CN108353790A - 一种花生高油品种的培育方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种花生高油品种的培育方法，主要步骤是将苗龄5～7天的花生幼叶培养在添加NAA、BAP和平阳霉素的诱导和诱变培养基上进行离体诱变培养；将存活的外植体转移到添加BAP和羟脯氨酸的不定芽分化和高油体定向筛选培养基上进行培养；获得的高油苗经无菌嫁接后移栽塑料大棚或高温棚，获得正常种子；高油体后代采用系普法选育，结合海南加代和高温棚加代，每年可以种植3代。本发明利用离体诱变和离体定向筛选高油体，可以解决常规诱变育种中诱变频率低、无法定向育种的难题；培养基中定向筛选高油体，非高油体被淘汰，可以解决突变体后代鉴定耗费大量人力物力和财力的问题。

Description

一种花生高油品种的培育方法
技术领域
本发明属于花生育种领域，尤其涉及一种花生高油品种的培育方法。
背景技术
花生是我国第二大油料作物，作为油用品种，含油率每提高1个百分点，可增加纯利润7％，因此广大花生育种家们把培育高油花生新品种作为主要的育种目标之一。然而由于花生遗传多样性差，缺乏高油种质资源，杂交育种难以获得高油后代，因此高产高油品种的选育一直是一个难以解决的问题。诱变技术的利用能够引起基因突变或染色体变异，从而获得自然界不存在或极为罕见的新性状、新类型。然而突变体后代的鉴定需要耗费大量的人力物力和财力。离体诱变结合离体定向筛选高油体，可在培养基上进行诱变和筛选，淘汰非高油体，解决突变体后代鉴定需要耗费大量人力物力财力的问题，并且诱变和筛选不受时间和空间限制。因此，离体诱变定向筛选高油体是培育高油新品种的有效手段。
李冠等(农业生物技术，May 25,2017,33(5):766-774)利用离体诱变培育花生新品种宇花4号，公开了一种培育花生新品种的方法，该方法中使用含平阳霉素培养基进行诱变，之后使用HYP定向筛选，但是该方法在筛选时需要在筛选培养基与恢复培养基上交替进行，同时移栽至大田前需要在驯化室培养3个周后再移栽田间，驯化室培养3周期间，小苗生长缓慢、且容易染菌、耗费人力物力，占用实验室空间，同时，驯化室培养过程影响生长。
发明内容
本发明目的是克服上述现有技术的不足，提供一种花生高油品种的培育方法，可以解决常规育种中难以培育高产高油花生品种的问题。
为达到解决上述问题的目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
一种花生高油品种的培育方法，具体步骤如下：
(1)选取成熟饱满的花生种子在液体培养基中催芽，所述液体培养基为MS基本培养基；
(2)取苗龄5～7天的未展开的幼叶作为外植体，接种到诱导及诱变培养基中，进行培养3个周，部分外植体形成芽点；所述诱导培养基以MSB5(MS无机盐+B5有机成分)培养基为基本培养基，添加1～3mg/LNAA、5～7mg/L BAP和5～6mg/L平阳霉素；
(3)存活的外植体转移至不定芽分化及筛选培养基上培养，进行高油定向筛选，得到抗性苗(高油苗)；所述不定芽分化及筛选培养基以MSB5培养基为基本培养基，并添加2～4mmol/L羟脯氨酸和3～5mg/L BAP；
(4)抗性小苗生长至1～1.5cm时，便可进行无菌嫁接，以高油苗为接穗，灭菌的沙子中催芽萌发的花生实生苗为砧木，嫁接苗再栽植于灭菌的沙子中无菌培养3～5天；
(5)嫁接苗炼苗1-2天，直接移栽塑料大棚或高温棚后，用地膜覆盖其上，1个周后撤掉地膜，获得成熟种子；
(6)高油苗后代采用系谱育种法选育，结合海南加代和高温棚加代，每年可以种植3代，缩短育种年限3～4年；
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：
1、本发明利用苗龄5～7天的未展开的幼叶作为外植体，在添加1～3mg/LNAA、5～7mg/LBAP和5～6mg/L平阳霉素的培养基上进行诱变处理，存活的外植体转移到添加2～4mmol/L羟脯氨酸和3～5mg/LBAP的培养基上诱导不定芽分化，同时进行高油定向筛选，筛选过程无需更换培养基，减少了更换培养基的操作次数，减少了材料被污染的可能，同时节省了人力物力。获得的高油苗经嫁接移栽塑料大棚，高油苗后代采用系普法结合海南和高温棚加代，育成了3个高油花生新品种，其中1个是目前我国含油率最高的品种。
2、本发明以无菌萌发的花生幼叶作为诱变材料可不受季节限制，常年可以进行诱变处理和定向筛选，操作方便。可以创造和筛选花生高油新种质，直接培育高产高油花生新品种，克服因花生栽培种中缺乏高油种质资源而使得高产高油新品种选育难以突破的困难。利用幼叶做为外植体，不但幼叶分化程度低再生能力强，并且幼叶容易切割，操作简单。
3、本发明利用离体诱变结合组织培养定向筛选高油苗，筛选过程于培养基中进行，大量不具有抗性的培养材料被淘汰，可节省因突变体后代鉴定需要耗费大量人力、物力、财力的问题；高油苗的再生是通过器官发生途径，首先形成芽点，然后由芽点形成不定芽，每个外植体可形成20～40个不定芽，再生频率高，经筛选获得高油苗的几率提高。
4、本发明中嫁接苗移栽塑料大棚后，平种(不起垄)，用地膜直接覆盖其上，可以充分保持湿度，因为嫁接苗在空气湿度不足时容易失水而不能成活。并且直接覆盖地膜可以缩短缓苗期，小苗生长快且健壮。
5、本发明获得的高油苗后代，采用系谱法选育，结合海南加代和高温棚加代，每年可种植3代，缩短育种年限3-4年，大大提高育种效率。
附图说明
图1是本发明离体诱变及离体定向筛选；a：形成芽点的石蜡切片(似线状的深色部分为微管组织结节，顶部细胞非常致密的部分是形成的芽点)；b：形成的芽点；c:羟脯氨酸筛选培养基上形成的不定芽及褐化的外植体；d：定向筛选获得的高油苗；
图2是本发明培育的高产高油花生品种图，其中左侧图为宇花9号、中间图为宇花14号、右侧图为宇花16号。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。此外相关领域的普通技术人员对本发明做的任何改动，凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
实施例1
本发明所述一种花生高油品种的培育方法，包括如下步骤：
1、催芽培养基的配制
选用MS培养基，培养瓶中加脱脂棉作为支撑，做成液体培养基，即MS+30g/L蔗糖。将所述体催芽培养基的pH调至5.8，在培养室温度为25～27℃、光照强度为2000～3000Lx、每日光照为12～14h的条件下进行培养，促使种子萌发。
2、诱变及诱导培养基的制备
选用MSB5(MS无机成分+B5有机成分)培养基为基本培养基，在此MSB5培养基中添加萘乙酸(NAA)、6-苄氨基嘌呤(BAP)和平阳霉素形成诱变及诱导培养基。平阳霉素的添加量为5～6mg/L，NAA添加量为1～3mg/L，BAP添加量为5～7mg/L。本实施例中诱变及诱导培养基为MSB5+1mg/LNAA+6mg/L BAP+5.5mg/L平阳霉素+30g/L蔗糖+8g/L琼脂；将所述诱变及诱导培养基的pH调至5.8，在培养室温度为25～27℃、光照强度为2000～3000Lx、每日光照为12～14h的条件下进行培养，诱导愈伤组织和芽点的形成，同时诱导基因突变或染色体变异。
3、不定芽分化及高油苗定向筛选培养基的制备
选用MSB5培养基为基本培养基，在此MSB5培养基中添加羟脯氨酸和BAP形成不定芽分化及高油定向筛选培养基，羟脯氨酸的添加量为2～4m mol/L，BAP的添加量为3～5mg/L。本实施例中不定芽分化及高油定向筛选培养基为MS+3m mol/L羟脯氨酸+4mg/LBAP+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，将所述不定芽分化及高油苗定向筛选培养基的pH调至5.8，在培养室温度为25～27℃、光照强度为2000～3000Lx、每日光照为12～14h的条件下进行培养，促使芽点分化形成不定芽，同时进行高油定向筛选。
NAA是一种人工合成的广谱植物生长调节剂，具有调节生长、促进生根、抽芽、开花、防止落花落果等作用，本发明中用来与BAP共同作用诱导芽点形成。BAP是一种人工合成的嘌呤类植物生长调节剂，可促进细胞分裂、组织分化、种子发芽、侧芽生长等，本发明中也用来诱导芽点形成和不定芽分化。本发明中利用脯氨酸的类似物羟脯氨酸作为筛选剂，能忍耐极限浓度的羟脯氨酸，必定相关基因发生了突变，使得被筛选物体内脯氨酸含量提高。花生是油料作物，脯氨酸降解会参与到脂肪合成。本发明中筛选培养基中添加羟脯氨酸，可筛选高油体。
4、离体诱变培养
选取籽仁饱满的花育20号种子在超净工作台内置于75％的酒精浸泡20s，再用0.1％的升汞浸泡20min，进行表面消毒，用无菌水漂洗5次后，置于脱脂棉支撑的MS液体培养基中催芽。取苗龄5～7天的未展开的幼叶作为外植体，切成大约1mm×1mm，接种到诱导及诱变培养基中培养，培养1w后幼叶外植体开始伸展，边缘加厚，并开始形成愈伤组织。2w后外植体边缘切口处开始出现黄绿色微小芽点，如图1a和b所示。但随着诱变培养时间的延长，部分外植体逐渐褐化，3周后，约50％的外植体褐化，其他部分形成芽点。
花育20号是山东省花生研究所育成的小粒花生品种，是目前全国区域试验和山东省区域试验小粒组对照品种。
5、高油苗的定向筛选
上述幼叶诱变培养3周后，将存活的外植体转移到不定芽分化及高油苗定向筛选培养基上促使芽点分化不定芽，并进行定向筛选高油体。存活的外植体转移到不定芽分化及高油苗定向筛选培养基上后，部分芽点分化形成不定芽，如图1c所示。但随着筛选培养时间延长，外植体逐渐褐化，培养材料一直在不定芽分化及高油苗定向筛选培养基上培养，直到耐性苗长到1～1.5cm，最终获得了花育20号羟脯氨酸耐性苗(高油体)，如图1d所示。
6、高油体的嫁接与移栽
(1)嫁接砧木的准备及无菌嫁接
选用沙子作为催芽基质，将沙子盛于培养瓶中，加适量水后进行高压灭菌。
选用花育20号籽粒饱满的种子进行表面消毒后，种植于上述灭菌的沙子中，在培养室温度为25～27℃、光照强度为2000～3000Lx、每日光照为12～14h的条件下进行培养，12天后砧木种子发芽、下胚轴伸长，便可进行嫁接。
将上述花育20号诱变及定向筛选获得的高油苗作为接穗，无菌催芽的花育20号实生苗作为砧木，砧木嫁接口在子叶节以下的下胚轴，采用插接法进行嫁接后，用封口膜将嫁接口封好，防止失水，也使接口紧密接触。
(2)嫁接苗驯化移栽
将上述嫁接苗再栽植于灭菌的沙子中，在培养室温度为25～27℃、光照强度为2000～3000Lx、每日光照为12～14h的条件下培养5天。打开瓶盖少许进行驯化2天后，直接移栽高温棚，平种，浇足水，行距40～50cm，株距18-25cm。嫁接苗移栽塑料大棚后，用地膜覆盖，移栽初期1个周上午9点到下午4点盖遮阴网，防止太阳直晒，之后撤掉地膜。按常规方法管理，最终获得了种子。
7、高油品种选育
上述嫁接的高油苗结的种子，其后代采用系谱育种法进行选育，从M2代分离世代开始选择单株，其后各世代以入选单株为单位分系种植。
具体为：11月上旬将收获的嫁接高油苗结的种子在三亚种植，次年(第二年)2月下旬收获时选择单株。3月上旬将海南收获的单株按株行种植于高温棚，6月下旬收获时继续选择单株。7月上旬将收获的单株再次播种于高温棚，10月下旬收获时再继续选择单株。11月上旬将选择的单株再在三亚种植，次年(第三年)2月下旬收获时继续选择单株。将海南收获的单株在试验大田种成株系(M6代)，按正常栽培措施进行播种和田间管理，收获期进行测产，表现产量高、抗病性强、株高和分枝数等符合育种要求的性状基本稳定一致的株系，混收单株形成新品系。采用近红外仪测定含油率，所有品系含油率均高于诱变亲本花育20号。11月上旬将收获的新品系的种子在三亚繁种，次年(第四年)成熟后混收荚果。将海南混收的种子，在试验大田按正常栽培管理进行产量品比试验。第五年再进行一年品比试验。两年品比试验表现产量高、含油率高、抗逆性强的品系，参加省区域试验。
8、高产高油品种特性
以目前主栽小粒花生品种花育20号为诱变亲本，利用平阳霉素离体诱变和羟脯氨酸离体定向筛选，经系谱法选择，育成了3个高产、高油、早熟、小粒花生新品种，主要特性如下：
(1)宇花9号，株型直立、疏枝，连续开花，如图2左侧图所示。株茎高37.4cm，侧枝长40.7cm，有效枝长7.5cm，有效分枝数6～7条，总分枝数7～8条。荚果普通形，缢缩极浅，果嘴不明显，网纹浅。籽仁桃形，种皮粉红色，内种皮白色。百果重172.9g,百仁重70.9g，出米率75.82％。籽仁蛋白含量26.03％，油酸含量41.74％，亚油酸含量38.3％。2017年山东省区域试验，荚果产量比对照花育20号(诱变亲本)增产7.67％。经农业部油料及制品质量监督检验测试中心检验，籽仁含油率高达61.05％，如表1所示，比诱变亲本花育20号高11.55个百分点，是目前我国花生含油率最高的品种。
(2)宇花14号，株型直立、疏枝，连续开花，如图2中间图所示。主茎高36.4厘米，侧枝长39.6厘米，总分枝数8.7条，结果枝数6.2条。荚果普通形，缢缩中浅，果嘴秃，网纹较浅。百果重175.67克，百仁重68.88克，出仁率75.1％。籽仁蛋白含量28.11％，油酸含量41.48％，亚油酸含量33.84％。2017年参加辽宁省区域试验，在18个参试品种中籽仁产量名列第一，比对照白沙1016增产14.4％。经农业部油料及制品质量监督检验测试中心检验，籽仁含油率为59.32％，比诱变亲本花育20号高9.82个百分点。
(3)宇花16号，株型直立、疏枝，连续开花，如图2右侧图所示。主茎高37.5cm，侧枝长40.4cm，总分枝数8条，结果枝数6.5条。荚果蚕茧形，无果腰，网纹中浅。百果重174.44g，百仁重69.97g，出仁率74.21％。籽仁蛋白含量28.20％，油酸含量40.74％，亚油酸含量38.94％。2017年山东省区域试验，荚果产量比对照花育20号(诱变亲本)增产6.07％。经农业部油料及制品质量监督检验测试中心检测籽仁含油率为58.94％，比诱变亲本花育20号高9.44个百分点。
表1育成高油花生新品种及诱变亲本含油率
品种 含油率(％)
花育20号(CK) 49.50
宇花9号 61.05
宇花14号 59.32
宇花16号 58.94
注：①花育20号为诱变亲本，也是全国区试和山东省区试花生小粒组对照品种；
②含油率为农业部油料及制品质量监督检验测试中心检验结果
本发明利用花生幼叶作为诱变外植体，平阳霉素做为诱变剂进行离体诱变培养，以羟脯氨酸作为高油筛选的间接筛选压力，通过器官发生途径获得高油苗。高油苗经无菌嫁接移栽于高温棚，获得了正常成熟的种子。高油苗后代采用系谱法进行选择，结合海南加代和高温棚加代，每年可以种植3代，比常规育种缩短育种年限4年。从定向筛选获得的高油苗后代中直接培育出3个高产高油花生新品种，产量比对照高5％以上，含油率分别达到61.05％、59.32％和58.94％，分别比诱变亲本花育20号含油率(49.50％)高11.55、9.82、9.44个百分点。含油率61.05％是目前我国含油率最高的花生品种。

Claims (10)

1.一种花生高油品种的培育方法，其特征在于它包括如下步骤：
(1)选取成熟饱满的花生种子在液体培养基中催芽，所述液体培养基为MS基本培养基；
(2)取苗龄5～7天的未展开的幼叶作为外植体，接种到诱导及诱变培养基中培养3个周，部分外植体形成芽点；所述诱导及诱变培养基以MSB5(MS无机盐+B5有机成分)培养基为基本培养基，添加1～3mg/L NAA、5～7mg/L BAP和5～6mg/L平阳霉素；
(3)存活的外植体转移至不定芽分化及筛选培养基上培养，进行高油定向筛选，得到抗性苗(高油苗)；所述不定芽分化及筛选培养基以MSB5培养基为基本培养基，并添加2～4mmol/L羟脯氨酸和3～5mg/L BAP；
(4)体胚萌发长成的抗性小苗生长至1～1.5cm时，便可进行无菌嫁接，以高油苗为接穗，灭菌的沙子中催芽萌发的花生实生苗为砧木，嫁接苗再栽植于灭菌的沙子中无菌培养4～6天；
(5)嫁接苗炼苗1-2天后，直接移栽塑料大棚或高温棚，获得成熟种子；
(6)高油苗后代采用系谱育种法选育，结合海南加代和高温棚加代，每年可以种植3代。
2.根据权利要求1所述的一种花生高油品种的培育方法，其特征在于：所述步骤(1)中液体培养基中加脱脂棉作为支撑，成分为MS+30g/L蔗糖。
3.根据权利要求1所述的一种花生高油品种的培育方法，其特征在于：诱导及诱变培养基为MSB5+1～3mg/L NAA+5～7mg/L BAP+5～6mg/L平阳霉素+30g/L蔗糖+8g/L琼脂；
不定芽分化及高油苗定向筛选培养基为MS+2～4m mol/L羟脯氨酸+3～5mg/L BAP+30g/L蔗糖+8g/L琼脂。
4.根据权利要求1所述的一种花生高油品种的培育方法，其特征在于：所述步骤(1)、(2)和(3)中培养基pH调整至5.8，培养条件为：培养室温度为25～27℃、光照强度为2000～3000Lx、光照时间为12～14h/d。
5.根据权利要求1所述的一种花生高油品种的培育方法，其特征在于：所述步骤(4)中以苗龄10-12天的花生无菌苗为砧木，羟脯氨酸抗性苗为接穗，采用插接法在超净工作台内进行无菌嫁接。
6.根据权利要求1所述的一种花生高油品种的培育方法，其特征在于：所述步骤(5)中嫁接苗炼苗后，直接移栽到塑料大棚或高温棚，平种(即不起垄)，浇足水，行距40～50cm，株距18-25cm。
7.根据权利要求1所述的一种花生高油品种的培育方法，其特征在于：所述步骤(5)中嫁接苗移栽塑料大棚后，用地膜覆盖，移栽初期1个周上午9点到下午4点盖遮阴网，防止太阳直晒，之后撤掉地膜。
8.根据权利要求1所述的一种花生高油品种的培育方法，其特征在于：所述步骤(6)中高油苗的M2代分离世代开始选择单株，其后各世代以入选单株为单位分系种植，经过连续5～7代单株选择直至株系的性状稳定一致，将入选株系混收为新品系。
9.根据权利要求1所述的一种花生高油品种的培育方法，其特征在于：所述步骤(6)中海南加代是于每年的11月上旬在三亚种植，2月下旬收获，3月上旬种植于高温棚，6月下旬收获，7月上旬再次播种于高温棚，10月下旬收获。
10.根据权利要求1所述的一种花生高油品种的培育方法，其特征在于：所述步骤(6)中结合海南加代和高温棚加代，每年种植3代，如果休眠性强的材料，籽仁可用乙烯利处理，打破休眠。
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