CN108967196B - 一种油菜离体小孢子再生植株的培养方法 - Google Patents

一种油菜离体小孢子再生植株的培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于植物组织培养技术领域，公开了一种油菜离体小孢子再生植株的培养方法，所述方法利用一定浓度的秋水仙素溶液浸泡株高为15～25cm的水培法培养的再生植株根部，然后继续水培再生植株至移栽大田。水培后的所述再生植株粗壮，根系发达，根部活力强，用秋水仙素溶液浸根处理时，根系能充分均匀吸收秋水仙素成分，加倍效果好。本发明的培养方法，无需挖苗、洗根，全程无根系损伤，提高了再生植株的成活率，操作简单易行，易于实施，成本低，便于大规模生产应用。

Description

一种油菜离体小孢子再生植株的培养方法
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，涉及一种油菜离体小孢子再生植株的培养方法。
背景技术
我国是世界油料消费大国，国产食用植物油供给长期严重不足，进口压力居高不下，安全隐患日益凸现。油菜籽油是国产食用植物油的第一大来源，占国内油料作物产油量的50％以上，因此，油菜种业的稳定健康发展，是我国植物油供给安全的重要保障。
油菜种业的高产优质发展离不开优良品种的支撑，在油菜新品种的研究及开发中，小孢子培养技术发挥着至关重要的作用，能快速纯合各种优良性状，加快育种进程，是油菜育种的重要途径。一般而言，在植物界由小孢子形成的再生植株群体中，仅有极少数可自然加倍形成双单倍体植株，绝大多数单倍体植株(Haploid plants，简称H植株)不能自然加倍成为双单倍体植株(Double haploid plants，简称DH株)，使其不能正常开花结籽和配制杂交种，达不到育种的需求。因此，研究单倍体植株如何高频率二倍化成为小孢子培养技术在油菜遗传和育种中成功应用的重要技术问题。
现有技术中，油菜离体小孢子单倍体再生植株的加倍方法主要有三种：(1)秋水仙素处理离体小孢子；(2)秋水仙素处理小孢子再生植株的顶芽、腋芽；(3)秋水仙素浸泡小孢子再生植株的根部。这三种方式中，秋水仙素的浸根加倍法加倍率最高，但传统浸根加倍法需要先将单倍体植株从土壤中挖出来，洗净根部泥土后用一定浓度的秋水仙素溶液浸根2～6h，然后再用清水冲洗根部后移栽土壤中，操作繁琐，尤其是大规模处理时，挖苗、洗根、移栽等工作量非常庞大；其次，挖苗及移栽过程中，容易损伤根系，进而会对植株的生长带来十分不利的影响。
发明内容
因此，本发明旨在提供一种易于操作、成本低且加倍率高的油菜离体小孢子再生植株的培养方法。
为此，本发明提供了一种油菜离体小孢子再生植株的培养方法，包括如下步骤：
(1)水培小孢子组培苗，得到株高为15～25cm的再生植株；
(2)用秋水仙素溶液对步骤(1)中的所述再生植株进行浸根处理；
(3)继续水培步骤(2)中的所述组培苗至移栽大田。
进一步地，所述水培的营养液为改良的霍格兰溶液，其配方为：5mmol/LKNO3；5mmol/L Ca(NO3)2·4H2O；1mmol/L KH2PO4；2mol/L MgSO4·7H2O；46μmol/LH3BO3；0.77μmol/L ZnSO4·7H2O；0.05mmol/L EDTA-Fe；0.37μmol/L NaMoO4·2H2O；0.32μmol/L CuSO4·5H2O；9.14μmol/LMnCl2·4H2O；所述营养液的pH为5.5～6.0。
进一步地，所述营养液每14～16天更换一次。
进一步地，所述水培在温度22～28℃、光照时间14～18h/d及光照强度4000～6000lx下进行。
进一步地，所述秋水仙素溶液的浓度为0.2～0.35wt％。
进一步地，所述浸根处理的时间为10～14h。
进一步地，所述小孢子组培苗的获得包括如下步骤：
(1)离体小孢子的制备：选取开花3～7天的油菜植株作为供体植株，从所述供体植株的主花序或一次分枝花序上取花蕾并灭菌，在灭菌后的花蕾中加入浓度为10～15wt％的蔗糖溶液，研磨成悬浮液，过滤所得滤液经离心、弃上清液即得所述离体小孢子；
(2)离体小孢子的培养：将步骤(1)中的所述离体小孢子移至NLN液体培养基中，于28～32℃下暗培养至肉眼可见胚状体，再在黑暗条件中于22～28℃下摇动培养至形成子叶形胚状体；
(3)子叶形胚状体的培养：将步骤(2)中的所述子叶形胚状体移至固体B5培养基中，在温度22～28℃、光照时间15～18h/d及光照强度4000～6000lx下培养，3～4周继代培养至形成不定芽苗，即得所述小孢子组培苗。
本发明的技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的油菜离体小孢子再生植株的培养方法，利用一定浓度的秋水仙素溶液浸泡株高为15～25cm的水培法培养的再生植株根部，然后继续水培再生植株至移栽大田，水培后的所述再生植株粗壮，根系发达，根部活力强，用秋水仙素溶液浸根处理时，根系能充分均匀吸收秋水仙素成分，加倍效果好。本发明的培养方法，无需挖苗、洗根，全程无根系损伤，提高了再生植株的成活率，操作简单易行，易于实施，成本低，便于大规模生产应用。
2.本发明提供的油菜离体小孢子再生植株的培养方法，所述水培营养液为改良的霍格兰溶液，其含有油菜生长发育所需的各类营养成分，有利于培养出具有发达根系的健壮植株，提高了植株对秋水仙素的吸收。
3.本发明提供的油菜离体小孢子再生植株的培养方法，选用特定浓度的秋水仙素溶液，既避免了高浓度的秋水仙素溶液妨碍植株生长，又避免了低浓度的秋水仙素溶液加倍效果不佳的缺陷。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
实施例1
本实施例1提供了一种油菜离体小孢子再生植株的培养方法，包括如下步骤：
(1)离体小孢子的制备
在油菜初花期(开花3～7天)，从田间选取生长健壮的植株作为供体植株，在其主花序或一次分枝花序上取2.5～3.5mm的花蕾备用。花蕾的发育时期可能会有稍许不同，可以剥开花蕾挑取小孢子进行镜检以确定发育时期，最佳时期为单核晚期至双核早期。用浓度为0.2wt％的次氯酸钠溶液灭菌处理花蕾表面15min，再用无菌水冲洗3次。将消毒过的花蕾置于50mL离心管中，加入5mL浓度为13wt％的蔗糖溶液，用灭菌玻璃棒将花蕾研碎，压出花粉小孢子，并经800目无菌尼龙网过滤到另一个50mL离心管中，1100rpm、离心5min，并重复2次，将离心管中的上层清液吸去，即得离体小孢子。
(2)离体小孢子的培养
将步骤(1)中所得的离体小孢子用NLN液体培养基稀释至10mL，并分装在培养皿中。30℃下暗培养至肉眼可见胚状体，再在25℃、黑暗条件中移至50rpm恒温摇床上进行摇动培养至形成子叶形胚状体。
(3)子叶形胚状体的培养
将步骤(2)中所得的子叶形胚状体移至固体B5培养基中，在25℃、光照时间16h/d及光照强度4000～6000lx下培养，25d后继代培养一次至形成不定芽苗，即得小孢子组培苗。
(4)水培育苗：将步骤(3)中所得的小孢子组培苗移栽到装有营养液的水培育苗盆中，于25℃、光照时间16h/d及光照强度4000～6000lx下进行水培育苗，每15天更换一次营养液，得到株高为21～25cm的再生植株。其中，水培营养液为改良的霍格兰溶液，其配方为：5mmol/L KNO3；5mmol/L Ca(NO3)2·4H2O；1mmol/L KH2PO4；2mol/L MgSO4·7H2O；46μmol/LH3BO3；0.77μmol/L ZnSO4·7H2O；0.05mmol/L EDTA-Fe；0.37μmol/L NaMoO4·2H2O；0.32μmol/L CuSO4·5H2O；9.14μmol/L MnCl2·4H2O；pH为5.8。
(5)浸根加倍处理
将步骤(3)所得的再生植株转移至浓度为0.3wt％的秋水仙素水溶液中，浸根处理12h后用清水洗净，并将处理后的的再生植株移回到之前的育苗盆中，继续培养，直至移栽大田。
(6)小孢子再生植株的移栽
移栽一般选择在每年的11月份，将基肥施入大田，完成大田的翻耕、开沟及作厢等工作，其中，厢面宽1.5m，行距30cm。均匀移栽小孢子再生植株，每行15株，移栽后，盖上遮阴网，前一个星期每天浇水，之后逐渐减少浇水次数，直到油菜植株能独立存活，最后拆去遮阳网。
(7)小孢子再生苗的套袋自交
在花期选择加倍成功的单株或分枝，进行套袋自交，于成熟期收获小孢子植株的种子，该种子可直接用于油菜高产优质品种的选育。
实施例2
本实施例2提供了一种油菜离体小孢子再生植株的培养方法，包括如下步骤：
(1)离体小孢子的制备
在油菜初花期(开花3～7天)，从田间选取生长健壮的植株作为供体植株，在其主花序或一次分枝花序上取2.5～3.5mm的花蕾备用。花蕾的发育时期可能会有稍许不同，可以剥开花蕾挑取小孢子进行镜检以确定发育时期，最佳时期为单核晚期至双核早期。用浓度为0.2wt％的次氯酸钠溶液灭菌处理花蕾表面15min，再用无菌水冲洗3次。将消毒过的花蕾置于50mL离心管中，加入5mL浓度为15wt％的蔗糖溶液，用灭菌玻璃棒将花蕾研碎，压出花粉小孢子，并经800目无菌尼龙网过滤到另一个50mL离心管中，1100rpm、离心5min，并重复2次，将离心管中的上层清液吸去，即得离体小孢子。
(2)离体小孢子的培养
将步骤(1)中所得的离体小孢子用NLN液体培养基稀释至10mL，并分装在培养皿中。32℃下暗培养至肉眼可见胚状体，再在28℃、黑暗条件中移至50rpm恒温摇床上进行摇动培养至形成子叶形胚状体。
(3)子叶形胚状体的培养
将步骤(2)中所得的子叶形胚状体移至固体B5培养基中，在28℃、光照时间15h/d及光照强度4000～6000lx下培养，28d后继代培养一次至形成不定芽苗，即得小孢子组培苗。
(4)水培育苗：将步骤(3)中所得的小孢子组培苗移栽到装有营养液的水培育苗盆中，于28℃、光照时间14h/d及光照强度4000～6000lx下进行水培育苗，每14天更换一次营养液，得到株高为18～22cm的再生植株。其中，水培营养液为改良的霍格兰溶液，其配方为：5mmol/L KNO3；5mmol/L Ca(NO3)2·4H2O；1mmol/L KH2PO4；2mol/L MgSO4·7H2O；46μmol/LH3BO3；0.77μmol/L ZnSO4·7H2O；0.05mmol/L EDTA-Fe；0.37μmol/L NaMoO4·2H2O；0.32μmol/L CuSO4·5H2O；9.14μmol/L MnCl2·4H2O；pH为5.8。
(5)浸根加倍处理
将步骤(3)所得的再生植株转移至浓度为0.35wt％的秋水仙素水溶液中，浸根处理10h后用清水洗净，并将处理后的再生植株移回到之前的育苗盆中，继续培养，直至移栽大田。
(6)小孢子再生植株的移栽
移栽一般选择在每年的11月份，将基肥施入大田，完成大田的翻耕、开沟及作厢等工作，其中，厢面宽1.5m，行距30cm。均匀移栽小孢子再生植株，每行15株，移栽后，盖上遮阴网，前一个星期每天浇水，之后逐渐减少浇水次数，直到油菜植株能独立存活，最后拆去遮阳网。
(7)小孢子再生苗的套袋自交
在花期选择加倍成功的单株或分枝，进行套袋自交，于成熟期收获小孢子植株的种子，该种子可直接用于油菜高产优质品种的选育。
实施例3
本实施例3提供了一种油菜离体小孢子再生植株的培养方法，包括如下步骤：
(1)离体小孢子的制备
在油菜初花期(开花3～7天)，从田间选取生长健壮的植株作为供体植株，在其主花序或一次分枝花序上取2.5～3.5mm的花蕾备用。花蕾的发育时期可能会有稍许不同，可以剥开花蕾挑取小孢子进行镜检以确定发育时期，最佳时期为单核晚期至双核早期。用浓度为0.2wt％的次氯酸钠溶液灭菌处理花蕾表面15min，再用无菌水冲洗3次。将消毒过的花蕾置于50mL离心管中，加入5mL浓度为15wt％的蔗糖溶液，用灭菌玻璃棒将花蕾研碎，压出花粉小孢子，并经800目无菌尼龙网过滤到另一个50mL离心管中，1100rpm、离心5min，并重复2次，将离心管中的上层清液吸去，即得离体小孢子。
(2)离体小孢子的培养
将步骤(1)中所得的离体小孢子用NLN液体培养基稀释至10mL，并分装在培养皿中。28℃下暗培养至肉眼可见胚状体，再在22℃、黑暗条件中移至50rpm恒温摇床上进行摇动培养至形成子叶形胚状体。
(3)子叶形胚状体的培养
将步骤(2)中所得的子叶形胚状体移至固体B5培养基中，在22℃、光照时间18h/d及光照强度4000～6000lx下培养，21d后继代培养一次至形成不定芽苗，即得小孢子组培苗。
(4)水培育苗：将步骤(3)中所得的小孢子组培苗移栽到装有营养液的水培育苗盆中，于22℃、光照时间18h/d及光照强度4000～6000lx下进行水培育苗，每16天更换一次营养液，得到株高为15～20cm的再生植株。其中，水培营养液为改良的霍格兰溶液，其配方为：5mmol/L KNO3；5mmol/L Ca(NO3)2·4H2O；1mmol/L KH2PO4；2mol/L MgSO4·7H2O；46μmol/LH3BO3；0.77μmol/L ZnSO4·7H2O；0.05mmol/L EDTA-Fe；0.37μmol/L NaMoO4·2H2O；0.32μmol/L CuSO4·5H2O；9.14μmol/L MnCl2·4H2O；pH为5.8。
(5)浸根加倍处理
将步骤(3)所得的再生植株转移至浓度为0.2wt％的秋水仙素水溶液中，浸根处理14h后用清水洗净，并将处理后的再生植株移回到之前的育苗盆中，继续培养，直至移栽大田。
(6)小孢子再生植株的移栽
移栽一般选择在每年的11月份，将基肥施入大田，完成大田的翻耕、开沟及作厢等工作，其中，厢面宽1.5m，行距30cm。均匀移栽小孢子再生植株，每行15株，移栽后，盖上遮阴网，前一个星期每天浇水，之后逐渐减少浇水次数，直到油菜植株能独立存活，最后拆去遮阳网。
(7)小孢子再生苗的套袋自交
在花期选择加倍成功的单株或分枝，进行套袋自交，于成熟期收获小孢子植株的种子，该种子可直接用于油菜高产优质品种的选育。
对比例1
本对比例提供了一种油菜离体小孢子再生植株的培养方法，所述方法同实施例1，不同之处在于，本对比例中，将得到的小孢子组培苗置于固体B5培养基上培养，培养的时间同实施例1中水培育苗的时间。
对比例2
本对比例提供了一种油菜离体小孢子再生植株的培养方法，所述方法同实施例2，不同之处在于，本对比例中，将得到的小孢子组培苗置于固体B5培养基上培养，培养的时间同实施例2中水培育苗的时间。
对比例3
本对比例提供了一种油菜离体小孢子再生植株的培养方法，所述方法同实施例3，不同之处在于，本对比例中，将得到的小孢子组培苗置于固体B5培养基上培养，培养的时间同实施例3中水培育苗的时间。
对比例4
本对比例提供了一种油菜离体小孢子再生植株的培养方法，其制备方法同实施例1，不同之处在于，本对比例中，用秋水仙素溶液处理株高为10～14cm的再生植株。
实验例1
分别观察实施例1-3中水培及对比例1-3中固体B5培养基培育的小孢子再生植株的生长情况，并各分别取30株培育了30天的再生植株，测定各再生植株的株高、根茎粗、总根长、根表面面积、根鲜重及生物量，并计算各项的平均值，计算结果见下表所示。
表1各再生植株的生长情况
Figure BDA0001757083120000111
由上表1中的数据对比可发现，同样的条件下，较普通的B5固体培养基，采用本发明的水培法得到的再生植株更粗壮，根系更发达，生物量更高。
实验例2
分别对实施例1-3及对比例1-4中小孢子再生植株的倍性进行鉴定，根据植株形态判断染色体是否加倍。由于单倍体植株花瓣小，雄蕊无花粉。因此，凡花瓣大小和花粉量多少与正常二倍体品种相当的植株可初定为染色体已加倍的植株，结果如下表2所示。
表2秋水仙素不同处理的染色体加倍效果
Figure BDA0001757083120000121
其中，加倍率＝(再生DH株株数/再生植株总数)×100％；DH株代表双单倍体植株。
由上表2中的数据对比可发现，采用本发明的方法，小孢子再生植株的成活率及加倍率均有明显提升。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举，而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (6)

1.一种油菜离体小孢子再生植株的培养方法，包括如下步骤：
（1）水培小孢子组培苗，得到株高为15～25m的再生植株；所述水培的营养液为改良的霍格兰溶液，其配方为：5mmol/L KNO3；5mmol/L Ca(NO3)2·4H2O；1mmol/L KH2PO4；2mol/LMgSO4·7H2O；46μmol/L H3BO3；0.77μmol/L ZnSO4·7H2O；0.05mmol/L EDTA-Fe；0.37μmol/LNaMoO4·2H2O；0.32μmol/L CuSO4·5H2O；9.14μmol/L MnCl2·4H2O；所述营养液的pH为5.5～6.0；
（2）用秋水仙素溶液对步骤（1）中的所述再生植株进行浸根处理；
（3）继续水培步骤（2）中的所述再生植株至移栽大田。
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述营养液每14～16天更换一次。
3.根据权利要求1-2任一项所述的培养方法，其特征在于，所述水培在温度22～28℃、光照时间14～18h/d及光照强度4000～6000lx下进行。
4.根据权利要求1-2任一项所述的培养方法，其特征在于，所述秋水仙素溶液的浓度为0.2～0.35wt%。
5.根据权利要求1-2任一项所述的培养方法，其特征在于，所述浸根处理的时间为10～14h。
6.根据权利要求1-2任一项所述的培养方法，其特征在于，所述小孢子组培苗的获得包括如下步骤：
（1）离体小孢子的制备：选取开花3～7天的油菜植株作为供体植株，从所述供体植株的主花序或一次分枝花序上取花蕾并灭菌，在灭菌后的花蕾中加入浓度为10～15wt%的蔗糖溶液，研磨成悬浮液，过滤所得滤液经离心、弃上清液即得所述离体小孢子；
（2）离体小孢子的培养：将步骤（1）中的所述离体小孢子移至NLN液体培养基中，于28～32℃下暗培养至肉眼可见胚状体，再在黑暗条件中于22～28℃下摇动培养至形成子叶形胚状体；
（3）子叶形胚状体的培养：将步骤（2）中的所述子叶形胚状体移至固体B5培养基中，在温度22～28℃、光照时间15～18h/d及光照强度4000～6000lx下培养，3～4周继代培养至形成不定芽苗，即得所述小孢子组培苗。
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