出种子剥去种皮，去除种胚，从子叶上靠近子叶节的位置横切1/5～1/3放入丛生芽点诱导培养基上，培养2周后，外植体形成了芽点；

c将形成芽点的外植体，转移到植株再生培养基上进行培养，长成再生植株；

(4)砧木的准备：

a以珍珠岩作为砧木种子催芽的无菌培养基质，加入MS液体培养基后高压灭菌；

b将花生种子消毒，用无菌水清洗后，接种于培养基，催芽6～8日得到花生种子实生苗；

(5)再生苗无菌嫁接及移栽：

a以再生植株作为接穗，花生种子实生苗作为砧木进行无菌嫁接；

b将嫁接苗再返回盛有珍珠岩的培养基中，培养3-5天，使伤口愈合；

c炼苗1～2天后，移栽塑料大棚、温室或田间。

进一步的：所述步骤(1)中丛生芽点诱导培养基中TDZ的添加量为0.1～0.2mg/L，2，4-D的添加量为1～3mg/L。

进一步的：所述步骤(1)中植株再生培养基中TDZ的添加量为0.01～0.05mg/L。

进一步的：所述步骤(3)中花生种子消毒采用的是75％的乙醇浸泡50～70s，再用0.1％升汞中浸泡14-16min或用0.2％次氯酸钠溶液中浸泡11～12min。

进一步的：所述步骤(3)中在温度为24～26℃、光照强度为1500～2500Lx、光照时间为每日光照13小时的培养条件下培养。

进一步的：光照时间为从早晨6点至晚上7点。

进一步的：所述步骤(4)中消毒后的种子接种于灭菌的盛有珍珠岩的培养瓶中，播种深度2cm，在温度26±1℃，光照强度2000Lx，每日早晨6点至晚上7点光照13小时的条件下催芽。

进一步的：所述步骤(5)中培养瓶开瓶口炼苗1天后，移栽塑料大棚或温室或田间，移栽初期10天用地膜覆盖保持水分，上午10点至下午4点加盖遮阴网。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：

1、本发明以花生子叶节作为外植体，在基本培养基中添加0.1～0.2mg/L TDZ(噻苯隆，又名苯基噻二唑基脲))和1～3mg/L 2，4-D(氯化苯氧乙酸)所形成的丛生芽点诱导培养基上及在基本培养基中添加0.01～0.05mg/L TDZ所形成的植株再生培养基上，进行丛生芽点诱导及其植株再生，经试验表明，丛生芽点诱导率95％以上，植株再生频率达到100％，每个外植体再生植株数20个以上。

2、本发明以花生子叶节作为外植体，子叶节部位内原激素水平较高，分化能力较强，不但植株再生频率高，每个外植体再生植株数多，并且植株再生快，在丛生芽点诱导培养基上培养2周后，转移到植株再生培养基上再培养4周即可得到再生苗，比专利“一种花生体胚诱导及植株再生的方法”中获得再生苗的时间缩短2个半月，具有明显的技术效果；并且培养材料只需转接一次即可，从而节省大量人力物力财力。、

附图说明

图1为花生苗，其中，箭头所指为子叶节；

图2为花生种子、子叶、子叶节、种胚；

图3为接种的子叶节外植体；

图4为子叶节外植体在丛生芽点形成培养基上培养2周后形成的丛生芽点；

图5为在植株再生培养基上培养4周后，丛生芽点发育长成的植株；

图6为在珍珠岩中无菌催芽2天后发芽的花生种子；

图7为珍珠岩中无菌催芽的花生实生苗；

图8为珍珠岩中无菌催芽7日龄的花生苗；

图9为再生苗作为接穗的嫁接苗；

图10为嫁接苗再栽植于珍珠岩中；

图11为移栽塑料大棚正常生长的嫁接苗；

图12为嫁接苗结果，箭头指嫁接口。

具体实施方式

TDZ(噻苯隆，又名苯基噻二唑基脲)是一种新型植物生长调节剂，具有很强的细胞分裂素活性，并且具有细胞分裂素和生长素的双重作用，可以促进植物芽的再生和繁殖，打破芽的休眼，促进种子萌发，促进愈伤组织生长，延缓植物衰老等。2，4-D(二氯苯氧乙酸)是一种除草剂，也是一种人工合成的植物生长素，可用于诱导细胞分裂、愈伤组织的形成。以往在组织培养中大多选用生长素类2，4-D、NAA(萘乙酸)、IAA(吲哚乙酸)和细胞分裂素类6-BA(6-苄氨基嘌呤)、KT(激动素)、ZT(玉米素)等作为脱分化和再分化的调节物质，而对TDZ研究较少。

农学通报2015,31(21)，149-156报道的“花生胚轴的离体诱导与植株再生”，利用上胚轴和下胚轴作为外植体，在MS+TDZ 1mg/L+6-BA 1mg/L+NAA 0.5mg/L+AgNO3 3mg/L丛生芽诱导培养基上培养，上胚轴外植体丛生芽分化率只有1个品种达到70％，其他3个品种均在50％以下，平均每个外植体再生不定芽仅有4.5个；而利用下胚轴作为外植体，4个品种的丛生芽分化率仅为31.7％～41.8％。

因为TDZ的细胞分裂素活性强，本发明对TDZ的适宜浓度进行了研究，结果是低浓度的TDZ(0.01～0.2mg/L)有利于丛生芽形成和植株再生。

实施例1

1、制备丛生芽点诱导培养基：

选取MS为基本培养基，在所述基本培养基中添加TDZ和2，4-D制成丛生芽点诱导培养基，TDZ的添加量为所述基本培养基中添加0.1～0.2mg/L，2，4-D的添加量为所述基本培养基中添加1～3mg/L，本实施例中丛生芽点诱导培养基为MS+0.1mg/L TDZ+2mg/L 2，4-D+0.8％琼脂+3％蔗糖，pH调至5.8。

2、制备植株再生培养基：选取MS为基本培养基，在所述基本培养基中添加TDZ制成植株再生培养基，TDZ的添加量为所述基本培养基中添加0.01～0.05mg/L，本实施例中植株再生培养基为MS+0.01mg/L TDZ+0.8％琼脂+3％蔗糖，pH调至5.8。TDZ的作用：在此步骤中诱导丛生芽点发育成不定芽。

3、选择外植体材料：

供试材料为目前广泛推广栽培的花生品种鲁花11号、花育20号、花育22号、花育25号，选取各品种成熟饱满的种子去种胚后的子叶节作为试验材料。

花生子叶节就是子叶节与主茎交接的部位，见图1。因种子尚未分化主茎，种子中子叶节与胚芽交接的部位即为子叶节，见图2。因为花生子叶节位置是花生第一队侧枝分化的位置，内原激素含量高，从而启动侧枝分化的基因表达，长出侧枝。本发明对生长于田间的花生侧枝的分化进行过研究，将长出的侧枝摘掉，不久又会长出侧枝，再摘再长。说明子叶节部位是一个特殊的部位，分化能力极强。因此，本发明选择子叶节作为外植体，利用子叶节节部位内原激素含量高、分化能力强的特点，并结合培养基中添加适宜的激素种类和浓度，提高植株再生效率。

4、丛生芽点诱导及植株再生：

(1)选取饱满花生种子首先在75％乙醇中浸泡1min，然后在0.1％升汞中浸泡15min或0.2％次氯酸钠溶液中浸泡11分钟，最后用灭菌的蒸馏水洗涤4～5次除去残留的消毒剂，将种子在灭菌的蒸馏水中浸泡2～4小时。

(2)从灭菌的蒸馏水中取出种子剥去种皮，去除种胚，靠近子叶节的位置从子叶上横切1/5～1/3(根据种子大小)，放入丛生芽点诱导培养基上培养，见图3。培养条件为：培养室温度26±1℃，光照强度2000Lx，每日早晨6点至晚上7点光照13小时。

在丛生芽点诱导培养基上培养2周后，子叶节外植体形成了绿色丛生芽点，见图4。统计丛生芽点形成率于表1，供试的4各品种，绿色芽点形成率均在90％以上。

表1在添加0.1mg/LTDZ和2mg/L2，4-D的培养基上培养2周后，子叶节外植体形成丛生芽点的频率

品种	鲁花11号	花育20号	花育22号	花育25号
					丛生芽点形成率(％)	93.5	91.7	93.2	94.3

(3)在丛生芽点诱导培养基上培养2周后，将形成芽点的子叶节外植体转移到植株再生培养基上进行培养，培养条件为培养室温度26±1℃，光照强度2000Lx，每日早晨6点至晚上7点光照13小时。

转移到植株再生培养基上后丛生芽点进一步分化，4周后长成植株，见图5，植株再生率列于表2，供试的4个品种丛生芽点的外植体再生植株的形成率均达到100％。每个子叶节外植体再生植株数20以上。

表2在添加0.01mg/L TDZ的植株再生培养基上培养4周后，再生植株的形成率

5、砧木的准备：

(1)以珍珠岩作为砧木种子催芽的无菌培养基质，珍珠岩装于培养瓶中，加入MS液体培养基后高压灭菌；

(2)选择成熟饱满的花生种子，首先在75％乙醇中浸泡1min，然后在0.1％升汞中浸泡15min或0.2％次氯酸钠溶液中浸泡11min，最后用灭菌的蒸馏水洗涤4～5次除去残留的消毒剂。

(3)经表面消毒后，将种子接种于灭菌的盛有珍珠岩的培养瓶中，播种深度2cm，在培养室温度26±1℃，光照强度2000Lx，每日早晨6点至晚上7点光照13小时的条件下催芽。

由于珍珠岩保水能力强，培养2天后种子已发芽，见图6，培养7天后真叶展开，下胚轴达3cm，根系发达，见图7、图8，便可作为砧木进行嫁接。并且由于珍珠岩为颗粒状，种子播种于其中，长出的根不缠绕，实生苗很容易提出，不伤根，有利于嫁接苗的移栽成活和生长。

6、再生苗无菌嫁接及移栽田间：

(1)以再生植株作为接穗，在灭菌的珍珠岩中催芽6-8日龄的花生种子实生苗作为砧木进行无菌嫁接，见图9；

(2)嫁接苗再返回盛有珍珠岩的培养瓶中，见图10，在培养室培养3-5天，使伤口愈合。调查培养瓶中嫁接苗成活率达100％。

(3)培养瓶开瓶口炼苗1天后，移栽塑料大棚或温室或田间。移栽初期10天用地膜覆盖保持水分，上午10点至下午4点加盖遮阴网，之后按常规管理。移栽3周后观察，所有移栽的嫁接苗100％成活，见图11。收获期观察100％的嫁接苗结果，见图12。

实施例2

本实施例花生植株再生方法具体包括以下步骤：

1、制备丛生芽点形成培养基：

选取MS为基本培养基，在所述基本培养基中添加TDZ和2，4-D制成丛生芽点诱导培养基，TDZ的添加量为所述基本培养基中添加0.1～0.2mg/L，2，4-D的添加量为所述基本培养基中添加1～3mg/L，本实施例中丛生芽点形成培养基为MS+0.2mg/L TDZ+3mg/L 2，4-D+0.8％琼脂+3％蔗糖，pH调至5.8。

2、制备植株再生培养基：

选取MS为基本培养基，在所述基本培养基中添加TDZ制成植株再生培养基，TDZ的添加量为所述基本培养基中添加0.01～0.05mg/L，本实施例中植株再生培养基为MS+0.02mg/LTDZ+0.8％琼脂+3％蔗糖，pH调至5.8。

3、选择外植体材料：

供试材料为目前广泛推广栽培的花生品种鲁花11号、花育20号、花育22号、花育25号，选取各品种成熟饱满的种子去种胚后的子叶节作为试验材料。

4、丛生芽点诱导及植株再生：

(1)选取饱满花生种子首先在75％乙醇中浸泡1min，然后在0.1％升汞中浸泡15min或0.2％次氯酸钠溶液中浸泡10分钟，最后用灭菌的蒸馏水洗涤4～5次除去残留的消毒剂，将种子在灭菌的蒸馏水中浸泡2～3小时。

(2)从灭菌的蒸馏水中取出种子剥去种皮，去除种胚，靠近子叶节的位置从子叶上横切1/5～1/3(根据大小)，放入丛生芽点诱导培养基上培养。培养条件为培养室温度26±1℃，光照强度1000～2000Lx，每日早晨6点至晚上7点光照13小时。

在丛生芽点诱导培养基上培养1周后子叶节外植体变为绿色，培养2周后外植体开始形成绿色丛生芽点。统计丛生芽点形成率，见表3，供试的4各品种，绿色芽点形成率均在90％以上。

表3在添加0.2mg/LTDZ和3mg/L 2，4-D的培养基上培养2周后，子叶节外植体形成丛生芽点的频率

品种	鲁花11号	花育20号	花育22号	花育25号
					丛生芽点形成率(％)	90.2	91.3	92.0	93.2

(3)在丛生芽点诱导培养基上培养2周后，将形成芽点的子叶节外植体转移到植株再生培养基上进行培养，培养条件为培养室温度26±1℃，光照强度2000Lx，每日早晨6点至晚上7点光照13小时。

转移到植株再生培养基上后丛生芽点进一步分化，4周后长成植株，植株再生率列于表4，供试的4个品种形成丛生芽点的外植体再生植株的频率均达到100％。每个子叶节外植体再生植株数20以上。

表4在添加0.02mg/LTDZ的植株再生培养基上培养4周后，植株再生率

品种	鲁花11号	花育22号	花育25号	潍花8号
					植株再生率(％)	100	100	100	100

5、砧木的准备：

(1)以珍珠岩作为砧木种子催芽的无菌培养基质，珍珠岩装于培养瓶中，加入MS液体培养基后高压灭菌；

(2)选择成熟饱满的花生种子，首先在75％乙醇中浸泡1min，然后在0.1％升汞中浸泡15min或0.2％次氯酸钠溶液中浸泡10分钟，最后用灭菌的蒸馏水洗涤4～5次除去残留的消毒剂。

(3)经表面消毒后，将种子接种于灭菌的盛有珍珠岩的培养瓶中，播种深度2cm，在26±1℃，2000Lx，每日早晨6点至晚上7点光照13小时的条件下催芽。

6、再生苗无菌嫁接及移栽田间：

(1)以再生植株作为接穗，在灭菌的珍珠岩中催芽6-8日龄的花生种子实生苗作为砧木进行无菌嫁接；

(2)嫁接苗再返回盛有珍珠岩的培养瓶中，在培养室培养3-5天，使伤口愈合。调查培养瓶中嫁接苗成活率达100％。

(3)培养瓶开瓶口炼苗1天后，移栽塑料大棚或温室或田间。移栽初期10天用地膜覆盖保持水分，上午10点至下午4点加盖遮阴网，之后按常规管理。移栽3周后观察，所有移栽的嫁接苗100％成活。收获期观察100％的嫁接苗结果。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (6)

1.一种花生植株再生方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

（1）制备丛生芽点诱导培养基：选取MS为基本培养基，在所述基本培养基中添加0.1～0.2mg/L 的TDZ和1～3mg/L 的2,4-D制成丛生芽点诱导培养基；

制备植株再生培养基：选取MS为基本培养基，在所述基本培养基中添加0.01～0.05mg/L 的TDZ制成植株再生培养基；

（2）选择外植体材料：花生种子去种胚后的子叶节为外植体材料；

（3）丛生芽点诱导及植株再生：

a将花生种子进行消毒，用无菌水清洗后，将种子浸泡在无菌水中；

b从无菌水中取出种子剥去种皮，去除种胚，从子叶上靠近子叶节的位置横切1/5~1/3放入丛生芽点诱导培养基上，培养2周后，外植体形成了芽点；

c将形成芽点的外植体，转移到植株再生培养基上进行培养，长成再生植株；

（4）砧木的准备：

a以珍珠岩作为砧木种子催芽的无菌培养基质，加入MS液体培养基后高压灭菌；

b将花生种子消毒，用无菌水清洗后，接种于培养基，催芽6~8日得到花生种子实生苗；

（5）再生苗无菌嫁接及移栽：

a以再生植株作为接穗，花生种子实生苗作为砧木进行无菌嫁接；

b将嫁接苗再返回盛有珍珠岩的培养基中，培养3-5天，使伤口愈合；

c炼苗1~2天后，移栽塑料大棚、温室或田间。

2.根据权利要求1所述的花生植株再生方法，其特征在于：所述步骤（3）中花生种子消毒采用的是75%的乙醇浸泡50~70s，再用0.1%升汞中浸泡14-16 min或用0.2%次氯酸钠溶液中浸泡11~12min。

3.根据权利要求1所述的花生植株再生方法，其特征在于：所述步骤（3）中在温度为24~26℃、光照强度为1500~2500Lx、光照时间为每日光照13小时的培养条件下培养。

4.根据权利要求3所述的花生植株再生方法，其特征在于：光照时间为从早晨6点至晚上7点。

5.根据权利要求1所述的花生植株再生方法，其特征在于：所述步骤（4）中消毒后的种子接种于灭菌的盛有珍珠岩的培养瓶中，播种深度2cm，在温度26±1℃，光照强度2000Lx，每日早晨6点至晚上7点光照13小时的条件下催芽。

6.根据权利要求1所述的花生植株再生方法，其特征在于：所述步骤（5）中培养瓶开瓶口炼苗1天后，移栽塑料大棚或温室或田间，移栽初期10天用地膜覆盖保持水分，上午10点至下午4点加盖遮阴网。