CN109717075A - 一种通过诱导不定芽获得大花萱草再生植株的方法 - Google Patents
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Abstract
一种通过诱导不定芽获得大花萱草再生植株的方法，以大花萱草的根茎幼芽为外植体材料，直接诱导产生不定芽，切分成单株进行增殖培养，获得丛生芽，将丛生芽切分成单株，去除不定芽、愈伤组织及多余的底盘，进行生根培养，得到生根苗，再进行炼苗、移栽，获得大花萱草再生植株。该方法操作简单，缩短了诱导及繁育时间，诱导率高，诱导时间短，生根率高，移栽成活率高，获得的再生植株能够稳定保持母本优良性状，克服了通过愈伤组织途径中后代植株出现变异的弊端，实现大花萱草组培苗的直接再生，是大花萱草工厂化生产的有效途径。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种通过诱导不定芽获得大花萱草再生植株的方法。
背景技术
萱草(Hemerocallis)又称金针、忘忧草、黄花菜、宜男草、疗愁等，是百合科萱草属多年生宿根草本花卉，其形态优美、花色繁多、生长健壮、适应广泛等优点，是庭院、花坛、以及街道绿化中重要的花卉。
大花萱草(Hemerocallis fulva)也称多倍体萱草、一日花，是在萱草的基础上，经过处理的多倍体矮生品种。萱草的繁殖方法主要有种子育苗法、茎芽扦插繁殖法、分株繁殖法、组织培养法。
播种繁殖出的实生苗更能适应较寒冷的气候，但生产周期长，且后代容易发生分离、变异、退化，目前主要用于新品种选育。茎芽扦插繁殖方法操作简单，成本低，周期也较短，但各品种的生根率存在较大的差异，其整体的生根数量较少。分株繁殖法是传统上最常用的方法，后代植株能保持母本性状，但1株萱草每年只能繁殖4-5株，整体繁殖系数较低，不适应大规模的商业生产。而利用植物组织培养法，仅需用少量的植物材料，就可以在短时间内获取大量的、保持繁殖品种本身所具有的优良性状的种苗，是工厂化育苗的重要途径。
目前，国内外很多学者对大花萱草离体培养进行了研究，一般通过诱导愈伤组织的途径再生完整植株，建立其再生体系，其外植体材料选择相当丰富，有花茎、子房、花瓣、花托、花丝、花蕾、叶片、原生质体等。
但是，通过愈伤组织途径获得的植株，随着继代次数增加，染色体数目、DNA含量、DNA多态性片段比例会出现不同程度的变异，而利用大花萱草组织直接诱导不定芽的研究报道极少。
发明内容
本发明的目的在于提供一种通过诱导不定芽获得大花萱草再生植株的方法，该方法操作简单，缩短了诱导及繁育时间，诱导率高、诱导时间短，诱导率可达560％，诱导时间可缩短至35天左右，生根率可达100％，移栽成活率可达100％，获得的再生植株能够稳定保持母本优良性状，克服了通过愈伤组织途径中后代植株出现变异的弊端，实现大花萱草组培苗的直接再生，是大花萱草工厂化生产的有效途径。
为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种通过诱导不定芽获得大花萱草再生植株的方法，包括以下步骤：
1)外植体选择、预处理
选取长度为1-2cm的根茎幼芽作为外植体，去除根系及叶片，消毒，无菌水浸洗，吸干水分，除去基部老化组织；
2)诱导不定芽
将经过预处理的外植体，接种于诱导培养基中，诱导培养28-35天，得到不定芽；
其中，培养条件为：温度23-27℃，湿度60-80％，光照10-12h/d，光照强度为1500-2500LX；
3)增殖培养
将步骤2)中获得的不定芽切分为单株，切去多余的基部组织以及愈伤组织，接种至增殖培养基中，培养28-35天，得到丛生芽；
其中，培养条件为：温度23-27℃，湿度60-80％，光照10-12h/d，光照强度为1500-2500LX；
4)生根培养
将步骤3)中的丛生芽切分成单株，去除不定芽、愈伤组织及老化的基部，接种于生根培养基，进行生根培养，得到生根苗；
培养条件为：温度23-27℃，湿度60-80％，光照10-12h/d，光照强度为1500-2500LX；
5)炼苗、移栽
将步骤4)中的生根苗取出，清洗，根系蘸杀菌剂，先在温室中弱光炼苗10～15天，温度20～25℃，再于自然光照下，炼苗10～20天，获得大花萱草再生植株。
进一步，步骤2)中，所述诱导培养基以MS培养基为基本培养基，添加了6-苄氨基嘌呤1-5mg/L、萘乙酸1-5mg/L、蔗糖20-40g/L、琼脂3-5g/L，pH为5.8-6.0。
又，步骤3)中，所述增殖培养基以MS培养基为基本培养基，添加了6-苄氨基嘌呤1-3mg/L、萘乙酸0.1-1mg/L、蔗糖20-40g/L、琼脂3-5g/L，pH为5.8-6.0。
优选地，步骤4)中，所述生根培养基以1/2MS培养基为基本培养基，添加了萘乙酸0.5-2mg/L、活性炭0.1-1g/L、蔗糖20-40g/L、琼脂3-5g/L，pH为5.8-6.0。
根据权利要求1所述通过诱导不定芽获得大花萱草再生植株的方法，其特征在于，步骤2)中，将经过预处理的外植体切分为2-4块。
优选地，步骤3)中，进行切分的不定芽株高在1.5-2cm。
优选地，步骤4)中，进行切分的丛生芽株高≥2cm。
优选地，步骤5)中，所述杀菌剂为五氯硝基苯可湿粉剂、多菌灵、或百菌清，炼苗、移栽过程中的基质中，泥炭：珍珠岩＝(1：1)～(7：3)，体积比。
本发明直接利用外植体诱导不定芽，建立一套稳定的大花萱草植株再生体系，获得的再生植株能够稳定保持母本优良性状，保持大花萱草品种的优良种性，克服大花萱草组培中通过愈伤组织途径后代植株出现变异的弊端，实现大花萱草组培苗的直接再生并有效进行工厂化生产。
本发明利用根茎幼芽作为外植体，其具有大量的未长出的隐芽，外植体从母本上切割下来后，放入添加一定激素的诱导培养基中，在激素的作用下，刺激隐芽萌发，形成大量的不定芽。
本发明的诱导培养基、增殖培养基、生根培养基配方中，添加了萘乙酸(NAA)促进细胞生长、生根，诱导培养基和增殖培养基中，还添加了6-苄氨基嘌呤(6-BA)，促进细胞分裂和芽组织分化，本发明诱导培养基中设置了低浓度的6-BA，与NAA配合，使幼芽在诱导过程中不产生愈伤组织，促进了不定芽的生长和增殖。
本发明在生根培养基中添加了0.1-1g/L的活性炭，可提供生根的暗环境，防止褐变，利于生根，有利于提高培养体内可溶性蛋白和总糖的含量，能吸附分泌物等不利生根的物质。在大花萱草生根培养的过程中发现，NAA浓度不变，平均根长随着活性炭的增加成递增趋势。炼苗前，生根苗的根系蘸杀菌剂，预防移栽后根部发霉腐烂，提高移栽成活率。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1)本发明以大花萱草根茎幼芽作为外植体材料，直接诱导产生不定芽，一个月后可以获得保持母本优良特性的再生植株，克服了以往利用花茎、子房、花瓣、花托、花丝、花蕾、叶片、为外植体材料诱导愈伤再分化植株时，后代出现变异等问题。
2)利用本发明的大花萱草不定芽再生植株技术，可在试管内经诱导获得丛生芽，诱导率高，可达560％，诱导时间短，可缩短至35天左右，诱导出丛生芽后，经快速增殖生根，生根率可达100％，移栽成活率可达100％，省去了以往诱导出愈伤组织后，经过再分化得到丛生芽的过程，大幅缩短了繁育周期，加快了繁育进程，使从外植体接种到移栽成活的整个组培过程，从现有技术的5-6个月，缩短到本发明的3-4个月，可实现工厂化高效繁育，为加速大花萱草的生产推广奠定了基础。
附图说明
图1为本发明实施例1中的大花萱草丛生芽。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1诱导不定芽获得大花萱草再生植株的方法，包括以下步骤：
1)选取外植体、预处理
选取长度在1-2㎝、尚未出土的大花萱草的根茎幼芽作为外植体，洗净泥土，切去所有的根系，剥除最外层2-3层叶片，用洗洁精清洗浸泡20min左右，流水下冲洗2～3h。在超净工作台上，先用75％的酒精对外植体处理30s，无菌水冲洗3遍，无菌滤纸擦干；再用0.1％的升汞溶液灭菌10～12min，无菌水浸洗5次，每次1-2min；然后用无菌滤纸吸干外植体表面的水分，切去基部最外层组织，待用。
2)诱导不定芽
将经过预处理的外植体，将其等分成3小块，接种在接种在诱导培养基上诱导培养35天，直接诱导出不定芽，诱导率达560％。
诱导培养条件为：培养条件为温度25℃，湿度70％，光照12h/d，光照强度为2000LX。
该诱导培养基为：MS+6-BA 3.0mg/L+NAA 2.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂4g/L(pH5.8)。
3)增殖培养
选取分化良好、生长基本一致并且株高在2cm左右的不定芽，将其单株分开，切去多余的基部组织以及愈伤组织，然后垂直接种于增殖培养基，得到丛生芽(参见图1)，增殖系数3.47，由图1可见，该丛生芽浓绿色，生长健壮。
培养条件为：25℃，湿度70％，光照12h/d，光照强度为2000LX。
所述增殖培养基为：MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂4g/L(pH5.8)。
4)生根培养
选取分化良好、大小均匀(株高≥2cm)的丛生芽，切分成单株，切去多余的底盘和所有的不定芽及愈伤组织，垂直接种于生根培养基，获得生根试管苗；生根率可达100％，根系乳白色，细软，富有弹性。
生根培养条件为：25℃，湿度70％，光照10h/d，光照强度为2000LX。
所述生根培养基为：1/2MS+NAA 1.0mg/L+AC 2.0g/L+蔗糖30g/L+琼脂4g/L(pH5.8)。
5)炼苗、移栽
将生根试管苗从瓶子培养瓶里取出，洗净根系上的琼脂，根系蘸取少量五氯硝基苯可湿粉剂，移栽至32孔穴盘的基质中炼苗，基质为泥炭：珍珠岩＝7：3，体积比，温室弱光炼苗10～15天，温度20～25℃，再于自然光照下，炼苗10～20天，成活率100％。获得大花萱草穴盘苗，小苗颜色浓绿，生长健壮。
实施例2工厂化大花萱草繁育方法，包括以下步骤：
1)选取外植体、预处理
选取长度在1-2㎝、尚未出土的大花萱草根茎幼芽作为外植体，洗净泥土，切去所有的根系，剥除最外层2-3层叶片，用洗洁精清洗浸泡20min左右，流水下冲洗2～3h。在超净工作台上，先用75％的酒精对外植体处理30s，无菌水冲洗3遍，无菌滤纸擦干；再用0.1％的升汞溶液灭菌10～12min，无菌水浸洗5次，每次1-2min；然后用无菌滤纸吸干外植体表面的水分，切去基部最外层组织，待用。
2)诱导不定芽
将经过预处理的外植体，将其等分成2小块，接种在接种在诱导培养基上诱导培养30天，直接诱导出不定芽，诱导率可达500％。
诱导培养条件为：培养条件为温度25℃，湿度70％，光照12h/d，光照强度为2000LX。
该诱导培养基为：MS+6-BA2.0mg/L+NAA1.0mg/L+白砂糖30g/L+琼脂4g/L(pH5.8)。
3)增殖培养
选取分化良好、生长基本一致并且株高在2cm左右的不定芽，将其单株分开，切去多余的基部组织以及愈伤组织，然后垂直接种于增殖培养基，得到丛生芽；增殖系数3.2，丛生芽浓绿色，生长健壮。
培养条件为：25℃，湿度70％，光照12h/d，光照强度为2000LX。
所述增殖培养基为：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L+白砂糖30g/L+琼脂4g/L(pH5.8)。
4)生根培养
选取分化良好、大小均匀(株高≥2cm)的丛生芽，切分成单株，切去多余的底盘和所有的不定芽及愈伤组织，垂直接种于生根培养基，获得生根试管苗，生根率可达100％，根系乳白色，细软，富有弹性。
生根培养条件为：25℃，湿度70％，光照10h/d，光照强度为2000LX。
所述生根培养基为：1/2MS+NAA 0.5mg/L+AC 1.0g/L+白砂糖30g/L+琼脂4g/L(pH5.8)。
5)炼苗、移栽
将生根试管苗从瓶子培养瓶里取出，洗净根系上的琼脂，根系蘸取少量五氯硝基苯可湿粉剂，移栽在含基质的32孔穴盘中炼苗，基质为泥炭：珍珠岩＝1：1(体积比)。温室弱光炼苗10～15天，温度20～25℃，再于自然光照下，炼苗10～20天，成活率100％。获得大花萱草穴盘苗，小苗颜色浓绿，生长健壮。
Claims (9)
1.一种通过诱导不定芽获得大花萱草再生植株的方法，包括以下步骤：
1)外植体选择、预处理
选取长度为1-2cm的根茎幼芽作为外植体，去除根系及叶片，消毒，无菌水浸洗，吸干水分，除去基部老化组织；
2)诱导不定芽
将经过预处理的外植体，接种于诱导培养基中，诱导培养28-35天，得到不定芽；
其中，培养条件为：温度23-27℃，湿度60-80％，光照10-12h/d，光照强度为1500-2500LX；
3)增殖培养
将步骤2)中获得的不定芽切分为单株，切去多余的基部组织以及愈伤组织，接种至增殖培养基中，培养28-35天，得到丛生芽；
其中，培养条件为：温度23-27℃，湿度60-80％，光照10-12h/d，光照强度为1500-2500LX；
4)生根培养
将步骤3)中的丛生芽切分成单株，去除不定芽、愈伤组织及老化的基部，接种于生根培养基，进行生根培养，得到生根苗；
培养条件为：温度23-27℃，湿度60-80％，光照10-12h/d，光照强度为1500-2500LX；
5)炼苗、移栽
将步骤4)中的生根苗取出，清洗，根系蘸杀菌剂，先在温室中弱光炼苗10～15天，温度20～25℃，再于自然光照下，炼苗10～20天，获得大花萱草再生植株。
2.根据权利要求1所述通过诱导不定芽获得大花萱草再生植株的方法，其特征在于，步骤2)中，所述诱导培养基以MS培养基为基本培养基，添加了6-苄氨基嘌呤1-5mg/L、萘乙酸1-5mg/L、蔗糖20-40g/L、琼脂3-5g/L，pH为5.8-6.0。
3.根据权利要求1或2所述通过诱导不定芽获得大花萱草再生植株的方法，其特征在于，步骤3)中，所述增殖培养基以MS培养基为基本培养基，添加了6-苄氨基嘌呤1-3mg/L、萘乙酸0.1-1mg/L、蔗糖20-40g/L、琼脂3-5g/L，pH为5.8-6.0。
4.根据权利要求1-3任一项所述通过诱导不定芽获得大花萱草再生植株的方法，其特征在于，步骤4)中，所述生根培养基以1/2MS培养基为基本培养基，添加了萘乙酸0.5-2mg/L、活性炭0.1-1g/L、蔗糖20-40g/L、琼脂3-5g/L，pH为5.8-6.0。
5.根据权利要求1所述通过诱导不定芽获得大花萱草再生植株的方法，其特征在于，步骤2)中，将经过预处理的外植体切分为2-4块。
6.根据权利要求1所述通过诱导不定芽获得大花萱草再生植株的方法，其特征在于，步骤3)中，进行切分的不定芽株高在1.5-2cm。
7.根据权利要求1所述通过诱导不定芽获得大花萱草再生植株的方法，其特征在于，步骤4)中，进行切分的丛生芽株高≥2cm。
8.根据权利要求1所述通过诱导不定芽获得大花萱草再生植株的方法，其特征在于，所述步骤5)炼苗、移栽过程的基质中，泥炭：珍珠岩＝(1：1)～(7：3)，体积比。
9.根据权利要求1所述通过诱导不定芽获得大花萱草再生植株的方法，其特征在于，步骤5)中，所述杀菌剂为五氯硝基苯可湿粉剂、多菌灵、或百菌清。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20190507 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |